Mycoplasma hyopneumoniae (MH) é uma das menores bactérias encontradas na natureza, apresentando genoma altamente reduzido e ausência de parede celular. Este organismo é o agente causador da pneumonia enzoótica suína, a qual apresenta distribuição mundial causando importantes perdas econômicas. Recentemente, várias espécies de Mycoplasma tiveram seus genomas completamente seqüenciados, incluindo três cepas de MH. Apesar da grande quantidade de dados gerados, pouco se sabe sobre as seqüências nucleotídicas que controlam o início da transcrição nestes microrganismos. Assim como em outras espécies deste gênero, M. hyopneumoniae não possui vários mecanismos que regulam a expressão gênica, incluindo o sistema de dois componentes e diversos fatores σ. Portanto, aparentemente, os sinais que promovem e regulam a transcrição, nestes organismos, devem diferir significativamente de outras bactérias. Além disso, o baixo conteúdo de GC e a falta de promotores experimentalmente caracterizados, também são fatores que dificultam o reconhecimento de seqüências controladoras. Para possibilitar a identificação das seqüências promotoras de MH in vitro, através da utilização da RNA polimerase holoenzima reconstituída, este trabalho tem como objetivo purificar o fator σ através da expressão heteróloga do gene rpoD de M. hyopneumoniae cepa 7448. Como esta CDS possui três códons de parada UGA – os quais codificam triptofano nos micoplasmas –, foi utilizado uma técnica baseada em PCR para introduzir as mutações (TGA→TGG) necessárias. A metodologia de mutagênese sítio-dirigida, empregada neste trabalho, apresentou eficiência relativamente boa na substituição dos nucleotídeos alvo. O gene íntegro e mutado foi subclonado no vetor pET23a-d(+) e expresso em Escherichia coli. De acordo com o fato de que os fatores σ exibem menor mobilidade em SDS-PAGE, a proteína expressa apresentou uma massa molecular aparente de 64 kDa, diferente dos 58 kDa deduzidos a partir da seqüência nucleotídica. Ainda, nas condições utilizadas, maior quantidade da proteína foi produzida de forma insolúvel. Para obtenção de um fator σ recombinante funcional, diferentes protocolos de expressão, solubilização e purificação serão testados. / Mycoplasma hyopneumoniae (MH) is one of the smallest bacteria found in nature, presenting a small genome and no cell wall. It is present in the majority of swine herds throughout the world, and is considered an important pathogen in the swine industry. Recently, many species of this genus had their genome completely sequenced, including three strains of MH. Nevertheless, very little is understood of the nucleotide sequences that control transcription initiation in these microorganisms. Like its relatives, M. hyopneumoniae lacks several major regulators of gene expression, including two component regulatory systems and multiple σ factors, thus it appears that the signals for promotion and regulation of transcription may differ significantly from other bacteria. In addition, the low GC content and the dearth of experimentally characterized promoters in this genus severely limit the recognition of the controlling sequences. To enable in vitro identification of the MH promoter sequences, the aim of this study is to purify the σ factor through the heterologous expression of the rpoD gene from the M. hyopneumoniae strain 7448, that will allow reconstituting RNA polymerase holoenzyme. As this CDS has three UGA stop codons – which encode tryptophan in mycoplasma –, a PCR-based method to introduce the necessary mutations (TGA→TGG) was used. The site-direct mutagenesis methodology, employed in this work, showed a relative good efficiency to substitute the targets nucleotides. The full length mutated gene was subcloned into pET23a-d(+) vector and expressed in fusion with a C-terminal polihistidine tag. In agreement with the fact that σ factors show slower mobility on SDS-PAGE, the expressed protein exhibited an apparent molecular mass of 64 kDa in despite of the 58 kDa that was deduced from the nucleotide sequence. However, most of the protein was insoluble under the conditions used. Therefore, to obtain a functional recombinante σ factor, different protocols related to the expression, solubilization, and purification will be tested.

Mycoplasma hyopneumoniae é um importante patógeno suíno, sendo o agente da pneumonia enzoótica suína. Recentemente, o genoma de três cepas (J, 7448 e 232) de M. hyopneumoniae foi seqüenciado. Inicialmente, realizamos uma análise proteômica baseada em eletroforese bidimensional (2DE), estudos imunológicos e espectrometria de massas para a cepa patogênica 7448 de M. hyopneumoniae. Foram produzidos mapas proteômicos em duas faixas de pH (3-10 e 4-7). Um total de 31 produtos gênicos foram experimentalmente verificados. Em uma análise imunológica foi possível identificar pelo menos cinco proteínas antigênicas de M. hyopneumoniae. Seguindo este primeiro estudo prospectivo da cepa 7448, foi realizada uma análise proteômica comparativa de três cepas de M. hyopneumoniae, uma não-patogênica (J) e duas cepas patogênicas (7448 e 7422). Na comparação por 2DE foi possível identificar diferenças no nível de expressão entre as cepas em pelo menos 67 spots protéicos. Para uma análise mais ampla dos perfis protéicos das três cepas foi utilizada uma estratégia baseada em LC-MS/MS. Nas três cepas, 231 proteínas foram identificadas, correspondendo a cerca de 35% da capacidade codificadora do genoma de M. hyopneumoniae. A classificação funcional das proteínas identificadas sugere diferenças fisiológicas entres as cepas não-patogênicas e patogênicas. A aplicação de uma proteômica quantitativa label-free (o exponentially modified protein abundance index) demonstrou diferenças significativas nos níveis de expressão de pelo menos 64 proteínas. Por fim, uma análise imunológica baseada em 2DE utilizando um anticorpo monoclonal contra a repetição R1 da proteína P97, foi capaz de identificar um padrão de clivagem proteolítica diferencial entre as três cepas de M. hyopneumoniae. / Mycoplasma hyopneumoniae is an important pathogen for pigs, being the causative agent of enzootic pneumonia. Recently, the genome sequences of three strains, J, 7448 and 232 have been reported. Here, we describe the results of a proteomic analysis, based on two-dimensional gel electrophoresis of soluble protein extracts, immunoblot and mass spectrometry from the M. hyopneumoniae pathogenic strain 7448. A preliminary M. hyopneumoniae proteome map in two pH ranges (3 - 10 and 4 - 7) was produced. A total of 31 different coding DNA sequences were experimentally verified. Moreover, at least five highly antigenic proteins of M. hyopneumoniae were identified by immunoblots. Following the previous report of a proteomic survey of the pathogenic 7448 strain, we performed comparative protein profiling of three M. hyopneumoniae strains, namely the non-pathogenic J strain and the pathogenic strains 7448 and 7422. In 2DE comparisons, we were able to identify differences in expression levels between strains for 67 proteins. For more comprehensive protein profiling, an LC-MS/MS strategy was used. Overall, 231 different proteins were identified, corresponding to 35% of the M. hyopneumoniae genome coding capacity. The functional classification of identified proteins was suggestive of physiological differences between the non-pathogenic and the pathogenic strains. Also, application of the exponentially modified protein abundance index demonstrated significant differences in the expression levels of proteins detected in more than one strain, confirming over-expression in one or two of the strains for 64 proteins. 2DE immunoblot analyses allowed the identification of differential proteolytic cleavage patterns of the P97 adhesin in the three strains.

Mycoplasma hyopneumoniae (MH) é uma das menores bactérias encontradas na natureza, apresentando genoma altamente reduzido e ausência de parede celular. Este organismo é o agente causador da pneumonia enzoótica suína, a qual apresenta distribuição mundial causando importantes perdas econômicas. Recentemente, várias espécies de Mycoplasma tiveram seus genomas completamente seqüenciados, incluindo três cepas de MH. Apesar da grande quantidade de dados gerados, pouco se sabe sobre as seqüências nucleotídicas que controlam o início da transcrição nestes microrganismos. Assim como em outras espécies deste gênero, M. hyopneumoniae não possui vários mecanismos que regulam a expressão gênica, incluindo o sistema de dois componentes e diversos fatores σ. Portanto, aparentemente, os sinais que promovem e regulam a transcrição, nestes organismos, devem diferir significativamente de outras bactérias. Além disso, o baixo conteúdo de GC e a falta de promotores experimentalmente caracterizados, também são fatores que dificultam o reconhecimento de seqüências controladoras. Para possibilitar a identificação das seqüências promotoras de MH in vitro, através da utilização da RNA polimerase holoenzima reconstituída, este trabalho tem como objetivo purificar o fator σ através da expressão heteróloga do gene rpoD de M. hyopneumoniae cepa 7448. Como esta CDS possui três códons de parada UGA – os quais codificam triptofano nos micoplasmas –, foi utilizado uma técnica baseada em PCR para introduzir as mutações (TGA→TGG) necessárias. A metodologia de mutagênese sítio-dirigida, empregada neste trabalho, apresentou eficiência relativamente boa na substituição dos nucleotídeos alvo. O gene íntegro e mutado foi subclonado no vetor pET23a-d(+) e expresso em Escherichia coli. De acordo com o fato de que os fatores σ exibem menor mobilidade em SDS-PAGE, a proteína expressa apresentou uma massa molecular aparente de 64 kDa, diferente dos 58 kDa deduzidos a partir da seqüência nucleotídica. Ainda, nas condições utilizadas, maior quantidade da proteína foi produzida de forma insolúvel. Para obtenção de um fator σ recombinante funcional, diferentes protocolos de expressão, solubilização e purificação serão testados. / Mycoplasma hyopneumoniae (MH) is one of the smallest bacteria found in nature, presenting a small genome and no cell wall. It is present in the majority of swine herds throughout the world, and is considered an important pathogen in the swine industry. Recently, many species of this genus had their genome completely sequenced, including three strains of MH. Nevertheless, very little is understood of the nucleotide sequences that control transcription initiation in these microorganisms. Like its relatives, M. hyopneumoniae lacks several major regulators of gene expression, including two component regulatory systems and multiple σ factors, thus it appears that the signals for promotion and regulation of transcription may differ significantly from other bacteria. In addition, the low GC content and the dearth of experimentally characterized promoters in this genus severely limit the recognition of the controlling sequences. To enable in vitro identification of the MH promoter sequences, the aim of this study is to purify the σ factor through the heterologous expression of the rpoD gene from the M. hyopneumoniae strain 7448, that will allow reconstituting RNA polymerase holoenzyme. As this CDS has three UGA stop codons – which encode tryptophan in mycoplasma –, a PCR-based method to introduce the necessary mutations (TGA→TGG) was used. The site-direct mutagenesis methodology, employed in this work, showed a relative good efficiency to substitute the targets nucleotides. The full length mutated gene was subcloned into pET23a-d(+) vector and expressed in fusion with a C-terminal polihistidine tag. In agreement with the fact that σ factors show slower mobility on SDS-PAGE, the expressed protein exhibited an apparent molecular mass of 64 kDa in despite of the 58 kDa that was deduced from the nucleotide sequence. However, most of the protein was insoluble under the conditions used. Therefore, to obtain a functional recombinante σ factor, different protocols related to the expression, solubilization, and purification will be tested.

Mycoplasma hyopneumoniae é um importante patógeno suíno, sendo o agente da pneumonia enzoótica suína. Recentemente, o genoma de três cepas (J, 7448 e 232) de M. hyopneumoniae foi seqüenciado. Inicialmente, realizamos uma análise proteômica baseada em eletroforese bidimensional (2DE), estudos imunológicos e espectrometria de massas para a cepa patogênica 7448 de M. hyopneumoniae. Foram produzidos mapas proteômicos em duas faixas de pH (3-10 e 4-7). Um total de 31 produtos gênicos foram experimentalmente verificados. Em uma análise imunológica foi possível identificar pelo menos cinco proteínas antigênicas de M. hyopneumoniae. Seguindo este primeiro estudo prospectivo da cepa 7448, foi realizada uma análise proteômica comparativa de três cepas de M. hyopneumoniae, uma não-patogênica (J) e duas cepas patogênicas (7448 e 7422). Na comparação por 2DE foi possível identificar diferenças no nível de expressão entre as cepas em pelo menos 67 spots protéicos. Para uma análise mais ampla dos perfis protéicos das três cepas foi utilizada uma estratégia baseada em LC-MS/MS. Nas três cepas, 231 proteínas foram identificadas, correspondendo a cerca de 35% da capacidade codificadora do genoma de M. hyopneumoniae. A classificação funcional das proteínas identificadas sugere diferenças fisiológicas entres as cepas não-patogênicas e patogênicas. A aplicação de uma proteômica quantitativa label-free (o exponentially modified protein abundance index) demonstrou diferenças significativas nos níveis de expressão de pelo menos 64 proteínas. Por fim, uma análise imunológica baseada em 2DE utilizando um anticorpo monoclonal contra a repetição R1 da proteína P97, foi capaz de identificar um padrão de clivagem proteolítica diferencial entre as três cepas de M. hyopneumoniae. / Mycoplasma hyopneumoniae is an important pathogen for pigs, being the causative agent of enzootic pneumonia. Recently, the genome sequences of three strains, J, 7448 and 232 have been reported. Here, we describe the results of a proteomic analysis, based on two-dimensional gel electrophoresis of soluble protein extracts, immunoblot and mass spectrometry from the M. hyopneumoniae pathogenic strain 7448. A preliminary M. hyopneumoniae proteome map in two pH ranges (3 - 10 and 4 - 7) was produced. A total of 31 different coding DNA sequences were experimentally verified. Moreover, at least five highly antigenic proteins of M. hyopneumoniae were identified by immunoblots. Following the previous report of a proteomic survey of the pathogenic 7448 strain, we performed comparative protein profiling of three M. hyopneumoniae strains, namely the non-pathogenic J strain and the pathogenic strains 7448 and 7422. In 2DE comparisons, we were able to identify differences in expression levels between strains for 67 proteins. For more comprehensive protein profiling, an LC-MS/MS strategy was used. Overall, 231 different proteins were identified, corresponding to 35% of the M. hyopneumoniae genome coding capacity. The functional classification of identified proteins was suggestive of physiological differences between the non-pathogenic and the pathogenic strains. Also, application of the exponentially modified protein abundance index demonstrated significant differences in the expression levels of proteins detected in more than one strain, confirming over-expression in one or two of the strains for 64 proteins. 2DE immunoblot analyses allowed the identification of differential proteolytic cleavage patterns of the P97 adhesin in the three strains.

Mycoplasma hyopneumoniae é a bactéria causadora da pneumonia micoplásmica suína, que afeta o rebanho suíno em nível mundial. Durante o processo de infecção, o sistema imune de organismos afetados produz espécies reativas de oxigênio (ERO), conhecidas por causarem uma variedade de lesões celulares, como uma das estratégias para neutralização do patógeno. Embora a presença de enzimas antioxidantes clássicas seja esperada em M. hyopneumoniae, genes importantes relacionados à proteção contra ERO como superóxido-dismutase, catalases e glutationa-peroxidase não foram identificados por homologia na anotação de seqüências genômicas. Entre os poucos genes de M. hyopneumoniae codificando proteínas possivelmente envolvidas na supressão da resposta do hospedeiro através da produção de ERO, foi identificado um codificando uma peroxirredoxina. Análises de seqüência e filogenéticas mostram que a peroxirredoxina de M. hyopneumoniae (MhPrx) está relacionada com a subfamília das peroxirredoxinas 2-Cys atípica, embora ela tenha apenas uma cisteína em sua seqüência. A seqüência de DNA codificadora (CDS) da MhPrx foi clonada e expressa em Escherichia coli para a produção de uma MhPrx recombinante (rMhPrx), a qual foi purificada e usada para a imunização de camundongos para produzir um anti-soro policlonal anti-MhPx. Este anti-soro foi utilizado para investigar extratos protéicos de M. hyopneumoniae e demonstrou a expressão de MhPrx nas três cepas testas (J, 7422 e 7448). A atividade da rMhPrx foi determinada com uso de um sistema de oxidação catalisado por metais, que mostrou que esta enzima pode proteger moléculas de DNA do dano causado por ERO e deve ter uma função essencial durante a infecção. / Mycoplasma hyopneumoniae is the causative agent of the porcine enzootic pneumonia, which affects swineherds worldwide causing heavy economical losses. In the infection process, the host generates reactive oxygen species (ROS) as one of the strategies used to neutralize the pathogen. Although the presence of classical antioxidant enzymes would be expected in M. hyopneumoniae, important genes directly related to protection against ROS, like superoxide-dismutase, catalases and glutathione-peroxidase were not identified by sequence homology in the genome sequence annotation. Among the few identified M. hyopneumoniae genes coding for proteins possibly involved with suppression of the host ROS-mediated response, one coding for a peroxiredoxin was recognized. Sequence and phylogenetic analysis indicate that M. hyopneumoniae peroxiredoxin (MhPrx) is closely related to the atypical 2-Cys peroxiredoxin subfamily, although it has only one cysteine in its sequence. The MhPrx coding DNA sequence was cloned and expressed in Escherichia coli to produce a recombinant MhPrx (rMhPrx), which was purified and used to immunize mice and produce an anti-MhPrx polyclonal antiserum. This antiserum was used to probe M. hyopneumoniae extracts and demonstrated that MhPrx is expressed in all three tested strains (J, 7422 and 7448). A metal catalyzed oxidation system was used to assay the activity of rMhPrx, showing that it can protect DNA from ROSmediated damage and may play an essential role during infection.

Mycoplasma hyopneumoniae é a bactéria causadora da pneumonia micoplásmica suína, que afeta o rebanho suíno em nível mundial. Durante o processo de infecção, o sistema imune de organismos afetados produz espécies reativas de oxigênio (ERO), conhecidas por causarem uma variedade de lesões celulares, como uma das estratégias para neutralização do patógeno. Embora a presença de enzimas antioxidantes clássicas seja esperada em M. hyopneumoniae, genes importantes relacionados à proteção contra ERO como superóxido-dismutase, catalases e glutationa-peroxidase não foram identificados por homologia na anotação de seqüências genômicas. Entre os poucos genes de M. hyopneumoniae codificando proteínas possivelmente envolvidas na supressão da resposta do hospedeiro através da produção de ERO, foi identificado um codificando uma peroxirredoxina. Análises de seqüência e filogenéticas mostram que a peroxirredoxina de M. hyopneumoniae (MhPrx) está relacionada com a subfamília das peroxirredoxinas 2-Cys atípica, embora ela tenha apenas uma cisteína em sua seqüência. A seqüência de DNA codificadora (CDS) da MhPrx foi clonada e expressa em Escherichia coli para a produção de uma MhPrx recombinante (rMhPrx), a qual foi purificada e usada para a imunização de camundongos para produzir um anti-soro policlonal anti-MhPx. Este anti-soro foi utilizado para investigar extratos protéicos de M. hyopneumoniae e demonstrou a expressão de MhPrx nas três cepas testas (J, 7422 e 7448). A atividade da rMhPrx foi determinada com uso de um sistema de oxidação catalisado por metais, que mostrou que esta enzima pode proteger moléculas de DNA do dano causado por ERO e deve ter uma função essencial durante a infecção. / Mycoplasma hyopneumoniae is the causative agent of the porcine enzootic pneumonia, which affects swineherds worldwide causing heavy economical losses. In the infection process, the host generates reactive oxygen species (ROS) as one of the strategies used to neutralize the pathogen. Although the presence of classical antioxidant enzymes would be expected in M. hyopneumoniae, important genes directly related to protection against ROS, like superoxide-dismutase, catalases and glutathione-peroxidase were not identified by sequence homology in the genome sequence annotation. Among the few identified M. hyopneumoniae genes coding for proteins possibly involved with suppression of the host ROS-mediated response, one coding for a peroxiredoxin was recognized. Sequence and phylogenetic analysis indicate that M. hyopneumoniae peroxiredoxin (MhPrx) is closely related to the atypical 2-Cys peroxiredoxin subfamily, although it has only one cysteine in its sequence. The MhPrx coding DNA sequence was cloned and expressed in Escherichia coli to produce a recombinant MhPrx (rMhPrx), which was purified and used to immunize mice and produce an anti-MhPrx polyclonal antiserum. This antiserum was used to probe M. hyopneumoniae extracts and demonstrated that MhPrx is expressed in all three tested strains (J, 7422 and 7448). A metal catalyzed oxidation system was used to assay the activity of rMhPrx, showing that it can protect DNA from ROSmediated damage and may play an essential role during infection.

Mycoplasma hyopneumoniae (MH) é uma das menores bactérias encontradas na natureza, apresentando genoma altamente reduzido e ausência de parede celular. Este organismo é o agente causador da pneumonia enzoótica suína, a qual apresenta distribuição mundial causando importantes perdas econômicas. Recentemente, várias espécies de Mycoplasma tiveram seus genomas completamente seqüenciados, incluindo três cepas de MH. Apesar da grande quantidade de dados gerados, pouco se sabe sobre as seqüências nucleotídicas que controlam o início da transcrição nestes microrganismos. Assim como em outras espécies deste gênero, M. hyopneumoniae não possui vários mecanismos que regulam a expressão gênica, incluindo o sistema de dois componentes e diversos fatores σ. Portanto, aparentemente, os sinais que promovem e regulam a transcrição, nestes organismos, devem diferir significativamente de outras bactérias. Além disso, o baixo conteúdo de GC e a falta de promotores experimentalmente caracterizados, também são fatores que dificultam o reconhecimento de seqüências controladoras. Para possibilitar a identificação das seqüências promotoras de MH in vitro, através da utilização da RNA polimerase holoenzima reconstituída, este trabalho tem como objetivo purificar o fator σ através da expressão heteróloga do gene rpoD de M. hyopneumoniae cepa 7448. Como esta CDS possui três códons de parada UGA – os quais codificam triptofano nos micoplasmas –, foi utilizado uma técnica baseada em PCR para introduzir as mutações (TGA→TGG) necessárias. A metodologia de mutagênese sítio-dirigida, empregada neste trabalho, apresentou eficiência relativamente boa na substituição dos nucleotídeos alvo. O gene íntegro e mutado foi subclonado no vetor pET23a-d(+) e expresso em Escherichia coli. De acordo com o fato de que os fatores σ exibem menor mobilidade em SDS-PAGE, a proteína expressa apresentou uma massa molecular aparente de 64 kDa, diferente dos 58 kDa deduzidos a partir da seqüência nucleotídica. Ainda, nas condições utilizadas, maior quantidade da proteína foi produzida de forma insolúvel. Para obtenção de um fator σ recombinante funcional, diferentes protocolos de expressão, solubilização e purificação serão testados. / Mycoplasma hyopneumoniae (MH) is one of the smallest bacteria found in nature, presenting a small genome and no cell wall. It is present in the majority of swine herds throughout the world, and is considered an important pathogen in the swine industry. Recently, many species of this genus had their genome completely sequenced, including three strains of MH. Nevertheless, very little is understood of the nucleotide sequences that control transcription initiation in these microorganisms. Like its relatives, M. hyopneumoniae lacks several major regulators of gene expression, including two component regulatory systems and multiple σ factors, thus it appears that the signals for promotion and regulation of transcription may differ significantly from other bacteria. In addition, the low GC content and the dearth of experimentally characterized promoters in this genus severely limit the recognition of the controlling sequences. To enable in vitro identification of the MH promoter sequences, the aim of this study is to purify the σ factor through the heterologous expression of the rpoD gene from the M. hyopneumoniae strain 7448, that will allow reconstituting RNA polymerase holoenzyme. As this CDS has three UGA stop codons – which encode tryptophan in mycoplasma –, a PCR-based method to introduce the necessary mutations (TGA→TGG) was used. The site-direct mutagenesis methodology, employed in this work, showed a relative good efficiency to substitute the targets nucleotides. The full length mutated gene was subcloned into pET23a-d(+) vector and expressed in fusion with a C-terminal polihistidine tag. In agreement with the fact that σ factors show slower mobility on SDS-PAGE, the expressed protein exhibited an apparent molecular mass of 64 kDa in despite of the 58 kDa that was deduced from the nucleotide sequence. However, most of the protein was insoluble under the conditions used. Therefore, to obtain a functional recombinante σ factor, different protocols related to the expression, solubilization, and purification will be tested.

Mycoplasma hyopneumoniae é um importante patógeno suíno, sendo o agente da pneumonia enzoótica suína. Recentemente, o genoma de três cepas (J, 7448 e 232) de M. hyopneumoniae foi seqüenciado. Inicialmente, realizamos uma análise proteômica baseada em eletroforese bidimensional (2DE), estudos imunológicos e espectrometria de massas para a cepa patogênica 7448 de M. hyopneumoniae. Foram produzidos mapas proteômicos em duas faixas de pH (3-10 e 4-7). Um total de 31 produtos gênicos foram experimentalmente verificados. Em uma análise imunológica foi possível identificar pelo menos cinco proteínas antigênicas de M. hyopneumoniae. Seguindo este primeiro estudo prospectivo da cepa 7448, foi realizada uma análise proteômica comparativa de três cepas de M. hyopneumoniae, uma não-patogênica (J) e duas cepas patogênicas (7448 e 7422). Na comparação por 2DE foi possível identificar diferenças no nível de expressão entre as cepas em pelo menos 67 spots protéicos. Para uma análise mais ampla dos perfis protéicos das três cepas foi utilizada uma estratégia baseada em LC-MS/MS. Nas três cepas, 231 proteínas foram identificadas, correspondendo a cerca de 35% da capacidade codificadora do genoma de M. hyopneumoniae. A classificação funcional das proteínas identificadas sugere diferenças fisiológicas entres as cepas não-patogênicas e patogênicas. A aplicação de uma proteômica quantitativa label-free (o exponentially modified protein abundance index) demonstrou diferenças significativas nos níveis de expressão de pelo menos 64 proteínas. Por fim, uma análise imunológica baseada em 2DE utilizando um anticorpo monoclonal contra a repetição R1 da proteína P97, foi capaz de identificar um padrão de clivagem proteolítica diferencial entre as três cepas de M. hyopneumoniae. / Mycoplasma hyopneumoniae is an important pathogen for pigs, being the causative agent of enzootic pneumonia. Recently, the genome sequences of three strains, J, 7448 and 232 have been reported. Here, we describe the results of a proteomic analysis, based on two-dimensional gel electrophoresis of soluble protein extracts, immunoblot and mass spectrometry from the M. hyopneumoniae pathogenic strain 7448. A preliminary M. hyopneumoniae proteome map in two pH ranges (3 - 10 and 4 - 7) was produced. A total of 31 different coding DNA sequences were experimentally verified. Moreover, at least five highly antigenic proteins of M. hyopneumoniae were identified by immunoblots. Following the previous report of a proteomic survey of the pathogenic 7448 strain, we performed comparative protein profiling of three M. hyopneumoniae strains, namely the non-pathogenic J strain and the pathogenic strains 7448 and 7422. In 2DE comparisons, we were able to identify differences in expression levels between strains for 67 proteins. For more comprehensive protein profiling, an LC-MS/MS strategy was used. Overall, 231 different proteins were identified, corresponding to 35% of the M. hyopneumoniae genome coding capacity. The functional classification of identified proteins was suggestive of physiological differences between the non-pathogenic and the pathogenic strains. Also, application of the exponentially modified protein abundance index demonstrated significant differences in the expression levels of proteins detected in more than one strain, confirming over-expression in one or two of the strains for 64 proteins. 2DE immunoblot analyses allowed the identification of differential proteolytic cleavage patterns of the P97 adhesin in the three strains.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La contaminación de los cultivos celulares por Mycoplasma spp. dificulta tanto la investigación básica como el desarrollo y producción de productos biológicos. Los efectos de esta bacteria en las células cultivadas son cambios en el metabolismo, propiedades inmunológicas y bioquímicas, crecimiento, viabilidad, etc. La infección de cultivos celulares con Mycoplasma spp. puede no ser detectada por inspección visual o microscopía común, por lo tanto, es importante realizar evaluaciones periódicas de rutina con un método rápido, altamente sensible y específico. En consideración a lo anterior, esta memoria de título se basó en el diagnóstico molecular de Mycoplasma spp., mediante la detección del gen 16S rRNA utilizando la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa convencional, en muestras procedentes de cultivos celulares de distintos laboratorios de la Universidad de Chile y del Instituto de Salud Pública de Chile. Los resultados obtenidos tanto en los controles positivos como en los controles negativos, permitieron validar este método en la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias y al aplicarlo en muestras sospechosas, se logró la detección positiva en una muestra procedente del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Chile. Este hallazgo, fue confirmado por alineamiento de secuencias nucleotídicas respecto de datos oficiales del GenBank®, utilizando los programas Clustal W y BLAST, ambos de acceso gratuito on line que entregaron un 97% de porcentaje de identidad nucleotídica respecto de Mycoplasma spp

Mycoplasma gallisepticum (MG) is a major and economically significant pathogen of avian species. Different strains of MG have been used as vaccines in multiple-age commercial layer farms in an effort to protect the birds against more virulent field strains. The lower level of protection afforded by the low virulent MG strain vaccines provides an opportunity to the use of an overlay (revaccination) with an F-strain M. gallisepticum (FMG) later in their production cycles. In the present study, three trials were conducted to investigate the effects of prelay vaccinations of ts-11 strain MG, MG-Bacterin, or their combination, in conjunction with a FMG overlay after peak production in commercial layers. The following treatments were utilized at 10 wk of age (woa): 1) Control (no vaccinations); 2) ts-11 MG vaccine; 3) MG-Bacterin vaccine; and 4) ts-11 MG and MG-Bacterin combination. At 45 woa, all the birds in trial 1 and half of the birds in each treatment group in trials 2 and 3 were overlaid with an FMG vaccine. Various parameters including performance, internal egg and eggshell quality, blood, and visceral characteristics of the birds were evaluated. In this study, the ts-11 MG vaccination at 10 woa was shown to increase shell weight and the yolk lipid content of the eggs laid by the birds without affecting their performance. On the other hand, a prelay vaccination with MG-Bacterin did not prevent a drop in egg production in response to an overlay with FMG at 45 woa. A decrease in proportional infundibulum length in the control birds and MG-Bacterin vaccinated birds after being overlaid with FMG might be the underlying factor responsible for the observed decrease in egg production. Nevertheless, the prelay use of MG-Bacterin together with ts-11 MG didn’t appear to provide any additional benefit over the ts-11 MG vaccine alone on any of the parameters investigated. In conclusion, these results establish the potentially effective prelay use of the ts-11 MG vaccine in combination with an FMG overlay for the provision of continual protection against field strain MG infections, without eliciting any subsequent suppressive effects on the performance of commercial layers.