This diploma thesis deals with preparation of modified ligands of mu, delta and kappa opioid receptors, following up on the author's bachelor's thesis.1 The main goal of the submitted thesis is ligand tethering at an appropriate position using oligoethylene glycol linkers, to enable their use in the innovative iBodies concept.2 Ligands chosen for modifications were: naltrexone (μ-opioid receptor), naltrindole (δ-opioid receptor) and nalfurafine (κ-opioid receptor). Naltrexone was modified, according to the bachelor's thesis results, at the C-6 position with linker attachment via ether and amide. At the same time, the influence of the configuration at the newly formed C-6 stereogenic center on biological activity was studied. In case of naltrindole, access through indole nitrogen was chosen based on the information in literature.3-5 Nalfurafine was modified on the furane fragment. Series of fluorescently labeled ligands were prepared. Attachment of the fluorescent tag allowed us to study the affinity and selectivity of these modified ligands. Based on the results, ligands for development of DIANA method and for preparation of synthetic iBodies were synthesised.6 Key words: naltrexone, receptor, conjugate, opioid receptor 1 M. Hadzima. Fluorescenčně značené ligandy μ-opioidních receptorů, 2016. 2 P....

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Einleitung: Wegen der hohen Prävalenz und der schwerwiegenden gesundheitlichen, sozialen und ökonomischen Folgen des weltweiten Alkoholkonsums ist die Erforschung besserer medikamentöser Behandlungsoptionen der Alkoholabhängigkeit von entscheidender Bedeutung. Klinische Studien für alle potentiell wirksamen pharmakologischen Ansatzpunkte durchzuführen, erscheint jedoch nicht realistisch. Mit dem „Testsystem für Medikamente bei Alkoholabhängigkeit“ (TEMA) wurde eine Methode entwickelt, die bestimmte präklinische Paradigmen in ein humanes Laborexperiment überträgt. Neben der Abbildung suchttypischen Verhaltens können damit auch verschiedene Kontingenzen zwischen Suchtverhalten und Verstärkung modelliert und eine bessere experimentelle Kontrolle über Alkoholexposition ermöglicht werden. Das TEMA sollte in der TEMANX-Studie validiert werden. Dazu sollte nachgewiesen werden, dass der µ-Opiat-Rezeptorantagonist Naltrexon gegenüber Placebo die Bereitschaft reduziert, in einem Laborexperiment Arbeit für Alkohol zu leisten. In der vorliegenden Arbeit wurden die Daten der TEMANX-Studie ausgewertet. Methoden: 46 nicht alkoholabhängige aber riskant trinkende Freiwillige (6 weiblich), darunter 17 Träger des OPRM1 A118G-Polymorphismus, führten zwei Experimente mit intravenöser Alkoholselbstverabreichung (ASA) durch. Das erste Experiment wurde vor, das zweite nach mindestens 7 Tagen randomisierter doppelblinder Behandlung mit Naltrexon bis 50 mg pro Tag oder Placebo durchgeführt. Jede Alkoholinfusion erforderte vorherige Arbeit in einer Aufmerksamkeitsaufgabe, deren Anforderungen gemäß einem progressiven Arbeitsschema im Verlauf exponentiell gesteigert wurden. Die Dynamik der Alkoholexposition und die steigende Arbeitsanforderung ermöglichte die Abbildung von einer initialen Anstiegsphase mit schnell steigenden Blutalkoholkonzentrationen (BAK), gefolgt von einer Plateauphase. In letzterer konnte die BAK trotz kontinuierlicher Arbeit für Alkohol nicht weiter erhöht, sondern ein Abfall der BAK nur verlangsamt werden. Ergebnisse: Personen, die mit Naltrexon behandelt wurden, reduzierten ihre kumulative Arbeitsleistung für Alkohol (cWFA) stärker als Teilnehmer in der Placebogruppe. Dieser Unterschied in der primären Zielgröße war in den vorab definierten Analysen der gesamten 150 Minuten der ASA, nicht statistisch signifikant (p = 0,471, Cohen’s d = 0,215). In den sekundären Zielgrößen zeigten sich ebenfalls keine signifikanten Unterschiede. Die Naltrexon-Serumspiegel korrelierten mit der Veränderung der Naltrexon-induzierten cWFA (r = −0,53; p = 0,014). Separate explorative Analysen ergaben, dass Naltrexon die cWFA während der Anstiegsphase signifikant reduzierte, nicht aber während der Plateauphase. Phasenabhängigtraten Korrelationen zwischen der cWFA und der Veränderungen der subjektiven Maße von alkoholinduzierter Stimulation, Wohlbefinden und Verlangen auf, welche durch Naltrexon modifiziert wurden. Naltrexon veränderte weder das reale Trinkverhalten noch das Alkohol-Craving. Der OPRM1-Polymorphismus konnte die Wirkung von Naltrexon nicht vorhersagen. Die Studienmedikation wurde gut vertragen und die TEMA-Prozeduren waren praktikabel und veranlassten keinen Teilnehmer zum Studienabbruch. Diskussion: Aufgrund eines starken Placeboeffekts konnte die Überlegenheit von Naltrexon gegenüber Placebo in den vorab geplanten Analysen nicht validiert werden. Unter Berücksichtigung der Dosis-Wirkungs-Beziehung der Naltrexon-Serumspiegel sowie aufgrund des Naltrexoneffekts in der Anstiegsphase, während die BAK anstieg, ist dennoch ein Medikamenteneffekt anzunehmen. Die phasenabhängigen Korrelationen der cWFA und den subjektiven Maßen legen nahe, dass die WFA während Anstiegsphase positiv und während der Plateauphase möglicherweise negativ verstärkt wurde. Die Ergebnisse zeigten sich trotz der verhältnismäßig kleinen Stichprobe nicht alkoholabhängiger freiwilliger Probanden und obwohl Naltrexon weder die Trinkmenge noch das Craving im richtigen Leben veränderte. Das TEMA stellt damit das erste Laborparadigma dar, das in der Lage ist, verschiedene Trinkmotivationen innerhalb eines Experiments zu modellieren. Deswegen hat es das Potential, in Zukunft schnell und effektiv potentielle Medikamente zu überprüfen, deren klinischer Wirkmechanismus nicht gut bekannt ist und zur Entscheidung beizutragen, ob es sich lohnt bestimmte neue Substanzen in großen klinischen Studien weiter zu untersuchen. Ein erstes Ergebnis ist ein experimenteller Nachweis, dass Naltrexon möglicherweise gezielt das positiv verstärkte Trinkverhalten reduzieren könnte.:Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Publikationen I. Einleitung I.1. Alkoholkonsum: Epidemiologische Betrachtung und Folgen I.2. Therapie der Alkoholabhängigkeit I.2.1. Überblick I.2.2. Zugelassene medikamentöse Behandlungsoptionen I.2.3. Beispiele medikamentöser Off-label Behandlungsoptionen. I.3. Entwicklung neuer Substanzen zur Behandlung der Alkoholabhängigkeit I.4. Experimentelle Alkoholselbstverabreichung als Screening-Methode für neue wirksame Substanzen I.5. Vorteile und Schwächen bestehender Methoden der Alkohol-Selbstverabreichung I.5.1. Zugangswege zur Verabreichung von Alkohol I.5.2. Die Abbildung suchtspezifischen Verhaltens in der experimentellen Alkohol- Selbstverabreichung I.6. Die TEMANX Studie I.6.1. Das in der TEMANX-Studie verwendete Paradigma a) Computergestütztes Alkoholinfusionssystem b) Verwendung eines progressiven Arbeitsschemas für Alkoholanforderungen c) Abbildung verschiedener Kontingenzen zwischen Verhalten und Verstärkung d) Naltrexon als Referenzsubstanz e) Kochsalzlösung als alternativer Verstärker I.7. Stellenwert der vorliegenden Arbeit II. Material und Methoden II.1. Teilnehmer und Rekrutierung II.1.1. Rekrutierung II.1.2. Ein- und Ausschlusskriterien II.2. Studienablauf II.2.1. Teilnehmerfluss während des Studienverlaufs a) (Pre)-Screening b) Anreicherung der Stichprobe mit Trägern des A118G-Polymorphismus-Allels des OPRM1-Gens II.2.2. Versuchsablauf II.2.3. Verfahren zur Alkohol- und Kochsalzinfusion II.2.4. Arbeitsaufgabe „Constant Attention Task“ II.2.5. Erhebung der Zielgrößen a) Erfassung der Parameter der Alkoholinfusion und des CAT b) Erfassung subjektiver Daten II.2.6. Prüfmedikation II.2.7. Compliance und Messung des Naltrexon-Serum-Spiegels II.2.8. Randomisierung: II.2.9. DNA-Präparation und Genotypisierung II.3. Ziele / Hypothesen II.4. Statistische Auswertung: III. Ergebnisse III.1. Demographische Daten und Baseline-Charakteristika III.2. Konfirmatorische Datenanalyse III.2.1. Intention to Treat-Population a) Primäre Zielgröße b) Sekundäre Ziele: III.2.2. Per-Protocol-Analyse III.2.3. OPRM1-Polymorphismus III.3. Ergebnisse explorativer Analysen zur Wirksamkeit III.3.1. Untersuchung verschiedener Phasen des Selbstverabreichungsexperimentes: III.3.2. Naltrexon-Serumspiegel in der Naltrexongruppe: III.4. Analyse der subjektiven Daten III.5. Ergebnisse zur Sicherheit III.5.1. AEs und SAEs III.5.2. Laborsicherheitsparameter IV. Diskussion IV.1. Studienziele IV.2. Naltrexoneffekte in den verschiedenen Experimentalphasen IV.3. Medikationseffekte in der Anstiegsphase IV.4. Medikationseffekte in der Plateauphase IV.5. Interpretation der subjektiven Alkoholeffekte in Bezug auf die primäre Zielgröße IV.6. Die Rolle des OPRM1-Polymorphismus IV.7. Kumulative Arbeit für Kochsalzlösung IV.8. Diskussion der Sicherheit und Verträglichkeit IV.9. Stärken und Limitationen: IV.10. Stellenwert der Ergebnisse IV.10.1. Einordnung innerhalb der humaner Laborstudien mit ASA und Ausblick IV.10.2. Das TEMA als Screening-Instrument Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis Danksagung