Os ratos Wistar são amplamente empregados como modelo animal na pesquisa biomédica e o controle sanitário dos biotérios é essencial para garantir a qualidade dos experimentos. O objetivo do estudo foi a caracterização do estado sanitário da colônia de ratos Wistar em sistema de criação convencional e para tanto determinar as bactérias, fungos, virus e parasitos, bem como caracterizar as lesões anatomopatológicas do sistema respiratório. Foram utilizados 273 ratos (N), machos (M) e fêmeas (F), das faixas etárias 4, 8, 12, 16 a 20 semanas e entre 12 a 18 meses, para as determinações de peso e condição corpórea (N=273, 140M, 133F); avaliação bacteriológica de orofaringe, mucosa intestinal e lavado traqueobrônquico (N=40, 20M, 20F); determinação de anticorpos para vírus e bactérias (N=20, 10M, 10F); exame parasitológico (N=60, 30M, 30F); identificação molecular de Mycoplasma pulmonis em amostras de pulmão (N=25, 15M, 10F), e caracterização anatomopatológica da cavidade nasal, orofaringe, laringe, traqueia e pulmão (N=106, 53M, 53F). Foram realizadas ainda avaliações microbiológicas das salas dos ratos em três períodos com isolamento de Micrococcus spp., Staphylococcus spp., Bacillus spp., Aspergillus spp. e Penicillium spp. O peso se mostrou homogêneo dentro da faixa etária e gênero, com apenas sete animais magros (2,56%) e nove em sobrepeso (3,30%). Não foram isoladas bactérias patogênicas na orofaringe, mucosa intestinal e lavado traqueobrônquico por cultivo. Mycoplasma pulmonis foi determinado em 72% das amostras pulmonares e em 100% dos soros testados. Em 35% foram detectados anticorpos para Reovirus tipo III e em 100% para bacilos associados ao epitélio respiratório ciliado. Syphacia muris foi diagnosticada em 91,67%, Eimeria spp. em 3,33% e Entamoeba muris em 1,67%. Lesões relacionadas a infecção por agentes exógenos foram observadas em cavidade nasal e na orofaringe, laringe e traqueia a partir da 4 semanas de idade e, em pulmão desde as 12 semanas, com aumento de frequência de ocorrência e do grau de progressão, com o avançar da idade, nos vários segmentos estudados. Concluímos que a caracterização do estado sanitário dos ratos permite conhecer as particularidades do modelo biológico utilizado e compor base de dados para auxiliar no desenho e na interpretação experimental dos pesquisadores, além de garantir uma base para o programa de monitorização sanitária de biotérios em condições similares / The Wistar rats are widely used as an animal model in biomedical research and the health monitoring of animal facilities is essential to ensure the experiments quality. The aim of this study was to characterize the Wistar rats colony’s health status in a conventional breeding facility, to determine both bacteria, fungi, viruses and parasites, as well as characterize the anatomopathological lesions of the respiratory system. 273 rats (N) were used, males (M) and females (F), ages 4, 8, 12, 16 and 20 weeks, and between 12 to 18 months, for weight and body condition determination (N=273, 140M,133F); bacteriological evaluation of the oropharynx, intestinal mucosa and tracheobronchial lavage (N=40, 20M, 20F); antibodies to viruses and bacteria determination (10M, 10F); parasite examination (N=60, 30M, 30F); molecular identification of Mycoplasma pulmonis in lung samples (N=25, 15M, 10F) and histopathological characterization of the nasal cavity, oropharynx, larynx, trachea and lung (N=106, 53M, 53F). Microbiological evaluations of the rats rooms were made in three periods with isolation of Micrococcus spp., Staphylococcus spp., Bacillus spp., Aspergillus spp. and Penicillium spp. Weight proved to be homogeneous within age and gender, with only seven lean animals (2.56%) and nine overweight (3.30%). Pathogenic bacteria weren’t isolated by cultivation in the oropharynx, intestinal mucosa and tracheobronchial lavage. Mycoplasma pulmonis was determined in 72% of lung samples and in 100% of tested serum. In 35% antibodies were detected to Reovirus type III and 100% for cilia-associated respiratory bacillus. Syphacia muris was diagnosed in 91.67%, Eimeria spp. in 3.33%, and Entamoeba muris in 1.67%. Lesions related to infection by exogenous agents were observed in the nasal cavity and oropharynx, larynx and trachea from the 4 weeks of age, and lungs from 12 weeks, with an increase of occurrence frequency and degree of progression, with advancing age, in the various studied segments. We conclude that the characterization of rats health status allows us to know the particularities of the animal model used, and compose a database to assist in the design and experimental interpretation of researchers, as well as ensure a basis for the health monitoring program of breeding and research facilities in similar conditions

Mycoplasma haemofelis, Candidatus Mycoplasma haemominutum and Candidatus Mycoplasma turicensis are the causative agents of feline mycoplasmosis, these agents are gram-negative, pleomorphic, small and that adhere to the surface of erythrocytes of the animal involved. Clinical signs of feline mycoplasmosis are manifestations of acute or chronic anemia, occurring weight loss, anorexia, depression, pale mucous membranes, weakness, joint pain, soreness and occasionally splenomegaly and jaundice, the animal may come to death in severe cases. The diagnosis is based on detection of the parasite in blood smears and also in molecular diagnostics using PCR. Aiming to determine the occurrence of Mycoplasma spp. in domestic cats in a region of Belém, Pará, and hematological changes of animals naturally infected by these parasites were collected 201 blood samples with EDTA for Count Blood Cells (CBC) analysis and extraction of DNA for performing the Polymerase Chain Reaction (PCR) as well as blood smears ear tip for detection of the parasite on the surface of erythrocyte. Found 5.47% (11/201) of positive examination of blood smears, being 1.47% (1/68) of males and 7.51% (10/133) than females. The DNA of Candidatus Mycoplasma haemominutum was found in 7.96% (16/201) where 16.17 % (11/68) were males and 3.75% (5/133) females, was detected Mycoplasma haemofelis in 1.49% (3/201) of samples totaling 2.94% (2/68) of males and 0.75% (1/133) of females. The CBC showed changes in erythrocytes, hematocrit and hemoglobin only in those animals with DNA of Mycoplasma haemofelis. / Mycoplasma haemofelis, Candidatus Mycoplasma haemominutum e Candidatus Mycoplasma turicensis são os agentes causadores da micoplasmose felina, estes agentes são bactérias gram-negativas, pleomórficas, pequenas e que se aderem à superfície dos eritrócitos do animal acometido. Os sinais clínicos da micoplasmose felina são manifestações de anemia aguda ou crônica, ocorrendo perda de peso, anorexia, depressão, membranas mucosas pálidas, fraqueza, dores articulares, hiperestesia e, ocasionalmente esplenomegalia e icterícia, podendo o animal vir a óbito nos casos mais graves. O diagnóstico é baseado na detecção do parasita em esfregaços sanguíneos e também no diagnóstico molecular pela PCR. Objetivando determinar a ocorrência de Mycoplasma spp. em felinos domésticos da região de Belém-Pará, e as alterações hematológicas dos animais naturalmente infectados por estes parasitos, foram coletadas 201 amostras de sangue com EDTA para análise de hemograma e extração de DNA para realização de Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) bem como esfregaços sanguíneos de ponta de orelha para detecção do parasita na superfície do eritrócito. Foram encontrados 5,47% (11/201) de positividade no exame de esfregaço sanguíneo, sendo 1,47% (1/68) de machos e 7,51% (10/133) de fêmeas. O DNA de Candidatus Mycoplasma haemominutum foi encontrado em 7,96% (16/201) dos animais onde 16,17% (11/68) eram machos e 3,75% (5/133) eram fêmeas, já Mycoplasma haemofelis foi detectado em 1,49% (3/201) das amostras, totalizando 2,94% (2/68) de machos e 0,75% (1/133) de fêmeas. O hemograma mostrou alterações em eritrócitos, volume globular e hemoglobina apenas nos animais em que foi detectado DNA de Mycoplasma haemofelis.

Mycoplasma hyopneumoniae is the causative agent of the respiratory disease Swine Enzootic Pneumonia, a mild chronic lower respiratory tract infection that affects pig populations world wide. The disease causes decreased growth rates and poor feed conversion in infected pigs and results in significant economic losses. While several swine enzootic pneumonia vaccines arc available, none are totally effective. These current vaccines are based on bacterins or cell fractions. As yet, no commercial vaccines composed of recombinant subunits are available. Prior to the commencement of this study, three candidate vaccinc antigens had been identified in this laboratory, from the Australian M. hyopneumoniae field isolate Beaufort. The three proteins (48 kDa, 52 kDa and 74 kDa) reacted with antibody secreting cell probes, derived from hyper-immune swine lung tissue, indicating they are important in the local antibody response to M. hyopneumoniae infection. (For complete abstract open document)

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-12-18T09:46:49Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 926264 bytes, checksum: 416b10a79cd9725bb4a42f91379a81ee (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-18T09:46:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 926264 bytes, checksum: 416b10a79cd9725bb4a42f91379a81ee (MD5) Previous issue date: 2015-08-14 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio / As duas espécies de Mycoplasma mais prevalentes na indústria suinícola são Mycoplasma hyopneumoniae e Mycoplasma hyorhinis. Estes patógenos podem causar perdas econômicas significativas para os produtores e para a indústria. Variabilidade genética tem sido observada em cepas de M. hyopneumoniae usando diferentes técnicas de tipificação. Já a diversidade genética de M. hyorhinis tem sido o foco de um número limitado de estudos nos últimos anos. Mycoplasma apresentam numerosas regiões repetitivas (VNTR) no seu genoma, e essas regiões repetitivas são conhecidos por serem sítios ativos para recombinação genética. Isso trouxe em evidencia a hipótese de que a análise em multilocus de repetições em Tandem de número variável (MLVA) seria uma técnica adequada para investigar a variação genética em Mycoplasma. Portanto, o objetivo principal desta dissertação foi investigar a distribuição não aleatória dos genótipos de diferentes localizações geográfica usando análise em multilocus de repetições em Tandem de número variável (MLVA) para tipificar M. hyopneumoniae e M. hyorhinis avançando o conhecimento sobre a diversidade genética e epidemiologia desses agentes. Quando o foco foi o estudo da diversidade genética de M. hyopneumoniae, um elevado número de tipos de MLVA parecem circular entre rebanhos de suínos com uma distribuição não aleatória dos tipos de MLVA entre regiões. Um único tipo comum não foi identificado entre as amostras obtidas a partir de todas as regiões em estudo. Do mesmo modo, foi observada a diversidade genética de M. hyorhinis, com uma variação limitada em um dos VNTRs alvo. Um ponto relevante observado neste estudo foi a identificação de diferentes tipos de MLVA no mesmo animal em diferentes tipos de amostras, o que sugere que o animal foi colonizado por diferentes cepas. Com foco na indústria de suínos do Brasil, uma das mais importantes do mundo, um estudo específico observou uma elevada diversidade de cepas de M. hyopneumoniae em circulação no país. A comparação entre o número de repetições em tandem (TR) no P97 RR1 e RR3 P146 mostrou uma correlação negativa significativa o que pode sugerir um possível mecanismo compensatório que permitiria a bactéria manter sua capacidade de aderência completa mesmo após a redução da TR em RR1-P97. Em conclusão, a identificação da heterogeneidade genética de M. hyopneumoniae e M. hyorhinis ajudará investigações epidemiológicas ou de surtos locais e ajudará conceber estratégias de controle futuras, bem como servir como uma ferramenta potencial para o estudo da biologia evolutiva da espécie. / The two most prevalent Mycoplasmas species present in the swine industry are Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis. These pathogens can cause significant economic losses for producers and for the industry. Genetic variability has been observed in M. hyopneumoniae using different techniques and heterogeneity of M. hyorhinis has been the focus of a limited number of studies in the past years. The fact that Mycoplasma genomes contain numerous repetitive regions (VNTR) within their DNA and that they are known to be active sites for genetic recombination has prompted the hypothesis that Multiple locus variable number tandem repeat analysis (MLVA) would be an appropriate technique to investigate genetic variation in Mycoplasma. Therefore, the main goal of this dissertation was to investigate the non random distribution of genotypes from different geographical location using multiple locus variable tandem repeat analysis (MLVA) to type M. hyopneumoniae and M. hyorhinis and advance the knowledge on the genetic diversity and the epidemiology of these pathogens.When the M. hyopneumoniae study was taken in account, a high number of M. hyopneumoniae MLVA types appear to circulate among swine herds with a non-random distribution of the MLVA types among regions, also a common type was not identified among samples obtained from all regions in this study. Likewise, heterogeneity of M. hyorhinis was observed, with limited variation in one of the target VNTR in the M. hyorhinis study. A relevant point observed in this study was that different MLVA types were identified in the same animal in different sample types, which suggests that the pig was colonized with different strains. With a focus on Brazil pig industry, one of the most important in the world, a specific study observed a high heterogeneity of M. hyopneumoniae strains circulating in the country, and the comparison between the number of tandem repeats (TR) in RR1 P97 and RR3 P146 showed a significant negative correlation that may suggest a possible compensatory mechanism that would allow the bacterium to keep its full adhesion capacity even after reduction of TR in RR1-P97. In conclusion, the identification of the genetic heterogeneity of M. hyopneumoniae and M. hyorhinis will assist local epidemiological or outbreak investigations, design future control strategies as well as serve as a potential tool to study the evolutionary biology of this species.

Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma flocculare e Mycoplasma hyorhinis são capazes de aderir e colonizar o trato respiratório de suínos. Enquanto a presença de M. flocculare é considerada assintomática, M. hyopneumoniae e M. hyorhynis são relacionados ao desenvolvimento de patologias. M. hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína e M. hyorhynis além dos pulmões pode atingir outros sítios e hospedeiros, estando relacionado a artrites, poliserosites e desenvolvimento de vários tipos de câncer em humanos. Apesar dos avanços tecnológicos na área de genômica, raros são os dados quanto ao papel de M. flocculare no trato respiratório suíno. Além do mais, informações relativas à transcrição gênica nessas espécies são escassas, apesar da importância desses microrganismos. Neste estudo são apresentados os dados da sequência do genoma de uma linhagem de M. flocculare, bem como do genoma de um novo isolado de M. hyopneumoniae. Com estas novas sequências foram realizadas análises de genômica comparativa visando a identificação de características que pudessem explicar os diferentes comportamentos quanto à patogenicidade dessas espécies. Além disso, a análise global dos transcritomas de cada uma das espécies foi realizada e o perfil transcricional entre M. hyopneumoniae, M. flocculare e M. hyorhynis foi analisado comparativamente objetivando identificar características peculiares para cada um dos mapas transcricionais, além de compreender a coordenação do modo de transcrição gênica em Mycoplasma. De um modo geral, as três espécies de Mycoplasma que habitam o trato respiratório suíno possuem grandes semelhanças na composição gênica, assim como na abundância de transcritos. A análise do repertório transcricional, mostra que os genomas são transcritos quase que em sua totalidade, incluindo as regiões intergênicas, nas três espécies. M. hyopneumoniae e M. flocculare apresentam conteúdo gênico e perfil transcricional muito semelhantes. Uma importante diferença encontrada entre estas duas espécies refere-se à presença exclusiva de genes e transcritos de adesinas específicas. M. hyorhynis possui genes e transcritos exclusivos, os quais sabidamente estão relacionados à sua capacidade mutacional, de invasividade e infecção de diferentes sítios. Por fim, a análise comparativa dos genomas, e a obtenção dos mapas transcricionais para M. hyopneumoniae, M. flocculare e M. hyorhynis, foram abordagens que resultaram em um grande número de informações, as quais são importantes para embasamento de futuros estudos de caracterização dos mecanismos moleculares, como os eventos de regulação da transcrição gênica, no gênero Mycoplasma. / Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis and Mycoplasma flocculare are able to adhere and to colonize the swine respiratory tract. While M. flocculare presence is virtually assymptomatic, M. hyopneumoniae and M. hyorhynis infections may cause respiratory disease. M. hyopneumoniae is the causative agent of swine enzootic pneumonia and M. hyorhynis may affect the lungs and other sites in a diversity of hosts and has been related to arthritis, poliserosites and to the development of several types of human cancer. Despite genomics technological advances, there are very few data about the possible role of M. flocculare in the swine respiratory tract. Moreover, little information about gene transcription is available in these species, despite the importance of these microorganisms. In this work the genome sequences of M. flocculare and a new isolate of M. hyopneumoniae are presented. A comparative genomic analyzes was performed to identify possible characteristics that may help to explain the different behaviors of these species in the swine respiratory tracts. Furthermore, a transcriptome map of each species was performed and a comparative transcriptional profile analysis between M. hyopneumoniae, M. flocculare and M. hyorhynis was undertaken to identify the exclusive features for each of the transcriptional maps, in addition to understanding the coordination mode of gene transcription in Mycoplasma. In general, the three Mycoplasma species that inhabit the swine respiratory tract have a similar gene composition as well as the abundance of transcripts. The transcriptome maps showed that most of the predicted genes are transcribed from these Mycoplasma genomes, as well as some intergenic regions. M. hyopneumoniae and M. flocculare present very similar gene content and transcriptional profile. However, an important difference between these two species is related to the exclusive presence of genes and transcripts of some specific adhesins. M. hyorhynis presents exclusive genes and transcripts that have been related to its invasiveness, mutation rate and infection of different sites. Finally, the comparative analysis of the genomes and transcriptional maps between M. hyopneumoniae, M. flocculare and M. hyorhynis have resulted in a large amount of information, which are important for future studies of the molecular characterization, as transcriptional regulation in the Mycoplasma spp.

Notre modèle d'étude, Mycoplasma mycoides subsp. mycoides (Mmm), est l'agent de la péripneumonie contagieuse bovine (PPCB). Cette maladie fut un des plus grands fléaux de l'élevage bovin au XIXème siècle et sévit encore largement en Afrique. A cause de son impact sur l'économie, elle a bénéficié de grandes attentions dans les pays industrialisés, notamment lors des épisodes de résurgence européens dans les années 1980-90. Inscrite sur les listes de l'OIE, la PPCB est à déclaration obligatoire, ce qui entraine de sévères mesures de restriction sur le commerce des animaux vivants. Plusieurs espèces de mycoplasmes sont phylogénétiquement proches de Mmm. Pour mieux comprendre la pathogénie de cette maladie, il est nécessaire d'analyser les facteurs qui peuvent concourir à la virulence de l'agent pathogène incriminé. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés aux exopolysaccharides (EPS) de Mmm, candidats clés dans la virulence de cette bactérie. Ils ont été caractérisés chimiquement par HPLC et RMN, puis comparés aux polysaccharides capsulaires (CPS) dans le cadre d'une étude sur des variants intraclonaux de Mmm. Ces expériences ont été rendues possibles grâce à l'élaboration d'un protocole offrant une production optimale des EPS pour les analyses et un affranchissement des contaminants du milieu lors de leur isolement à partir des surnageants de culture. Ce protocole a permis, par ailleurs, d'élargir l'étude de caractérisation chimique des EPS au groupe « mycoides » auquel appartient Mmm. La production d'anticorps monoclonaux anti-polysaccharides a offert la possibilité d'étudier les communautés antigéniques au sein du groupe et de caractériser la localisation du polymère sécrété (CPS et/ou EPS). Les génomes séquencés et annotés disponibles ont fait l'objet d'études in silico sur les voies de biosynthèse potentiellement impliquées dans la production des polysaccharides. Les résultats montrent que dans le cas de Mmm, les variants d'un même clone présentent des différences de production de polysaccharides se traduisant par un phénotype opaque/translucide en culture sur milieu solide pouvant être associé à un « switch ON/OFF » du gène qui code un transporteur de glucose. Mmm sécréte du galactane (polymère de β-D-(1-6) galactofuranose) identique au composé associé à la membrane. Au sein du groupe « mycoides », deux espèces sécrètent un β-D-(1-2) glucane dont la structure linéaire est originale. L'analyse des voies de biosynthèse des génomes concernés concorde avec les deux produits mis en évidence. De nombreux gènes impliqués semblent résulter de transferts latéraux venant de mycoplasmes éloignés phylogénétiquement mais qui partagent le même habitat / Our model, Mycoplasma mycoides subsp. mycoides (Mmm), is the agent of contagious bovine pleuropneumonia (CBPP). CBPP is a severe contagious disease currently present in Africa. CBPP is classed as a notifiable disease by the OIE, which implies severe restrictive measures in in the trade of live animals. Because of its economic importance, CBPP has received much attention in indusdrialized country, notabily when the disease had reemerged in Europe in 1980’s and 90’s. To better understand the pathogenesis of this disease, it is necessary to analyze the factors that may contribute to the virulence of this agent. In this context, we were interested in Mmm exopolysaccharides (EPS), potential key molecules in the virulence of this bacterium. First, Mmm EPS were chemically characterized by HPLC and NMR and compared to the capsular polysaccharides (CPS) in a study on intraclonal Mmm variants. To conduct these experiments, a suitable methodology was developed to produce and to purify EPS from culture supernatants by avoiding technical difficulties due to the complexity of the mycoplasma growth medium. Then, this protocol allowed extending the study to the chemical characterization of EPS from mycoplasmas belonging to the Mycoplasma mycoides cluster (MMC) as Mmm. The production of monoclonal antibodies recognizing Mmm and Mccp polysaccharides was used to study the antigenic communities within this group of mycoplasmas and to characterize the location of the secreted polymer (CPS and/or EPS). The sequenced and annotated genomes were used to manage in silico studies of biosynthetic pathways potentially involved in the production of polysaccharides. The results showed that Mmm intraclonal variants resulting in an opaque / translucent phenotype on solid culture may be associated with an “ON/OFF switch" of the gene encoding a glucose transporter and, in turn associated to the production of either CPS or EPS. Mmm secretes a β-(1-6) galactofuranose polymer identical to that of the membrane associated compound, excepted it has no lipid anchor. Within MMC, there are two species that secrete a β -(1-2) glucan, the linear structure of which is original. The analyses of the biosynthetic pathways of the different genomes were consistent with the structure of the related secreted products. Many genes could appear to originate from phylogenetically distant mycoplasmas that share the same habitat

Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma flocculare e Mycoplasma hyorhinis são capazes de aderir e colonizar o trato respiratório de suínos. Enquanto a presença de M. flocculare é considerada assintomática, M. hyopneumoniae e M. hyorhynis são relacionados ao desenvolvimento de patologias. M. hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína e M. hyorhynis além dos pulmões pode atingir outros sítios e hospedeiros, estando relacionado a artrites, poliserosites e desenvolvimento de vários tipos de câncer em humanos. Apesar dos avanços tecnológicos na área de genômica, raros são os dados quanto ao papel de M. flocculare no trato respiratório suíno. Além do mais, informações relativas à transcrição gênica nessas espécies são escassas, apesar da importância desses microrganismos. Neste estudo são apresentados os dados da sequência do genoma de uma linhagem de M. flocculare, bem como do genoma de um novo isolado de M. hyopneumoniae. Com estas novas sequências foram realizadas análises de genômica comparativa visando a identificação de características que pudessem explicar os diferentes comportamentos quanto à patogenicidade dessas espécies. Além disso, a análise global dos transcritomas de cada uma das espécies foi realizada e o perfil transcricional entre M. hyopneumoniae, M. flocculare e M. hyorhynis foi analisado comparativamente objetivando identificar características peculiares para cada um dos mapas transcricionais, além de compreender a coordenação do modo de transcrição gênica em Mycoplasma. De um modo geral, as três espécies de Mycoplasma que habitam o trato respiratório suíno possuem grandes semelhanças na composição gênica, assim como na abundância de transcritos. A análise do repertório transcricional, mostra que os genomas são transcritos quase que em sua totalidade, incluindo as regiões intergênicas, nas três espécies. M. hyopneumoniae e M. flocculare apresentam conteúdo gênico e perfil transcricional muito semelhantes. Uma importante diferença encontrada entre estas duas espécies refere-se à presença exclusiva de genes e transcritos de adesinas específicas. M. hyorhynis possui genes e transcritos exclusivos, os quais sabidamente estão relacionados à sua capacidade mutacional, de invasividade e infecção de diferentes sítios. Por fim, a análise comparativa dos genomas, e a obtenção dos mapas transcricionais para M. hyopneumoniae, M. flocculare e M. hyorhynis, foram abordagens que resultaram em um grande número de informações, as quais são importantes para embasamento de futuros estudos de caracterização dos mecanismos moleculares, como os eventos de regulação da transcrição gênica, no gênero Mycoplasma. / Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis and Mycoplasma flocculare are able to adhere and to colonize the swine respiratory tract. While M. flocculare presence is virtually assymptomatic, M. hyopneumoniae and M. hyorhynis infections may cause respiratory disease. M. hyopneumoniae is the causative agent of swine enzootic pneumonia and M. hyorhynis may affect the lungs and other sites in a diversity of hosts and has been related to arthritis, poliserosites and to the development of several types of human cancer. Despite genomics technological advances, there are very few data about the possible role of M. flocculare in the swine respiratory tract. Moreover, little information about gene transcription is available in these species, despite the importance of these microorganisms. In this work the genome sequences of M. flocculare and a new isolate of M. hyopneumoniae are presented. A comparative genomic analyzes was performed to identify possible characteristics that may help to explain the different behaviors of these species in the swine respiratory tracts. Furthermore, a transcriptome map of each species was performed and a comparative transcriptional profile analysis between M. hyopneumoniae, M. flocculare and M. hyorhynis was undertaken to identify the exclusive features for each of the transcriptional maps, in addition to understanding the coordination mode of gene transcription in Mycoplasma. In general, the three Mycoplasma species that inhabit the swine respiratory tract have a similar gene composition as well as the abundance of transcripts. The transcriptome maps showed that most of the predicted genes are transcribed from these Mycoplasma genomes, as well as some intergenic regions. M. hyopneumoniae and M. flocculare present very similar gene content and transcriptional profile. However, an important difference between these two species is related to the exclusive presence of genes and transcripts of some specific adhesins. M. hyorhynis presents exclusive genes and transcripts that have been related to its invasiveness, mutation rate and infection of different sites. Finally, the comparative analysis of the genomes and transcriptional maps between M. hyopneumoniae, M. flocculare and M. hyorhynis have resulted in a large amount of information, which are important for future studies of the molecular characterization, as transcriptional regulation in the Mycoplasma spp.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2017-05-29T14:12:30Z No. of bitstreams: 1 Luciana Florencio Vilaca.pdf: 780940 bytes, checksum: f71ece6a621a081642573fed11311887 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-29T14:12:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luciana Florencio Vilaca.pdf: 780940 bytes, checksum: f71ece6a621a081642573fed11311887 (MD5) Previous issue date: 2017-02-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The program of selection of goats with milk aptitude has been focused on the increase in milk quantity, neglecting factors related to resistance to diseases and milk composition. This behavior has led to studies aimed at the rapid detection of microorganisms and the identification of genes or chromosomal regions related to infectious diseases of the mammary gland. The objective of the present thesis was to detect Mycoplasma agalactiae (Ma) and Mycoplasma mycoides cluster (Mmcluster) in goat milk samples and to evaluate the composition and counting of somatic cells from Ma and Mmcluster positive animals (Experiment 1). In addition, we sought to identify Goat Lymphocyte Antigen (GoLA-DRB.2) gene polymorphisms and to associate them with goat milk characteristics (Experiment 2). To perform the experiment 1, 373 samples of goat milk of different races belonging to herds located in the states of Pernambuco and Paraiba were collected. The genomic DNA of the milk samples was extracted by the silica / guanidine isothiocyanate method, followed by the generic and species-specific amplification by polymerase chain reaction. Identification of the presence or absence of gene products was performed by direct observation of the bands of the PCR products visualized on electrophoresis gel. Analysis of variance and comparison tests of averages were performed to verify the effects of positivity on somatic cell composition and counting characteristics. The frequencies for Ma and Mmcluster were 43.21% and 5.70%, respectively, in the herds evaluated. The breeding system was considered as risk factors (p <0.001) and the racial pattern (p<0.001). Ma positive samples were detected in all genetic groups, with higher occurrence in the and Marota race. Positive samples for Mmcluster were only observed in Moxotó (18.28%), Parda Sertaneja (1.92%) and SPRD (3.12%) rats. In the study of association between positivity and milk composition, a statistical difference was observed for protein, casein and somatic cell counts. The detection of Mycoplasma in samples of goat milk suggests the introduction of infected animals in the evaluated herds, as well as the possible contact with the etiological agents in fairs and exhibitions. In addition, the breeding system adopted on the property influences the spread of the infection in the herd. For the execution of Experiment 2, a total of 181 female goats of different races from the state of Pernambuco and Paraiba were selected. Milk samples were harvested and extracted from genomic DNA as described in Experiment 1. The genotyping of the animals for the 285bp fragment of the GoLA-DRB.2 gene was the result of amplification by PCR-RFLP technique, using the enzymes of Restriction PstI and TaqI. The allelic frequency found for the total population using the PstI enzyme was A equal to 0.7254 and B at 0.2746, with the frequencies of the AA, AB and BB genotypes being 0.6740, 0.0387 and 0, 2873 respectively. The allele frequencies obtained from the digestion with the TaqI enzyme were C = 0.8149 and D = 0.1851, with the frequencies of the genotypes: 0.7403 (CC), 0.1492 (CD) and 0.1105 ( DD), with predominance of the CC genotype in all the racial standards evaluated. The observed Heterozygosity values were lower than those found for expected Heterozygosity in all tested populations with herds out of Hardy-Weinberg equilibrium. There was significant genetic variation between races, among individuals of the same race and within the population. There was no significant difference between genotypes and haplotype patterns on the values of fat, protein, lactose, total solids, casein and somatic cell counts. The GoLA-DRB.2 gene was polymorphic in the evaluation with the PstI and TaqI enzymes studied but had no effect on any of the somatic cell composition and counting characteristics evaluated. / O programa de seleção de caprinos com aptidão leiteira tem sido, basicamente, voltado ao aumento na quantidade de leite, negligenciando fatores relacionados à resistência a doenças e à composição do leite. Este comportamento vem ocasionando o direcionamento a estudos voltados à rápida detecção de micro-organismos e à identificação de genes ou regiões cromossômicas relacionadas a doenças infectocontagiosas da glândula mamária. Diante do exposto, a presente tese teve como objetivo inicial, detectar Mycoplasma agalactiae (Ma) e Mycoplasma mycoides cluster (Mmcluster) em amostras de leite caprino e avaliar a composição e a contagem de células somáticas provenientes de animais positivos para Ma e Mmcluster (Experimento 1). Além disso, buscou-se identificar os polimorfismos do gene Goat Lymphocyte Antigen (GoLA-DRB.2) e associar com características do leite de cabra (Experimento 2). Para realização do Experimento 1, foram colhidas 373 amostras de leite de caprinos de diferentes raças pertencentes a rebanhos localizados nos estados de Pernambuco e da Paraíba. O DNA genômico das amostras de leite foi extraído pelo método sílica/isotiocianato de guanidina, seguida da amplificação genérica e espécie-específica por reação em cadeia da polimerase. A identificação da presença ou não de produtos gênicos foi realizada através de observação direta das bandas dos produtos de PCR visualizados em gel de eletroforese. Análises de variância e testes de comparação de médias foram realizados para verificar os efeitos da positividade sobre as características de composição e contagem de células somáticas. As frequências para Ma e Mmcluster foram de 43,21% e 5,70%, nos rebanhos avaliados, respectivamente. Foram considerados fatores de risco o sistema de criação (p<0,001) e o padrão racial (p<0,001). Em todos os grupos genéticos foram detectadas amostras positivas para Ma, sendo observada maior ocorrência na raça Marota. Amostras positivas para Mmc só foram observadas em animais das raças Moxotó (18,28%), Parda Sertaneja (1,92%) e SPRD (3,12%). No estudo de associação entre a positividade e composição do leite, observou-se diferença estatística para as médias de proteína, caseína e contagem de células somáticas. A detecção de Mycoplasma em amostras de leite caprino sugere a introdução de animais infectados nos rebanhos avaliados, como também o possível contato com os agentes etiológicos em feiras e exposições. Além disso, o sistema de criação adotado na propriedade influencia a disseminação da infecção no rebanho. Para execução do Experimento 2, um total de 181 fêmeas caprinas de diferentes raças provenientes do estado de Pernambuco e da Paraíba foram selecionadas. Amostras de leite foram colhidas e submetidas à extração do DNA genômico como descrito no Experimento 1. A genotipagem dos animais para o fragmento de 285 pb do gene GoLADRB. 2 foi resultante da amplificação pela técnica de PCR-RFLP, utilizando as enzimas de restrição PstI e TaqI. A frequência alélica encontrada para a população total com a utilização da enzima PstI foi de A igual a 0,7254 e B a 0,2746, sendo as frequências dos genótipos AA, AB e BB de 0,6740, 0,0387 e 0,2873, respectivamente. As frequências alélicas obtidas a partir da digestão com a enzima TaqI foi de C = 0,8149 e D = 0,1851, sendo as frequências dos genótipos: 0,7403 (CC), 0,1492 (CD) e 0,1105 (DD), com predominância do genótipo CC em todos os padrões raciais avaliados. Os valores da Heterozigosidade observada foram menores do que os encontrado para Heterozigosidade esperada em todas as populações testadas, com rebanhos fora do equilíbrio de Hardy-Weinberg. Houve variação genética significativa entre raças, entre indivíduos da mesma raça e dentro da população. Não houve diferença significativa entre os genótipos e os padrões de haplótipos sobre os valores de gordura, proteína, lactose, sólidos totais, caseína e contagem de células somáticas. O gene GoLA-DRB.2 foi polimórfico na avaliação com as enzimas PstI e TaqI estudadas, mas não desempenhou efeitos sobre nenhumas das características de composição e contagem de células somáticas avaliadas.

O cultivo de células humanas para fins experimentais e terapêuticos se firmou como um dos pilares da biologia celular e tem se tornado uma prática laboratorial cada vez mais disseminada. Associada a esse processo está a contaminação por microrganismos, dentre os quais se destacam as bactérias do gênero Mycoplasma spp., os quais são os contaminantes detectados com maior frequência in vitro. Um dos pontos críticos no processo de garantia da qualidade, pureza e segurança para uso destas células é a adoção de uma metodologia analítica, para detecção de Mycoplasma spp., que seja simples e de rápida execução, com sensibilidade e especificidade adequada e economicamente viável. O objetivo desse trabalho foi desenvolver uma plataforma molecular (PCR em tempo real) para detecção de Mycoplasma spp. em culturas celulares. Para tanto, foram testados diversos conjuntos de primers (gene 16S rDNA) dentre os quais um foi selecionado para a plataforma molecular. Foram utilizadas amostras de DNA obtidas a partir do sobrenadante de cultura. A PCR em tempo real in house foi padronizada utilizando o intercalante fluorescente de DNA dupla fita BRYT Green® e produziu um fragmento de 270 pares de bases. A temperatura de melting para as amostras positivas foi definida no intervalo de 81 a 84°C. A plataforma molecular foi validada por meio dos parâmetros sensibilidade analítica e diagnóstica, especificidade analítica, potencial de arraste, precisão e robustez. O limite de detecção do teste (LOD) foi de 5 cópias/5 ?L. Para a especificidade, foi observada reação cruzada com bactérias de relação filogenética próxima e com DNA de célula humana. A sensibilidade diagnóstica foi de 100%. Não foi houve contaminação por arraste. O coeficiente de variação encontrado no parâmetro precisão foi de 0,64% e 1,80% para a avaliação intra-ensaio e inter-ensaio, respectivamente. O coeficiente de variação da análise robustez foi de 5,42%. Ao comparar a plataforma molecular com o teste comercial, observou-se que 29,85% (n=40) das amostras apresentaram resultados falso-negativos pelo teste comercial. Determinou-se ainda que a PCR em tempo real in house foi mais sensível do que o teste comercial. A análise por microscopia eletrônica de varredura demonstrou a presença de estruturas sugestivas de espécies de Mycoplasma spp. na superfície das células. A análise filogenética permitiu a classificação das espécies encontradas. Os resultados obtidos neste trabalho permitiram propor o algoritmo para aplicação de um método de detecção simples e rápido para Mycoplasma spp.; e fazer deste uma ferramenta para o controle de qualidade das células cultivadas, garantindo a eficiência destas células para uso em pesquisa e maior segurança para uso em terapia celular. / The culture of human cells for experimental and therapeutic purposes has been consolidated as one of the foundations of cell biology and has increasingly become a widely used laboratory practice. The contamination by microorganisms is associated with this process, among them we can highlight bacteria of the genus Mycoplasma spp., which are contaminants more frequently detected in vitro. One of the critical points in the process of assuring quality, purity, and safety for the use of these cells is the adoption of an analytical methodology for the detection of mycoplasma that is simple and fast to conduct, with proper sensitivity and specificity and that is also economically viable. The objective of this work was to develop a molecular platform (real time PCR) for the detection of mycoplasmas in cell cultures. Therefore, we tested several sets of primers (16S rDNA gene), among them one was selected for the molecular platform. DNA samples used were obtained from the culture supernatant. In house real time PCR was standardized using BRYT Green® double-stranded DNA intercalating fluorescent and produced a fragment of 270 pair bases. The melting temperature for the positive samples was set in the range 81 to 84°C. The molecular platform was validated through the parameters: analytical and diagnostic sensitivity, analytical specificity, carry-over contamination, precision and robustness. The limit of detection of the test (LOD) was 5 copies/5 ?L. For specificity, it was observed a cross reaction with bacteria of close phylogenetic relationship and with human cell DNA. Diagnostic sensitivity was 100%. There was no carry-over contamination. The coefficient of variation was found in the precision values of 0.64% and 1.80% for intra-assay and inter-assay assessment, respectively. The variance coefficient of the robustness analysis was 5.42%. By comparing the molecular platform with the commercial test, we observed that 29.85% (n=40) of the samples showed false negative results by the commercial test. It has been determined further that the real-time PCR in house was more sensitive than the commercial test. The analysis by scanning electron microscopy demonstrated the presence of suggestive structures of Mycoplasma spp. species in the surface of cells. Phylogenetic analysis allowed the classification of the species found. The results obtained in this work allowed us to propose the algorithm for application of a simple and fast method for mycoplasma detection and making from this tool for quality control for cultured cells, assuring the efficiency of these cells for use in research and greater safety for use in cell therapy more safety to patients subjected to cell therapy.

Pesquisou-se a freqüência de Mollicutes na orofaringe, conjuntiva e trato urogenital de 58 macacos. Na orofaringe detectou-se Mollicutes em 55,17 % e Ureaplasma spp em 43,10%. As espécies identificadas nesta região foram: M. arginini (43,10%), M salivarium (41,37%), e M. pneumoniae (18,96%). No trato genital detectou-se Mollicutes em 27,58% sendo identificado M. arginini em 8,62%, A. laidlawii em 1,72 % e Ureaplasma spp em 32,75%. Na conjuntiva detectou-se Mollicutes em 29,31 % e A. laidlawii em 1,72 %. Os cultivos apresentaram limitações pelo alto índice de contaminação e obtiveram-se apenas dois isolamentos da conjuntiva. As espécies detectadas constituem-se o achado inicial destas bactérias em macacos no Brasil. / The frequency of Mollicutes in oropharynx, conjunctiva, and urogenital tract were accessed in 58 monkeys. In oropharynx, Mollicutes and Ureaplasma spp were detected in 55.17% and 43.01% of the samples, respectively. The identified species in this site included: M. arginini (43.10%), M. salivarium (41.37%), and M. pneumoniae (18.96%). In the urogenital tract, Mollicutes were detected in 27.58% of the samples; including M. arginini (8.62%), A. laidlawii (1.72%) and Ureaplasma spp (32.75%). In the conjunctiva, Mollicutes were detected in 29.31% and A. laidlawii in 1.72% of the animals. Mollicutes culture showed technical limitations because of the high level of contamination and only two isolates were obtained; both from conjunctival sites. The Mollicute specie surveillance of this study provided initial and new insights about these bacteria in Brazilian monkeys.