Interactions of cells with their chemical microenvironments are critical to many polarized processes, including differentiation, migration, and pathfinding. To investigate such cellular events, tools are required that can rapidly reshape the microscopic chemical landscapes presented to cultured cells. Existing chemical dosing technologies rely on use of pre-fabricated chemical gradients, thus offering static cell-reagent interactions. Such interactions are particularly limiting for studying migration and chemotaxis, during which cells undergo rapid changes in position, morphology, and intracellular signaling. This dissertation describes the use of laminar streams, containing cellular effector molecules, for precise delivery of effectors to selected subcellular regions. In this approach, cells are grown on an ultra-thin polymer membrane that serves as a barrier to an underlying reagent reservoir. By using a tightly-focused pulsed laser beam, micron-diameter pores can be ablated in the membrane upstream of desired subcellular dosing sites. Emerging through these pores are well-defined reagent streams, which dose the targeted regions. Multiple pores can be ablated to allow parallel delivery of effector molecules to an arbitrary number of targets. Importantly, both the directionality and the composition of the reagent streams can be changed on-the-fly under a second to present dynamically changing chemical signals to cells undergoing migration. These methods are applied to study the chemotactic responses of neutrophil precursor cells. The subcellular localization of the chemical signals emerging through pores is found to influence the morphological evolution of these motile cells as they polarize and migrate in response to rapidly altered effector gradients. / text

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / IntroduÃÃo:O prÃ-condicionamento isquÃmico (PCI) vem sendo considerado como um potente mecanismo endÃgeno capaz de inibir a resposta inflamatÃria. A migraÃÃo de neutrÃfilos (mn) à um evento central no desenvolvimento da reaÃÃo inflamatÃria. Nosso grupo tem demonstrado que o PCI inibe a mn em modelos experimentais, entretanto os mecanismos e mediadores envolvidos ainda nÃo sÃo conhecidos.Objetivo:Estudar a participaÃÃo dos mediadores Ãxido nÃtrico e MonÃxido de carbono, proteÃnas de adesÃo (ICAM-1 e &#946;2-integrina) e da expressÃo de CXCR2 no efeito inibitÃrio do PCI a distÃncia sobre a mn. MÃtodos:O modelo de PCI a distÃncia foi realizado com um torniquete no membro posterior direito de camundongos durante 10 minutos seguidos de 30 de reperfusÃo. ParticipaÃÃo do NO e CO foi investigada atravÃs de inibidores de iNOS (1400 W, 3 mg/kg ou Aminoguanidina (Amg), 50 mg/kg) e HO-1 (ZnPPIX, 10 mg/kg) como prÃ-tratamento de 30 min. Posteriormente, induziu-se peritonite comCarragenina(Cg) (500 mg /cav). Quatro horas apÃs, a cavidade peritoneal (cp) era lavada e leucÃcitos eram contados. ApÃs aquele mesmo procedimento, os animais foram submetidos a microscopia intravital (miv) para avaliar os efeitos do NO e CO nas vÃnulas mesentÃricas de 3 ordem.NeutrÃfilos de animais prÃ-condicionados e prÃ-tratados ou nÃo, foram utilizados para o ensaio de quimiotaxiain vitro, usandocomo estÃmulo a quimiocina KC(30ng/ml). AexpressÃo de CXCR2 e GRK2 dos neutrÃfilos foi determinada por citometria de fluxo e imunofluorescÃncia, respectivamente.AsparticipaÃÃes de ICAM-1/CD54 e &#946;2-integrina/CD11b foram investigadas em camundongos nocautes para os genes dessas molÃculas. A mn nesses animais foi avaliada segundo protocolo jà descrito pelo lavado peritonela.Na investigaÃÃo do papel do NO e CO na modulaÃÃo da proteÃna de adesÃo celular (&#946;2-integrina), utilizou-se inibidores da iNOS (1400W, 3 mg/kg ou Amg, 50 mg/kg, sc), HO-1 (ZnPPIX, 10 mg/kg, sc) eGuanilato Ciclase (ODQ (5 Âmol/kg, ip)) em prÃ-tratamento de 30 min antes do PCI. ApÃs peritonite, o sangue foi colhido e a expressÃo de CD11bem neutrÃfilos foi determinada por citometria de fluxo. Para anÃlise estatÃstica, utilizou-se ANOVA/Bonferroni. P<0,05 foi aceito. Resultados:Os inibidores de CO e NO preveniram o efeito inibitÃrio do PCIsobre a mn (p <0,05). AlÃm disso, os neutrÃfilos de animais prÃ-condicionados apresentaram reduÃÃo de quimiotaxia (p <0,05),achado que se correlacionou com a diminuiÃÃo da expressÃode CXCR2 na membrana dos neutrÃfilos (p <0,05) e comaumento da expressÃo de GRK2. NÃo houve alteraÃÃo da quimiotaxia, nem da expressÃo de GRK2 quando os neutrÃfilos foram obtidos a partir de animais prÃ-condicionados e prÃ-tratados com inibidores de de CO, NO e GCs. Os animais prÃ-condicionados apresentaram reduÃÃo nos neutrÃfilos circulantes e da aderÃnciana miv, as quais foram prevenidas pelo prÃ-tratamento com os inibidores (p <0,05). O efeito inibitÃrio do PCI persistiu em animais nocautes para &#946;2-integrina, o que nÃo se observou nos animais nocautes para ICAM-1. AlÃm disso, os neutrÃfilos de animais prÃ-condicionados apresentaram reduÃÃo significativa na expressÃo de CD11b, que foi prevenida nos animais prÃ-tratados com os inibidores de iNOS, HO-1 e GCs.ConclusÃes: Os resultados sugerem que o NO e CO atuam no efeito inibitÃrio do PCI via iNOS e HO-1 em sitio distante, modulando ICAM-1, &#946;2-integrina e CXCR2 via GRK2. / Introduction: Ischemic preconditioning (IPC) has been considered as a potent endogenous mechanism capable of inhibiting the inflammatory response. The migration of neutrophils (mn) is a central event in the development of inflammation. Our group has demonstrated that PCI inhibits mn in experimental models, however the mechanisms and mediators involved are not yet known. Aim: To study the involvement of mediators nitric oxide and carbon monoxide, adhesion proteins (ICAM-1 and &#946;2-integrin) and expression of CXCR2 in the inhibitory effect of PCI on the distance min. Methods: The model of distance PCI was performed with a tourniquet in the right hind limb of mice for 10 minutes followed by 30 reperfusion. Involvement of NO and CO was investigated using inhibitors of iNOS (1400 W, 3 mg/kg or aminoguanidine (Amg), 50 mg/kg) and HO-1 (ZnPPIX, 10 mg/kg) as pretreatment 30 min. Later, peritonitis was induced by carrageenan (Cg) (500 mg/cav). Four hours later the peritoneal cavity (pc) was washed and leukocytes were counted. After that same procedure, the animals were subjected to intravital microscopy (IVM) to evaluate the effects of NO and CO in the mesenteric venules of 3rd order. Neutrophils from animals preconditioned and pre-treated or untreated, were used for testing chemotaxis in vitro, using the stimulus to chemokine KC (30ng/ml). The expression of GRK2 and CXCR2 in neutrophils was determined by flow cytometry and immunohistochemistry, respectively. The stakes and ICAM-1/CD54 &#946;2-integrina/CD11b been investigated in knockout mice for genes of these molecules. The mn in these animals was evaluated according to protocol previously described by washed peritonela. In the investigation of the role of NO and CO in the modulation of cell adhesion protein (&#946;2-integrin), we used iNOS inhibitor (1400W, 3 mg/kg or Amg, 50 mg/kg, sc), HO-1 (ZnPPIX, 10 mg/kg, sc) and guanylate cyclase (ODQ (5 Âmol/kg, ip)) in pre-treatment 30 min before PCI. After peritonitis, blood was collected and the expression of CD11b on neutrophils was determined by flow cytometry. For statistical analysis, we used ANOVA/Bonferroni. P<0,05 was accepted. Results: The CO and NO inhibitors prevented the inhibitory effect of PCI on mn (P<0,05). Moreover, neutrophils from animals preconditioned showed reduced chemotaxis (p<0,05), a finding that correlated with decreased expression of CXCR2 in the membrane of neutrophils (p<0,05) and increased expression of GRK2. There was no change in chemotaxis or the expression of GRK2 when neutrophils were obtained from animals pre-conditioned and pretreated with inhibitors of CO, NO and sGC. Preconditioned animals showed a reduction in circulating neutrophils and the grip on IVM, which were prevented by pretreatment with inhibitors (P<0,05). The inhibitory effect of PCI was shown in knockout animals for &#946;2-integrin, which was not observed in the knockout animals to ICAM-1. Moreover, neutrophils from animals preconditioned showed a significant reduction in the expression of CD11b, which was prevented in animals pretreated with inhibitors of iNOS, HO-1 and GCs. Conclusions: The results suggest that NO and CO act in the inhibitory effect of PCI via iNOS and HO-1 in place apart by modulating ICAM-1, &#946;2-integrin and CXCR2 via GRK2.

O recrutamento de neutrófilos para o sítio da infecção é um evento crucial para o combate aos microrganismos e sobrevivência na sepse. A migração destes polimorfonucleares é dirigida através de um gradiente quimiotático por meio do reconhecimento de quimiocinas por receptores acoplados a proteína G (GPCRs), os quais são regulados por quinases específicas (GRKs). Estudos prévios demonstraram que na sepse ocorre uma falência na migração de neutrófilos para o foco infeccioso em função da dessensibilização de receptores quimiotáticos via GRKs induzida pela ativação de receptores toll-like (TLRs), TLR2 e TLR4. Apesar de a ausência de TLR9 em células dendriticas ter sido relacionada a maior sobrevivência de camundongos sépticos, o papel do TLR9 atuando diretamente em neutrófilos não foi avaliado. Objetivando preencher esta lacuna, propôs-se avaliar o papel direto de TLR9 na falência de migração de neutrófilos na sepse. Os camundongos TLR9-/- apresentaram maior sobrevivência a sepse polimicrobiana avaliada por meio do modelo de ligadura e perfuração do ceco (CLP). A deficiência de TLR9 também acarretou em aumento na migração de neutrófilos para o foco da infecção, menor seqüestro de neutrófilos no pulmão, bem como, menor número de bactérias no lavado peritoneal e sangue. A ativação de TLR9 por oligodeoxinucleotídeo contendo o dinucleotídeo CpG não metilado (ODN CpG) nos neutrófilos reduziu a quimiotaxia destes em direção a quimiocina CXCL2 e expressão do receptor quimiotático CXCR2. Além disso, neutrófilos estimulados com ODN CpG apresentaram aumento na expressão da quinase tipo 2 relacionada a receptores acoplados a proteína G (GRK2). Dessa forma, a ativação de TLR9 em neutrófilos circulantes no sangue é prejudicial na sepse por reduzir a quimiotaxia destes para o foco da infecção ao induzir a dessensibilização de CXCR2 via GRK2. / The recruitment of neutrophils to the site of infection is a crucial event for combating the microorganisms and survival on sepsis. The neutrophil migration is directed by a chemotactic gradient through the recognition of chemokines by G protein-coupled receptors (GPCRs), which are regulated by specific kinases (GRKs). Previous studies have shown a failure of neutrophil migration into infectious focus on sepsis due to chemotactic receptor desensitization via GRKs induced by activation of toll- like receptors (TLRs), TLR2 and TLR4. Despite the absence of activation of TLR9 in dendritic cells have been related to increase survival of septic mice, the role of TLR9 acting directly on neutrophils was not evaluated. We proposed to verify the direct role of TLR9 in the failure of neutrophil migration on sepsis. The TLR9 knockout mice (TLR9-/-) showed high survival to polymicrobial sepsis using cecal ligation and puncture model (CLP). TLR9-/- mice had high neutrophil migration to the focus of infection, low neutrophil sequestration in the lung, as well as, few bacteria in the peritoneal exudates and blood. The activation of TLR9 by oligodeoxinucleotide containing unmethylated dinucleotide CpG (CpG ODN) in neutrophils also reduced chemotaxis toward CXCL2 and the expression of chemokine receptor CXCR2. In addition, neutrophils stimulated with CpG ODN showed increased expression of kinase-related G protein-coupled receptor type 2 (GRK2). Thus, the activation of TLR9 in blood circulating neutrophils is harmful on sepsis by reducing their chemotaxis into the site of the infection by inducing CXCR2 desensitization via GRK2.

O recrutamento de neutrófilos para o sítio da infecção é um evento crucial para o combate aos microrganismos e sobrevivência na sepse. A migração destes polimorfonucleares é dirigida através de um gradiente quimiotático por meio do reconhecimento de quimiocinas por receptores acoplados a proteína G (GPCRs), os quais são regulados por quinases específicas (GRKs). Estudos prévios demonstraram que na sepse ocorre uma falência na migração de neutrófilos para o foco infeccioso em função da dessensibilização de receptores quimiotáticos via GRKs induzida pela ativação de receptores toll-like (TLRs), TLR2 e TLR4. Apesar de a ausência de TLR9 em células dendriticas ter sido relacionada a maior sobrevivência de camundongos sépticos, o papel do TLR9 atuando diretamente em neutrófilos não foi avaliado. Objetivando preencher esta lacuna, propôs-se avaliar o papel direto de TLR9 na falência de migração de neutrófilos na sepse. Os camundongos TLR9-/- apresentaram maior sobrevivência a sepse polimicrobiana avaliada por meio do modelo de ligadura e perfuração do ceco (CLP). A deficiência de TLR9 também acarretou em aumento na migração de neutrófilos para o foco da infecção, menor seqüestro de neutrófilos no pulmão, bem como, menor número de bactérias no lavado peritoneal e sangue. A ativação de TLR9 por oligodeoxinucleotídeo contendo o dinucleotídeo CpG não metilado (ODN CpG) nos neutrófilos reduziu a quimiotaxia destes em direção a quimiocina CXCL2 e expressão do receptor quimiotático CXCR2. Além disso, neutrófilos estimulados com ODN CpG apresentaram aumento na expressão da quinase tipo 2 relacionada a receptores acoplados a proteína G (GRK2). Dessa forma, a ativação de TLR9 em neutrófilos circulantes no sangue é prejudicial na sepse por reduzir a quimiotaxia destes para o foco da infecção ao induzir a dessensibilização de CXCR2 via GRK2. / The recruitment of neutrophils to the site of infection is a crucial event for combating the microorganisms and survival on sepsis. The neutrophil migration is directed by a chemotactic gradient through the recognition of chemokines by G protein-coupled receptors (GPCRs), which are regulated by specific kinases (GRKs). Previous studies have shown a failure of neutrophil migration into infectious focus on sepsis due to chemotactic receptor desensitization via GRKs induced by activation of toll- like receptors (TLRs), TLR2 and TLR4. Despite the absence of activation of TLR9 in dendritic cells have been related to increase survival of septic mice, the role of TLR9 acting directly on neutrophils was not evaluated. We proposed to verify the direct role of TLR9 in the failure of neutrophil migration on sepsis. The TLR9 knockout mice (TLR9-/-) showed high survival to polymicrobial sepsis using cecal ligation and puncture model (CLP). TLR9-/- mice had high neutrophil migration to the focus of infection, low neutrophil sequestration in the lung, as well as, few bacteria in the peritoneal exudates and blood. The activation of TLR9 by oligodeoxinucleotide containing unmethylated dinucleotide CpG (CpG ODN) in neutrophils also reduced chemotaxis toward CXCL2 and the expression of chemokine receptor CXCR2. In addition, neutrophils stimulated with CpG ODN showed increased expression of kinase-related G protein-coupled receptor type 2 (GRK2). Thus, the activation of TLR9 in blood circulating neutrophils is harmful on sepsis by reducing their chemotaxis into the site of the infection by inducing CXCR2 desensitization via GRK2.