Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2003. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 103-119).

Diss. (sammanfattning) Linköping : Univ., 2001. / Härtill 4 uppsatser.

A la suite d’un criblage in silico nous avons identifié un nouveau gène codant pour une protéine à domaine BTB-POZ, XBTBD6.<p>Nous avons déterminé que la protéine XBTBD6 est une protéine cytoplasmique. Dans les cellules Hela, CHO, U2OS et COS7 la protéine XBTBD6 est localisée dans des corpuscules cytoplasmiques, localisation similaire à celle des protéines XBTBD3, HBTBD1 et HBTBD2. Nous avons observé que la partie N-terminale de la protéine, contenant le domaine BTB-POZ, est localisée dans la cellule comme la protéine entière ;par contre la partie C-terminale est exclusivement nucléaire. De plus, nous avons observé que XBTBD6 est localisée de façon diffuse dans le cytoplasme des cellules Neuro2A, 9L et 518A2e. Nous avons montré que la protéine XBTBD6 homodimérise et hétérodimérise avec XBTBD3 et XBTBD2 et qu’elle interagit avec l’ubiquitine ligase E3 XCullin 3. L’ensemble de ces interactions nécessite la présence du domaine BTB-POZ. Ces données montrent que les protéines BTBD6, BTBD3, BTBD1 et BTBD2 possèdent des propriétés communes indiquant qu’elles appartiennent à un sous groupe de la famille des protéines à domaine BTB-POZ.<p>Le profil d’expression a été analysé par la technique de protection à la RNAse et par hybridation in situ. Les résultats montrent que ce gène est fortement exprimé dans le système nerveux adulte et embryonnaire. Des expériences de surexpression par micro-injection d’ARNm ont permis de placer le gène XBTBD6 dans la cascade d’activation des gènes proneuraux en aval de XNgnr-1, XNeuroD, Xath3 et Xebf3. Ces résultats montrent que XBTBD6 est un marqueur neuronal chez le xénope. <p>Au cours de l’étude de la fonction du gène XBTBD6, nous avons montré que la surexpression et la perte de fonction de ce gène dans l’embryon de xénope n’induit pas de variation du nombre de neurones dans la plaque neurale. Par contre nous avons observé que la surexpression du gène XBTBD6 dans des cellules Neuro2A en différentiation régule négativement la croissance des neurites.<p>Nous avons élaboré un modèle de fonctionnement biochimique hypothétique où la protéine XBTBD6 fonctionnerait comme protéine adaptatrice dans un complexe d’ubiquitination permettant l’ubiquitination d’une protéine cible. Nous avons recherché les partenaires potentiels de XBTBD6 en utilisant la technique du double hybride en levure mais sans y parvenir.<p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Diss. (sammanfattning) Linköping : Univ., 2003. / Härtill 4 uppsatser.

Thesis (Ph.D.)--University of South Florida, 2005. / Includes vita. Includes bibliographical references. Also available online.

Development of functional neural circuits involves a series of complicated steps, including neurogenesis and neuronal morphogenesis. To understand the molecular mechasnims of neurite complexity, especially neurite branching/arborization, the Drosophila brain, especially MBNs (mushroom body neurons) and PNs (projection neurons) in olfactory circuitry, was used in this dissertation work as the model system to study how two molecules, Dscam and Kr-h1 affect neurite complexity in the Drosophilabrain. For the Drosophila Dscam, through alternative splicing it could encode up to 152,064 distinct immunoglobulin/fibronectin type cell adhesion molecules. Each Dscam isoform is derived from one of the 19,008 ectodomain variants connected with one of the two alternative transmembrane segments and one of the four possible endodomain portions. Recent studies revealed that Dscam was widely required for neurite branching/arborizaiton. However, due to the technical difficulty, the functional roles of Dscam transmembrane variants and ectodomain variants remain unclear. In this thesis work, a microRNA based RNA interference was used to knock down distinct subsets of Dscam isoform. First, loss of Dscam[TM1] versus Dscam[TM2], two distinct Dscam transmembrane variants, disrupted the dendritic versus axonal morphogenesis, respectively. Furthermore, structural analysis suggested that the juxtamembrane portion of transmembrane segment was required for the Dscam protein targeting in dendrites/axons and this differential protein targeting might account for the functional distinction between Dscam[TM1] and Dscam[TM2]. Second, to further address the functional significance of having two Dscam transmembrane variants in axons versus dendrites, the possibility that there might be different usage of Dscam repertoire between axons and dendrites that lead to different levels of morphological complexity between axons and dendrites in the same neuron was examined. To this end, end-in targeting approaches were used to exchange Dscam populations between axons and dendrites. Though the genetic data suggested that Dscam populations were exchanged between axons and dendrites, the phenotypic analysis in various neuronal types revealed that depending on the neuronal types, exchange of Dscam populations between axons and dendrites might primarily affect either axonal or dendritic morphology, suggesting that different usage of Dscam population between axons and dendrites might regulate complex patterns of neurite morphology. Finally, the functions of Dscam exon 4 variants had been addressed in different model neurons in the Drosophilabrain. First, 12 Dscam exon 4 variants were divided into three groups based on their phylogenetic distance. Then, three miRNA constructs were engineered to knock down one group at a time. The genetic data suggested that different Dscam exon 4 variants are differentially required in different neurons to support their proper neuronal morphogenesis. In summary, this part of my thesis work identified and characterized previously unrecognized functions of all these distinct Dscam variants and provided novel insights into how diverse Dscam isoforms regulate the different aspects of neuronal morphogenesis. In the honey bee brain, Kr-h1 is upregulated during the behavioral shift from nursing to foraging when there is increased neurite branching in the brain. To directly examine the hypothesis that altered Kr-h1 expression might regulate morphological complexity of neurites, this research work involved the MARCM (mosaic analysis with a repressible cell marker) and TARGET (temporal and regional gene expression targeting) techniques to analyze the roles of Kr-h1 in Drosophila neuronal morphogenesis. Interestingly, increased expression of Kr-h1 blocked the axon branching and further disrupted the lobe formation in the mushroom body whereas the loss-of-Kr-h1 did not show any apparent neuronal morphogenetic defects. In addition, it was observed that Kr-h1 was expressed when MB (mushroom body) did not undergo active morphogenesis, suggesting its potential anti-morphogenetic activity. Indeed, loss of Kr-h1 (Kruppel homolog 1) enhanced the neuronal morphogenesis that was otherwise delayed due to the defective TGF-beta signaling. Furthermore, Kr-h1 expression was closely linked to ecdysone dependent signaling: Kr-h1 was first regulated by usp (ultraspiracle), which dimerized with various ecdysone receptors and then Kr-h1 expression was essential for proper ecdysone patterning in the larval CNS (central nervous system). Together, though Kr-h1could potentially regulate the neurite complexity, it seems primarily involved in the coordinating ecdysone signaling. In conclusion, the powerful genetic toolkit available in the Drosophila has allowed the investigation in the molecular mechanisms of neuronal morphogenesis and understanding of these mechanisms will enhance our understanding of how the complex nervous system is wired to perform the delicate behaviors.

Neurons comprise the main information processing cells of the nervous system. To integrate and transmit information, neurons elaborate dendritic structures to receive input and axons to relay that information to other cells. Due to their intricate structures, dendrites and axons are susceptible to damage whether by physical means or via disease mechanisms. Studying responses to axon injury, called Wallerian degeneration, in the neuronal processes of Drosophila melanogaster has allowed the identification of genes that are required for injury responses. Screens in Drosophila have identified dsarm and highwire as two genes required for axon degeneration; when these genes are mutated axons fail to degenerate after injury, even when completely cut off from the neuronal cell body. We found that these genes are also required for dendrite degeneration after injury in vivo. Further, we reveal differences between axon and dendrite injury responses using in vivo timelapse recordings and GCaMP indicators of intracellular and mitochondrial calcium transients. These data provide insights into the neuronal responses to injury, and better define novel targets for the treatment of neurodegenerative diseases.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Lors de leur différenciation, les neurones développent deux types de prolongements cytoplasmiques, dendrites et axones. L'élaboration de ces prolongements est médiée par les éléments du cytosquelette, plus particulièrement, les microtubules et les microfilaments d'actine (actine-F). L'expression de la protéine associée aux microtubules-2 (MAP-2) est nécessaire au développement des neurites mineures, les premiers prolongements cytoplasmiques émis par un neurone. Ceux-ci n'ont pas une identité dendritique ou axonale. Par la suite, l'expression de MAP2 est nécessaire au développement et au maintien des dendrites. L'expression de MAP2 est régulée par épissage alternatif au cours de la différenciation neuronale. Il existe quatre isoformes de la protéine MAP2, MAP2a, MAP2b, MAP2c et MAP2d. MAP2b et MAP2c sont les isoformes les mieux caractérisées. Elles peuvent être subdivisées en deux domaines: un domaine de liaison aux microtubules situé en C-terminal et un domaine de projection en N-terminal. Le domaine de liaison aux microtubules est responsable de l'interaction de MAP2 avec les microtubules alors que le rôle du domaine de projection n1est toujours pas clairement défini. MAP2c est exprimée dans les neurones immatures alors que MAP2b est présente dans les neurones immatures et matures. Dans les neurones immatures, ces deux isoformes se retrouvent dans les neurites mineures et elles sont ciblées préférentiellement dans les dendrites au cours de la différenciation neuronale. Le rôle respectif de MAP2b et MAP2c dans l'élaboration de prolongements cytoplasmiques par un neurone demeure inconnu. MAP2b et MAP2c diffèrent par la présence d'une séquence additionnelle de 1372 acides aminés dans le domaine de projection de MAP2b. L'insertion d'une séquence aussi importante dans le domaine de projection de MAP2b indique que ce domaine joue un rôle important. Le but de la présente étude consiste à mieux comprendre le rôle de cette séquence dans la fotmation de prolongements cytoplasmiques. Pour cette analyse fonctionnelle, nous avons produit six formes tronquées de MAP2b qui contiennent des délétions dans le domaine de projection de MAP2b. Ces formes tronquées de MAP2b ont été exprimées dans les cellules ovariennes Spodoptera frugiperda (Sf9). En effet, ce système cellulaire est très intéressant puisque nous avons démontré que l'expression de MAP2b et MAP2c dans ces cellules résulte en la formation de prolongements cytoplasmiques. Cependant, ces deux isoformes de MAP2 induisent des patterns distincts de formation de prolongements cytoplasmiques. 60% des cellules qui expriment MAP2c développent des prolongements alors que 14% des cellules qui expriment MAP2b ont des prolongements. De plus, les cellules qui expriment MAP2c ont la tendance à développer des prolongements multiples alors que celles qui expriment MAP2b présentent un seul prolongement. Nos présents résultats démontrent que le domaine de projection de MAP2b a un effet inhibiteur sur la capacité du domaine de liaison aux microtubules à induire la formation de prolongements cytoplasmiques. En effet, 53% des cellules qui n'expriment que le domaine de liaison aux microtubules ont des prolongements en comparaison à 14% des cellules qui expriment MAP2b. De plus, l'expression de trois formes tronquées de MAP2b qui ont une délétion partielle de la séquence additionnelle de 1372 acides aminés induit un plus grand pourcentage de cellules avec prolongements (27%, 31 % et 41 % ). Toutefois, la séquence commune à MAP2c et MAP2b qui est située à l'extrémité 5' du domaine de projection semble favoriser la formation de plusieurs prolongements puisque sa délétion résulte en un plus faible pourcentage de cellules avec des prolongements multiples. Nos résultats suggèrent donc que l'insertion de la séquence additionnelle de 1372 acides aminés dans le domaine de projection de MAP2b diminue sa capacité à induire la formation de prolongements cytoplasmiques. Étant donné que MAP2b et MAP2c sont capables de se lier à l'actine-F et aux microtubules, nous avons examiné la distribution de ces deux éléments du cytosquelette dans les cellules Sf9 qui expriment les différentes formes tronquées de MAP2b. Toutes les formes tronquées de MAP2b induisent la formation de faisceaux de microtubules à l'exception des formes tronquées qui correspondent aux domaines de projection de MAP2c et de MAP2b. Dans les cellules qui présentent des prolongements, on note une réorganisation de l'actine-F. Dans les cellules qui expriment la forme mutante correspondant au domaine de projection de MAP2b, l'actine-F est distribuée sous forme d'un anneau sous la membrane plasmique. De plus, le domaine de projection a une distribution similaire. Ceci suggère que le domaine de projection de MAP2b interagit avec l'actine-F. Donc la séquence additionnelle de 13 72 acides aminés pourrait contenir un domaine de liaison à l'actine. En conclusion, nos résultats indiquent que MAP2b aurait une moins grande capacité que MAP2c à promouvoir la formation de neurites mais elle pourrait contribuer à leur stabilisation au cours de la différenciation neuronale par le fait qu'elle contient des domaines additionnels de liaison à l'actine.

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