No description available.

Th. 3e cycle--Pharm.--Paris 5, 1982. N°: 35.

Dans le but d'obtenir des composés originaux ayant une activité inhibitrice envers la NE, des triazoles et des 2-aminofuranes diversement substitués ont été synthétisés. Une réaction de "click chemistry" catalysée par le cuivre entre un azide et un alcyne a été appliquée pour la synthèse des triazoles. La synthèse des composés de type 2-aminofuranes est basée sur l'attaque nucléophile d'un isonitrile sur un γ-oxo butynoate d'alkyle en présence d'un aldéhyde aromatique.Les tests biologiques ont été réalisés tout au long de la thèse. Les composés présentant les meilleures IC50 envers la NE ont été sélectionnées pour une évaluation en terme de sélectivité vs les autres sérines protéases du PN (la cathepsine G et la protéinase 3). Enfin, les meilleurs inhibiteurs ont subi une évaluation de leur activité anti-oxydante selon deux méthodes: méthode au DPPH (1,1-diphényl-2-picryl-hydrazyl) et méthode au thiocyanate ferrique. / To prepare new compounds with an inhibitory activity towards NE, diversely substituted triazoles and 2-aminofuranes were synthesized. Triazoles were obtained using the copper catalyzed "click chemistry" between an azide and an alkyne. The synthesis of 2-aminofuranes is based on the nucleophilic attack of an isonitrile on an alkyl γ-oxo-butynoate in the presence of an aromatic aldehyde.Biological assays were carried out throughout the thesis. Compounds owning the best IC50 towards NE were selected for evaluation in terms of selectivity vs the two other serine-proteases of the PN (cathepsin G and proteinase 3). Finally, evaluation of antioxidant activity of the best compounds was achieved using by two approachs: DPPH (1,1-diphenyl -2-picrylhydrazyl) method and ferric thiocyanate method.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Humane neutrophile Granulozyten spielen eine wichtige Rolle in der Immunabwehr invasiver Infektionen durch die humanpathogenen Pilze Candida albicans und Aspergillus fumigatus. Das Ziel der hier vorliegenden Arbeit bestand in einer Charakterisierung der Interaktion beider Pilzspezies mit neutrophilen Granulozyten, mit Fokussierung auf die unterschiedlichen Effektormechanismen dieser Zellen. C. albicans exprimiert eine Reihe von Aspartatproteasen, welche mit der Virulenz des Erregers assoziiert sind und zu Adhäsion, Gewebeinvasion und Immunevasion beitragen können. In dieser Arbeit wurde die Rolle der Aspartatproteasen Sap1-6, Sap9 und Sap10 in der Interaktion mit neutrophilen Granulozyten analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass, im Gegensatz zu anderen Aspartatproteasen, das zelloberflächenassoziierte GPI-verankerte Enzym Sap9 einen maßgeblichen Einfluss auf die Erkennung von C. albicans durch neutrophile Granulozyten hat. SAP9-Expression ist erforderlich, um die gerichtete Motilität (Chemotaxis) neutrophiler Granulozyten zu C. albicans-Keimschläuchen hin zu induzieren. Dieser Prozess stellt eine Grundvoraussetzung zur effektiven Aktivierung neutrophiler Granulozyten darstellt. Die Chemotaxis neutrophiler Granulozyten kann durch autologe Sekretion des Zytokins IL-8 verstärkt werden. Es konnte jedoch kein Einfluss von SAP9 auf die IL-8 Sekretion beobachtet werden. Allerdings führte die Deletion von SAP9 zu reduzierter Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies (engl. reactive oxygen species, ROS) in neutrophilen Granulozyten. Die mit der ROS-Generierung in Verbindung stehende und durch C. albicans induzierte Apoptose neutrophiler Granulozyten war ebenfalls vermindert. In Konfrontationsassays war die Abtötung einer SAP9-Deletionsmutante verglichen mit dem Wildtyp reduziert. Die Degranulation stellt neben der Produktion von ROS einen weiteren wichtigen Effektormechanismus zur Abtötung von Mikroben dar, jedoch verlief die Freisetzung von Elastase ebenso unabhängig von SAP9 wie die durch neutrophile Granulozyten ausgelöste Wachstumsinhibition von Keimschläuchen. Die hier präsentierten Daten verbinden die Aktivität der Protease Sap9, der zuvor bereits eine Rolle in der Immunevasion von C. albicans zugeschrieben wurde, mit der Initiation der protektiven angeborenen Immunität. Wie C. albicans stimuliert auch A. fumigatus die Aktivität der neutrophilen Granulozyten. Microarray- Analysen mit Fokus auf dem Zytokinprofil neutrophiler Granulozyten während der Interaktion mit A. fumigatus-Hyphen offenbarten, dass nur wenige Zytokine im Lauf der Infektion hochreguliert wurden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Sap-Granulozyten-Interaktion neue molekulare Mechanismen zur Aktivierung dieser Zellen birgt. Zudem brachten die Microarray Analysen die Erkenntnis, dass die de novo-Zytokinsynthese durch A. fumigatus nur geringfügig beeinflusst wird und eine schnelle Abtötung des Pilzes offenbar im Vordergrund steht. / Human polymorphonuclear neutrophils (PMNs) play a major role in the immune defence against invasive infections caused by the pathogenic fungi Candida albicans and Aspergillus fumigatus. The aim of this work was to further characterize the interaction of both fungi with PMNs with a focus on diverse PMN effector functions. C. albicans expresses a set of aspartic proteases which are associated with virulence and can contribute to adhesion, tissue invasion and immune evasion. Here, the role of the aspartic proteases Sap1-6, Sap9 and Sap10 in the interaction with human neutrophils was analysed. It could be demonstrated that, in contrast to other aspartic proteases, the cell surface associated GPI-anchored enzyme Sap9 has a major impact on recognition of C. albicans by PMNs. SAP9 expression is required for the effective induction of PMN chemotaxis towards C. albicans filaments, an essential prerequisite of effective PMN activation. Targeted motility can be enhanced by autologous secretion of IL-8, but no influence of SAP9 on the process of IL-8 secretion could be observed here. However, deletion of SAP9 led to a mitigated release of reactive oxygen intermediates (ROI) in human PMNs. Likewise, C. albicans induced apoptosis triggered by ROI formation was decreased. In confrontation assays, killing of a SAP9 deletion mutant was reduced in comparison to the wild-type. Beside ROI production, degranulation represents an additional important effector mechanism contributing to microbial killing, however, the release of elastase in response to C. albicans was found to be not dependent on SAP9, as well as the PMN-mediated growth inhibition of germ tubes. The data presented here clearly implicate Sap9 protease activity, which was already attributed to immune evasion before, with the initiation of protective innate immunity. Like C. albicans, A. fumigatus evokes PMN antifungal activity. Custom-made microarray analyses focusing on the cytokine profile of PMNs during interaction with A. fumigatus hyphae revealed that only few cytokines are upregulated during the course of infection. In summary it could be demonstrated that the interaction between Saps and PMNs is revealing novel molecular mechanisms which lead to an activation of these cells. Furthermore, microarray analyses lead to the awareness that de novo cytokine synthesis of PMNs is barely influenced by A. fumigatus, pointing out that instant killing of the fungus might be of higher importance.

L’élimination des polynucléaires neutrophiles (PN) du site inflammatoire est nécessaire à la résolution de l’inflammation. Lors de cette phase, les PN s’engagent massivement vers l’apoptose et sont phagocytés par les macrophages. Dans certaines pathologies inflammatoires comme le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA), un défaut des mécanismes d’apoptose des PN est associé à la persistance de l’inflammation et à un mauvais pronostic. GILZ (Glucocorticoid-induced leucine zipper) est une protéine possédant des propriétés anti-inflammatoires, basées principalement sur l’inhibition des facteurs de transcription, comme NF-кB (nuclear factor-kappa B) et AP-1 (activator protein-1). GILZ module également la survie des cellules hématopoïétiques, en favorisant ou retardant l’apoptose selon le type cellulaire étudié. L’objectif de ce travail a été d’évaluer le rôle de GILZ dans les fonctions et l’apoptose du PN lors de l’inflammation. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés aux situations physiopathologiques dans lesquelles GILZ pouvait être exprimé et plus spécifiquement dans le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA). Cette pathologie a retenu notre attention pour le caractère systémique de l’inflammation et surtout pour le rôle prépondérant que jouent les neutrophiles dans ce syndrome. Dans le cadre d’une étude clinique prospective menée à l’hôpital Bichat, nous avons pu montrer une plus forte expression de GILZ au niveau transcriptionnel et protéique dans des neutrophiles circulants de patients souffrant de SDRA.Dans la deuxième partie du travail, nous avons évalué le rôle de GILZ dans les fonctions et le phénotype des PN. En utilisant la lignée PLB-985 différenciée en neutrophiles par addition d’acide rétinoïque (ATRA) et de diméthylformamide (DMF), nous avons mis en évidence in vitro que la surexpression de GILZ dans ce modèle de polynucléaires neutrophiles favorisait l’apoptose de ces cellules. Cette apoptose est dépendante des caspases, implique la voie mitochondriale et s’explique notamment par une diminution de l’expression de Mcl-1 (myeloid cell leukemia-1), alors que l’expression des ARNm de mcl-1 n’est pas affectée. Une activation prolongée de JNK (c-JUN N-terminal kinase) serait impliquée et entraînerait la phosphorylation de Mcl-1 et sa dégradation par le protéasome. Ces deux résultats laissent entrevoir un rôle potentiel de GILZ dans la résolution de l’inflammation in vivo. Pour adresser cette question, nous mettons en place le modèle de l’ALI (Acute Lung Injury) ou inflammation pulmonaire aiguë induite par le LPS (lipopolysaccharide), qui est un modèle murin du SDRA. Nous utilisons des souris dans lesquelles l’expression de GILZ a été invalidée spécifiquement dans les neutrophiles. Cette approche nous permettra de mieux comprendre le rôle de GILZ dans la résolution de l’inflammation. GILZ pourrait ainsi représenter une cible thérapeutique dans les pathologies inflammatoires impliquant le PN. / Elimination of polymorphonuclear neutrophils (PN) from inflammatory site is a necessary step in the resolution of inflammation, where PN undergo massive apoptosis and are phagocyted by macrophages. In some inflammatory disorders, such as acute respiratory distress syndrome (ARDS), defective apoptosis of neutrophils was described and related to persistent inflammation and poor prognosis. GILZ (Glucocorticoid-induced leucine zipper) is a potent anti-inflammatory protein, mainly through inhibition of NF-кB (nuclear factor-kappa B) and AP-1 (activator protein-1) transcription factors. Moreover, GILZ modulates hematopoietic cells survival, either by preventing or inducing their apoptosis. The overall objective of this work has been to evaluate the role of GILZ in neutrophils functions and apoptosis during inflammation. First, we sought pathophysiological situations where GILZ could be expressed. ARDS caught our attention because of the systemic nature of inflammation and the prominent role of neutrophils. A prospective clinical study was conducted at Bichat hospital and showed a higher GILZ expression at protein and transcriptional levels in blood neutrophils of ARDS patients.Secondly, we evaluated the role of GILZ in neutrophils functions and phenotypes. Using the PLB-985 cell line induced towards the neutrophil lineage using all trans retinoic acid (ATRA) and dimethylformamid (DMF), we evidenced that GILZ over-expression promoted exacerbated apoptosis of these cells. This apoptosis was caspase-dependent, involved the mitochondrial pathway and was explained, at least in part, by a diminution of myeloid cell leukemia-1 (Mcl-1) expression, whereas mcl-1 mRNA levels were not affected. A sustained activation of c-Jun N-terminal kinases (JNK) could be involved and lead to Mcl-1 phosphorylation and subsequent degradation by the proteasome machinery.Altogether, these results suggest a potential role of GILZ in the resolution of inflammation in vivo. To address this question, we currently develop an acute lung injury (ALI) model induced by lipopolysaccharides, which mimics the septic component of ARDS. This model will be implemented in mice invalidated for GILZ specifically in neutrophils. This approach should allow a better understanding of the role of GILZ in the resolution of inflammation. In the future, GILZ could represent a therapeutical target in inflammatory diseases involving neutrophils.

La production de cytokines et chimiokines par les polymorphonucléaires (PMN) est une fonction importante dans la réponse inflammatoire. La phagocytose et la migration, ainsi que d’autres fonctions des PMN changent en milieu hypoxique. II est bien connu que la régulation par l’hypoxie dépend principalement de l'activation du facteur de transcription HIF, cependant, l’effet de l’hypoxie sur la production des cytokines n’est pas encore établi. Notre hypothèse est que l’hypoxie change le profil de production des cytokines et chimiokines dans les neutrophiles humains en réponse aux agonistes en impliquant HIF. Dans ce travail, nous avons tout d’abord démontré que les PMN expriment constitutivement HIF-2? et HIF-3?. De plus, les agonistes G-CSF, GM-CSF, TNF? ou LPS augmentent l’expression de HIF-1? en hypoxie. D’autre part, nous avons démontré que l’hypoxie seule induit la sécrétion de TNF? et MIP-3a et modifie les niveaux des MIP-1?/1?, IL-8 et MIP-3? produites en réponse au GM-CSF, LPS et PGN. Ceci suggère que l'hypoxie oriente la production des cytokines dans les PMN de façon dépendante du stimulus et témoigne d’une mobilisation des voies de signalisation et des facteurs de transcription différente de celle connue en normoxie. Par la suite, nous avons étudié les mécanismes qui pourraient être à l’origine de ces modifications tels que la voie des MAPK p42/p44, STAT3, ERK, JNK et C/EBP-?. D’autre part, nous avons montré que la production inédite d’IL-8 par G-CSF en hypoxie dépend de STAT3 et p38 et que cette production met en jeu l'action autocrine des cytokines endogènes IL-18, IL-1ra et TNF?. De plus, l’utilisation d’une lignée cellulaire PLB-985 différenciée en PMN portant une mutation sur les sites consensus du NF-?B ou HIF, nous a permis de démontrer que non seulement l’hypoxie seule ou associé au G-CSF, GMCSF, TNF? ou au LPS régule l’activité de ce promoteur, mais le HIF régule aussi cette activité en normoxie. Finalement, les travaux présentés dans ce mémoire démontrent que l’hypoxie modifie l’expression et la production des cytokines par les neutrophiles humains de façon différente de la normoxie. Si le rôle crucial des neutrophiles dans l’inflammation physiologique et pathologique basé sur leur production des cytokines a été largement documenté en normoxie, il est primordial de réaliser des études pour approfondir ce rôle en considérant l’effet de l’hypoxie. [symboles non conformes]

Les neutrophiles contribuent à l'inflammation protectrice et pathologique. Ce projet de thèse consiste à déterminer le rôle des neutrophiles dans des modèles d'inflammation systémique graves et potentiellement mortelles, induite par le lipopolysaccharide (LPS, endotoxémie) ou par des complexes immuns antigène-anticorps (anaphylaxie). L'anaphylaxie est une réaction allergique qui peut être IgE- et/ou IgG-dépendante. L’endotoxémie est un modèle pertinent de l'inflammation au cours de maladies graves. Pour étudier les neutrophiles in vivo, nous avons utilisé un nouveau modèle murin de neutropénie inductible. Nous montrons que les neutrophiles et la Myélopéroxidase qu’ils produisent ont un rôle protecteur dans le choc endotoxique, indépendamment de l'environnement microbiologique. A l'inverse, les neutrophiles peuvent contribuer à l'anaphylaxie induite par les IgG chez la souris. Comme les récepteurs pour les IgG (FcγR) murins sont très différents des humains, nous avons développé un modèle de souris knock-in dans lequel les FcγR murins a été remplacé par les FcγR humains, activateurs et inhibiteur. Chez ces souris, nous montrons que des IgG humaines peuvent induire une anaphylaxie: le FcγRIIA a un rôle dominant, via l'activation des neutrophiles, et les médiateurs PAF et histamine. En parallèle, nous développons un modèle murin d’anaphylaxie à un curare, le Rocuronium, utilisé en clinique. Au même temps, dans une étude clinique, les résultats d’analyses des échantillons sanguins des patients suspectés d’avoir subi une anaphylaxie au curare soutien notre hypothèse de travail: que l’activation des neutrophiles par des IgG spécifiques est impliquée dans l'anaphylaxie humaine. / Neutrophils are agents of protective and pathological inflammation. This thesis work aimed to determine the role of neutrophils during severe, potentially fatal models of systemic inflammation induced by lipopolysaccharide (LPS, endotoxemia) or by IgG immune complexes (anaphylaxis). Anaphylaxis is a severe allergic reaction that may proceed via IgE- or IgG-dependant pathways. Endotoxemia is a model relevant to inflammation during critical illness. To study neutrophils in vivo, we employed a new mouse model of inducible neutropenia. We found, surprisingly, that neutrophils and neutrophil-derived MPO protect against the severity of endotoxic shock, independently of the microbiological environment, suggesting that neutrophils limit inflammation during endotoxemia. Conversely, neutrophils can contribute to IgG-induced anaphylaxis in mice. As mice and human IgG receptors (FcγR) are very different, we developed a novel mouse strain in which targeted insertion of human FcγR into the murine loci recapitulated hFcγR expression. Herein, using these mice, this work demonstrates that anaphylaxis induced by hIgG proceeds within a native context of activating and inhibitory hFcγRs, and that neutrophil activation via FcγRIIA is a dominant pathological pathway, involving the mediators PAF and histamine. Finally, we describe ongoing development of a mouse model of anaphylaxis in response to Rocuronium, a curare-based neuromuscular blocking agent (NMBA). In addition, as part of a collaborative clinical study we analysed blood samples from patients suspected of NMBA-induced anaphylaxis, finding evidence for the activation of a neutrophil- and IgG-dependent axis during human anaphylaxis.