Le tabagisme demeure le principal contributeur au développement de plusieurs maladies, tel que la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). La MPOC est caractérisée par un déclin des fonctions pulmonaires progressif et peu réversible associé à une inflammation chronique, surtout neutrophilique. Alors que les neutrophiles sont cruciaux pour la défense de l'hôte, le dogme général stipule que l'inflammation pulmonaire induite par l'exposition à la fumée de cigarette est responsable de la destruction pulmonaire. Toutefois, cette thèse propose que les neutrophiles et les processus de l'immunité innée sont plutôt bénéfiques dans le maintien de l'homéostasie pulmonaire en contexte tabagique. Premièrement, nous avons évalué le rôle des neutrophiles dans la régulation de l'inflammation et l'homéostasie du surfactant chez des souris exposées à la fumée de cigarette. Puisque le tabagisme endommage le surfactant pulmonaire, nous avons investigué l'internalisation du surfactant par les neutrophiles. En incubant les cellules du lavage bronchoalvéolaire (LBA) avec du surfactant fluorescent ou en administrant du surfactant marqué par voie intranasale chez des souris exposées à la fumée de cigarette, nous avons observé que les neutrophiles internalisent le surfactant in vitro et in vivo. Afin d'explorer l'impact de l'absence des neutrophiles sur la réponse inflammatoire et sur l'homéostasie du surfactant en contexte tabagique, nous avons administré un anticorps qui déplète les neutrophiles (anti-Gr-1 ou anti-Ly6G) chez les souris. Nous avons constaté que les souris déplétées de leurs neutrophiles pendant l'exposition ont des niveaux plus élevés de cytokines inflammatoires et de protéines de surfactant dans le LBA. De plus, leurs macrophages alvéolaires expriment davantage d'ARNm de Mmp12 qui code pour une métalloprotéinase liée à l'emphysème. Nos résultats démontrent que les neutrophiles participent à la clairance du surfactant et semblent jouer un rôle important dans la régulation de la réponse inflammatoire en contexte tabagique. Notre deuxième objectif visait à investiguer l'impact du statut tabagique sur l'efficacité d'un traitement biologique et l'adaptation pulmonaire à la fumée de cigarette. Alors que l'impact du statut tabagique n'est pas toujours considéré dans les études cliniques en MPOC, quelques études ont observé que l'efficacité des traitements biologiques diffère entre les fumeurs actifs et les ex-fumeurs. En utilisant un modèle d'exposition à la fumée de cigarette répétée, nous avons démontré qu'il existe une adaptation pulmonaire à la fumée de cigarette, menant à une diminution de la neutrophilie et des niveaux de cytokines dans le LBA. Toutefois, l'administration d'un anticorps neutralisant l'IL-1α pendant l'exposition interfère avec cette adaptation et décale la réponse inflammatoire suite à une cessation tabagique (recrudescence de la neutrophilie, augmentation des niveaux de cytokines et augmentation de l'expression de Mmp12). À l'inverse, l'administration du même traitement pendant la cessation tabagique améliore ces paramètres. En tout, ces données indiquent que l'inhibition des voies centrales à la réponse inflammatoire, tel qu'avec l'anti-IL-1α, pendant l'exposition interfère avec l'adaptation alors que le traitement pendant la cessation tabagique encourage la résolution et le retour à l'homéostasie. Finalement, nous voulions atténuer l'inflammation pulmonaire sans interférer avec la défense de l'hôte via l'administration d'un peptide antimicrobien en contexte tabagique. Puisque l'inhibition de la réponse inflammatoire peut augmenter la susceptibilité aux infections chez les patients MPOC, nous avons testé l'efficacité du peptide antimicrobien human β-defensin 2 (hBD-2) à moduler la réponse inflammatoire sans interférer avec la clairance bactérienne en contexte tabagique. Chez les souris exposées à la fumée de cigarette, l'administration de l'hBD-2 a diminué la neutrophilie et la signalisation pro-inflammatoire pulmonaire (analyse biopuce). De plus, dans un modèle d'exacerbation où des souris exposées à la fumée de cigarette ont été infectées avec une bactérie, on note une charge bactérienne moins élevée chez les souris traitées avec l'hBD-2 alors que l'infiltration des neutrophiles est aussi diminuée. Ces données suggèrent que l'hBD-2 pourrait être étudié chez les fumeurs et les patients MPOC puisqu'elle module la neutrophilie tout en supportant la défense de l'hôte. En conclusion, les résultats présentés suggèrent fortement que les neutrophiles et l'immunité innée jouent un rôle complexe, mais crucial, dans le maintien de l'homéostasie pulmonaire en contexte tabagique. Ainsi, dans le développement de thérapie pour la MPOC qui vise la neutrophilie, il faut prendre en considération l'importance des fonctions homéostatiques de l'immunité innée afin de préserver les processus de la défense de l'hôte. / Cigarette smoking remains the major contributor to pulmonary and systemic disease burden worldwide. In particular, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is strongly linked to tobacco smoking and is marked by largely irreversible lung tissue damage and neutrophilic pulmonary inflammation. The general dogma in the field is that inflammatory mediators, reactive oxygen species and proteases secreted by neutrophils during chronic inflammation are at the root of cigarette smoke-induced lung pathology. This thesis argues that neutrophils and the innate immune response play a beneficial role in the maintenance of pulmonary homeostasis during cigarette smoke exposure. Firstly, we sought to evaluate the contribution of neutrophils to pulmonary surfactant and inflammatory homeostasis during cigarette smoke exposure. As phagocytes, we wanted to assess the ability of neutrophils to clear surfactant damaged during cigarette smoke exposure. We treated immune cells from the bronchoalveolar lavage (BAL) fluorescently labeled surfactant or intranasally administered the labeled surfactant in mice and found that neutrophils actively internalize labeled surfactant both in vitro and in vivo in cigarette smoke-exposed mice. Next, we explored the effects of neutrophil depletion on an acute 4-day cigarette smoke exposure model via neutrophil-depleting antibody administration (anti-Ly6G or anti-Gr-1). Neutrophil depletion during cigarette smoking led to dramatically increased pro-inflammatory cytokine and surfactant protein levels in the BAL fluid (BALF). Furthermore, alveolar macrophages expressed elevated levels of Mmp12 mRNA, encoding for a metalloproteinase tightly linked to emphysema. Taken together, these data indicate that neutrophils actively internalize surfactant and seem to play a beneficial role in limiting/resolving the inflammatory response to cigarette smoke exposure. Our second objective was to investigate the impact of treatment timing and smoking status on treatment efficacy in the context of cigarette smoke exposure. Though clinical trials of COPD patients often fail to take smoking status into consideration, some studies have found that the efficacy of biologic treatments and cytokine inhibitors differs greatly based on patient smoking status, favouring either active smokers or ex-smokers. Firstly, we found that repeated exposure to cigarette smoke, where mice were exposed for 2 weeks followed by a 1-week smoking cessation period and then acutely re-exposed for 2 days, led to reduced BAL neutrophilia and cytokine levels compared to mice exposed only for 2 days. Interestingly, we found that administration of anti-IL-1α antibody during cigarette smoke exposure led to delayed inflammation (rebound neutrophilia and increased cytokine levels) as well as elevated Mmp12 expression, while treatment with the same antibody during the smoking cessation period improved these outcomes. These data suggest that neutrophilic inflammation is uncoupled from destructive processes in the lungs and that disruption of the innate immune response via anti-IL-1α during cigarette smoking interferes with pulmonary adaptation; conversely, treatment during smoking cessation effectively hastened inflammatory resolution. Thirdly, we sought to mitigate pulmonary inflammation while supporting host defense during cigarette smoking via treatment with an antimicrobial peptide. Since treatments that mitigate inflammation without interfering with normal host defense would be of great value in COPD, we assessed the effect of the antimicrobial peptide human β-defensin 2 (hBD-2) on the pulmonary response to cigarette smoke exposure. We found that in both acute and chronic mouse models, hBD-2 treatment significantly reduced pulmonary neutrophilia and normalized the expression of several pro-inflammatory signaling pathways in the lungs normally upregulated by cigarette smoke exposure, such as leukocyte migration, as assessed via microarray. To confirm that this reduction in neutrophil count was not associated with increased susceptibility to infection, chronically exposed mice treated with hBD-2 were infected with non-typeable Haemophilus influenzae (NTHi). We found that despite a dramatic reduction in neutrophilia, cigarette smoke-exposed mice administered hBD-2 had reduced bacterial load in the lungs compared to vehicle-treated mice, making it an interesting candidate for future clinical research. In all, the work presented herein strongly suggests that neutrophils and innate immune processes play a crucial role in the maintenance of pulmonary homeostasis during cigarette smoke exposure and that destructive processes in the lungs seem to be uncoupled from pulmonary neutrophilia. Therefore, the development of treatments that specifically target neutrophils should consider the importance of innate immune competence in pulmonary homeostasis and host defense.

L'adénosine, la PGE2 ou l'AMP cyclique intracellulaire mènent toutes à des actions antiinflammatoires chez le neutrophile en inhibant par exemple la phagocytose, la production d'ions superoxydes, l'adhésion et la libération de cytokines. Par contre, les mécanismes moléculaires régulant ces actions anti-inflammatoires ne sont pas bien connus. Dans cette étude, nous avons étudié l'impact que ces agents ont sur le profil d'expression des gènes du neutrophile. L'expression génique a été étudiée par Genechip puis les résultats obtenus ont été validés par la technique du peR en temps réel. Avec cette approche, une quinzaine de gènes dont l'expression était altérée par ces agents ont été identifiés. Remarquablement, les trois agents utilisés ont eu un impact fort similaire sur le profil d'expression, suggérant un mécanisme commun permettant de limiter l'activation cellulaire. Nous avons donc identifié lors de ce projet un ensemble de gènes qui peuvent constituer d'importants signaux d'arrêt de l'activation du neutrophile.

Le tabagisme demeure le principal contributeur au développement de plusieurs maladies, tel que la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). La MPOC est caractérisée par un déclin des fonctions pulmonaires progressif et peu réversible associé à une inflammation chronique, surtout neutrophilique. Alors que les neutrophiles sont cruciaux pour la défense de l'hôte, le dogme général stipule que l'inflammation pulmonaire induite par l'exposition à la fumée de cigarette est responsable de la destruction pulmonaire. Toutefois, cette thèse propose que les neutrophiles et les processus de l'immunité innée sont plutôt bénéfiques dans le maintien de l'homéostasie pulmonaire en contexte tabagique. Premièrement, nous avons évalué le rôle des neutrophiles dans la régulation de l'inflammation et l'homéostasie du surfactant chez des souris exposées à la fumée de cigarette. Puisque le tabagisme endommage le surfactant pulmonaire, nous avons investigué l'internalisation du surfactant par les neutrophiles. En incubant les cellules du lavage bronchoalvéolaire (LBA) avec du surfactant fluorescent ou en administrant du surfactant marqué par voie intranasale chez des souris exposées à la fumée de cigarette, nous avons observé que les neutrophiles internalisent le surfactant in vitro et in vivo. Afin d'explorer l'impact de l'absence des neutrophiles sur la réponse inflammatoire et sur l'homéostasie du surfactant en contexte tabagique, nous avons administré un anticorps qui déplète les neutrophiles (anti-Gr-1 ou anti-Ly6G) chez les souris. Nous avons constaté que les souris déplétées de leurs neutrophiles pendant l'exposition ont des niveaux plus élevés de cytokines inflammatoires et de protéines de surfactant dans le LBA. De plus, leurs macrophages alvéolaires expriment davantage d'ARNm de Mmp12 qui code pour une métalloprotéinase liée à l'emphysème. Nos résultats démontrent que les neutrophiles participent à la clairance du surfactant et semblent jouer un rôle important dans la régulation de la réponse inflammatoire en contexte tabagique. Notre deuxième objectif visait à investiguer l'impact du statut tabagique sur l'efficacité d'un traitement biologique et l'adaptation pulmonaire à la fumée de cigarette. Alors que l'impact du statut tabagique n'est pas toujours considéré dans les études cliniques en MPOC, quelques études ont observé que l'efficacité des traitements biologiques diffère entre les fumeurs actifs et les ex-fumeurs. En utilisant un modèle d'exposition à la fumée de cigarette répétée, nous avons démontré qu'il existe une adaptation pulmonaire à la fumée de cigarette, menant à une diminution de la neutrophilie et des niveaux de cytokines dans le LBA. Toutefois, l'administration d'un anticorps neutralisant l'IL-1α pendant l'exposition interfère avec cette adaptation et décale la réponse inflammatoire suite à une cessation tabagique (recrudescence de la neutrophilie, augmentation des niveaux de cytokines et augmentation de l'expression de Mmp12). À l'inverse, l'administration du même traitement pendant la cessation tabagique améliore ces paramètres. En tout, ces données indiquent que l'inhibition des voies centrales à la réponse inflammatoire, tel qu'avec l'anti-IL-1α, pendant l'exposition interfère avec l'adaptation alors que le traitement pendant la cessation tabagique encourage la résolution et le retour à l'homéostasie. Finalement, nous voulions atténuer l'inflammation pulmonaire sans interférer avec la défense de l'hôte via l'administration d'un peptide antimicrobien en contexte tabagique. Puisque l'inhibition de la réponse inflammatoire peut augmenter la susceptibilité aux infections chez les patients MPOC, nous avons testé l'efficacité du peptide antimicrobien human β-defensin 2 (hBD-2) à moduler la réponse inflammatoire sans interférer avec la clairance bactérienne en contexte tabagique. Chez les souris exposées à la fumée de cigarette, l'administration de l'hBD-2 a diminué la neutrophilie et la signalisation pro-inflammatoire pulmonaire (analyse biopuce). De plus, dans un modèle d'exacerbation où des souris exposées à la fumée de cigarette ont été infectées avec une bactérie, on note une charge bactérienne moins élevée chez les souris traitées avec l'hBD-2 alors que l'infiltration des neutrophiles est aussi diminuée. Ces données suggèrent que l'hBD-2 pourrait être étudié chez les fumeurs et les patients MPOC puisqu'elle module la neutrophilie tout en supportant la défense de l'hôte. En conclusion, les résultats présentés suggèrent fortement que les neutrophiles et l'immunité innée jouent un rôle complexe, mais crucial, dans le maintien de l'homéostasie pulmonaire en contexte tabagique. Ainsi, dans le développement de thérapie pour la MPOC qui vise la neutrophilie, il faut prendre en considération l'importance des fonctions homéostatiques de l'immunité innée afin de préserver les processus de la défense de l'hôte. / Cigarette smoking remains the major contributor to pulmonary and systemic disease burden worldwide. In particular, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is strongly linked to tobacco smoking and is marked by largely irreversible lung tissue damage and neutrophilic pulmonary inflammation. The general dogma in the field is that inflammatory mediators, reactive oxygen species and proteases secreted by neutrophils during chronic inflammation are at the root of cigarette smoke-induced lung pathology. This thesis argues that neutrophils and the innate immune response play a beneficial role in the maintenance of pulmonary homeostasis during cigarette smoke exposure. Firstly, we sought to evaluate the contribution of neutrophils to pulmonary surfactant and inflammatory homeostasis during cigarette smoke exposure. As phagocytes, we wanted to assess the ability of neutrophils to clear surfactant damaged during cigarette smoke exposure. We treated immune cells from the bronchoalveolar lavage (BAL) fluorescently labeled surfactant or intranasally administered the labeled surfactant in mice and found that neutrophils actively internalize labeled surfactant both in vitro and in vivo in cigarette smoke-exposed mice. Next, we explored the effects of neutrophil depletion on an acute 4-day cigarette smoke exposure model via neutrophil-depleting antibody administration (anti-Ly6G or anti-Gr-1). Neutrophil depletion during cigarette smoking led to dramatically increased pro-inflammatory cytokine and surfactant protein levels in the BAL fluid (BALF). Furthermore, alveolar macrophages expressed elevated levels of Mmp12 mRNA, encoding for a metalloproteinase tightly linked to emphysema. Taken together, these data indicate that neutrophils actively internalize surfactant and seem to play a beneficial role in limiting/resolving the inflammatory response to cigarette smoke exposure. Our second objective was to investigate the impact of treatment timing and smoking status on treatment efficacy in the context of cigarette smoke exposure. Though clinical trials of COPD patients often fail to take smoking status into consideration, some studies have found that the efficacy of biologic treatments and cytokine inhibitors differs greatly based on patient smoking status, favouring either active smokers or ex-smokers. Firstly, we found that repeated exposure to cigarette smoke, where mice were exposed for 2 weeks followed by a 1-week smoking cessation period and then acutely re-exposed for 2 days, led to reduced BAL neutrophilia and cytokine levels compared to mice exposed only for 2 days. Interestingly, we found that administration of anti-IL-1α antibody during cigarette smoke exposure led to delayed inflammation (rebound neutrophilia and increased cytokine levels) as well as elevated Mmp12 expression, while treatment with the same antibody during the smoking cessation period improved these outcomes. These data suggest that neutrophilic inflammation is uncoupled from destructive processes in the lungs and that disruption of the innate immune response via anti-IL-1α during cigarette smoking interferes with pulmonary adaptation; conversely, treatment during smoking cessation effectively hastened inflammatory resolution. Thirdly, we sought to mitigate pulmonary inflammation while supporting host defense during cigarette smoking via treatment with an antimicrobial peptide. Since treatments that mitigate inflammation without interfering with normal host defense would be of great value in COPD, we assessed the effect of the antimicrobial peptide human β-defensin 2 (hBD-2) on the pulmonary response to cigarette smoke exposure. We found that in both acute and chronic mouse models, hBD-2 treatment significantly reduced pulmonary neutrophilia and normalized the expression of several pro-inflammatory signaling pathways in the lungs normally upregulated by cigarette smoke exposure, such as leukocyte migration, as assessed via microarray. To confirm that this reduction in neutrophil count was not associated with increased susceptibility to infection, chronically exposed mice treated with hBD-2 were infected with non-typeable Haemophilus influenzae (NTHi). We found that despite a dramatic reduction in neutrophilia, cigarette smoke-exposed mice administered hBD-2 had reduced bacterial load in the lungs compared to vehicle-treated mice, making it an interesting candidate for future clinical research. In all, the work presented herein strongly suggests that neutrophils and innate immune processes play a crucial role in the maintenance of pulmonary homeostasis during cigarette smoke exposure and that destructive processes in the lungs seem to be uncoupled from pulmonary neutrophilia. Therefore, the development of treatments that specifically target neutrophils should consider the importance of innate immune competence in pulmonary homeostasis and host defense.

Les cristaux d'urate monosodique qui précipitent dans les cavités articulaires sont l'agent étiologique de l'arthrite goutteuse. L'interaction directe entre ces cristaux et les neutrophiles humains, les leucocytes les plus abondants de la circulation sanguine, est essentielle pour le déclenchement de la crise de goutte aigüe. Par ailleurs, un élément important de cette pathologie est l'infiltration massive de neutrophiles dans l'articulation touchée, où ils peuvent représenter jusqu'à 95 % des cellules présentes dans le liquide synovial et où ils sont présents dès les étapes précoces de l'inflammation. Les résultats présentés dans ce mémoire montrent que la stimulation de neutrophiles humains avec des cristaux d'UMS mène à l'activation précoce des isoformes classiques des protéines kinases C. Cette activation des protéines kinases C joue un rôle central dans la signalisation en affectant d'une part les protéines tyrosines kinases, particulièrement la kinase Syk, et d'autre part les protéines tyrosines phosphatases, en particulier SHP-1. L'activation des protéines kinases C est nécessaire à la mise en place de plusieurs réponses fonctionnelles des neutrophiles, soit la sécrétion de facteurs chimiotactiques et la dégranulation. En outre, la stimulation de neutrophiles humains par les cristaux d'urate monosodique permet également l'activation de la protéine tyrosine phosphatase SHP-2 pouvant possiblement jouer un rôle positif dans la régulation des éléments de signalisation induits par cette stimulation.

Le lupus érythémateux disséminé (LED) est une maladie auto-immune chronique à forte composante inflammatoire pour laquelle il n’existe aucun traitement curatif. Les patients qui en sont atteints présentent une pléthore d’auto-anticorps, c’est-à-dire des anticorps reconnaissant des constituants normaux du soi, que le système immunitaire considère par erreur comme étrangers. La présence de ces anticorps mène à la formation de complexes immuns, dont les taux sériques élevés et les dépôts tissulaires détectés chez les personnes lupiques corrèlent avec l’activité de la maladie. Les complexes immuns favorisent également l’activation indue des cellules immunitaires, qui peuvent à leur tour contribuer aux dommages organiques observés chez plusieurs patients. Le neutrophile, une cellule clé de l’immunité innée pour laquelle des anomalies fonctionnelles et phénotypiques ont été soulevées dans le LED, interagit avec les complexes immuns via les récepteurs Fcgamma (FcgR). Le récepteur FcgRI, dont la présence à la surface des monocytes est positivement associée à des déterminants physiopathologiques importants du LED, est exprimé à des niveaux très faibles chez le neutrophile au repos, mais son expression est inductible en conditions d’infections sévères. La présente étude démontre que les HA-IgG, utilisés comme modèle de complexes immuns, entraînent presque instantanément une forte hausse de FcgRI à la surface des neutrophiles, et que la signalisation qui découle de ce récepteur est nécessaire à la production d’espèces réactives de l’oxygène. Ces molécules, normalement utilisées par les neutrophiles pour défendre l’organisme hôte contre les envahisseurs pathogènes, sont potentiellement dommageables pour les tissus sains. Nos travaux suggèrent que FcgRI est un contributeur important de la réponse des neutrophiles humains aux complexes immuns, et peuvent aider à expliquer le rôle délétère des neutrophiles dans les maladies auto-immunes comme le LED. / Systemic lupus erythematosus (SLE) is a chronic autoimmune disease with a strong inflammatory component and for which there is no cure. SLE patients have a plethora of autoantibodies, that is, antibodies that recognize normal constituents of the self, which the immune system mistakenly considers foreign. The presence of these antibodies leads to the formation of immune complexes, whose elevated serum levels and tissue deposits detected in patients with lupus correlate with the disease activity. Immune complexes also promote the undue activation of immune cells, which in turn can contribute to the organic damage seen in many patients. The neutrophil, a key cell of innate immunity for which functional and phenotypic abnormalities have been raised in SLE, interacts with immune complexes via Fc-gamma receptors (FcgR). The FcgRI receptor, whose presence on the surface of monocytes is positively associated with important pathophysiological determinants of SLE, is expressed at very low levels on the neutrophil at rest, but its expression is inducible under severe infections. The present study demonstrates that HA-IgGs, used as a model of immune complexes, almost instantly upregulate the expression of FcgRI on the surface of neutrophils, and that the signal ensuing of this receptor is necessary for the production of reactive oxygen species. These molecules, normally used by neutrophils to defend the host from pathogenic invaders, are potentially damaging to healthy tissue. Our work suggest FcgRI as an important contributor of the response of human neutrophils to immune complexes, and may help explain the deleterious role of neutrophils in autoimmune diseases like SLE.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / En liant la portion constante des IgGs, les récepteurs Fcy (FcyRs) participent à l'ingestion des pathogènes opsonisés et des complexes immuns. La régulation fine de cette fonction est requise pour éviter le développement de pathologies autoimmunitaires. Le neutrophile humain est un phagocyte particulier puisqu'il exprime constitutivement deux isoformes activateurs (FcyRIIa et FcyRIIIb), sans toutefois posséder l'isoforme inhibiteur (FcyRIIb). Cette particularité est à l'origine des deux projets présentés dans cette thèse. D'une part, nos travaux ont étudié la coordination des signaux entre les deux isoformes lors de la stimulation du neutrophile humain avec du zymosan opsonisé par des IgGs et avec des complexes d'IgGs aggrégées (HA-IgG). D'abord, une forte interdépendance entre les deux isoformes nécessaire aux fonctions de phagocytose et de production d'anion superoxyde ainsi que pour la génération du profil de phosphorylation sur résidus tyrosine a été observée. Cependant, un influx de calcium extracellulaire essentiel à la phagocytose a été attribué à l'engagement spécifique du FcyRIIIb. Ce rôle exclusif du FcyRIIIb s'avère dépendant de l'intégrité des domaines membranaires résistants aux détergents (DRMs) dans lesquels les deux isoformes sont co-recrutés à la suite de leur engagement. D'autre part, un nouveau mode de régulation de l'activation des FcyRs a été décrit, indépendant de l'inhibition par le FcyRIIb. Par l'entremise de l'ubiquitine-ligase c-Cbl, le FcyRIIa est poly-ubiquitinylé puis dégradé par le protéasome. Ce processus de régulation est contrôlé positivement par la protéine adaptatrice CIN85 de manière dépendante des PKCs classiques. Cette voie s'avère également dépendante de l'intégrité des DRMs, plateforme de colocalisation entre le FcyRIIa, c-Cbl et CTN85. En conclusion, ces travaux ont permis de comprendre la signification biologique de l'expression combinée du FcyRIIa et du FcyRIIIb et l'interdépendance entre ces deux isoformes, tant du point de vue de la signalisation intracellulaire que des fonctions qui en découlent. De plus, un nouveau mode de régulation est proposé pour pallier à l'absence de l'isoforme FcyRIIb sur le neutrophile humain et ainsi éviter l'activation exacerbée des fonctions du neutrophile humain dépendantes de l'engagement des FcyRs.

La galectine-3 est maintenant reconnue comme étant un puissant modulateur de la réponse immunitaire. Les études présentées dans cette thèse visent à évaluer ses rôles et ses modes d'actions dans la réponse immunitaire innée en utilisant comme modèle l'infection pulmonaire à Sirepîococcus pneumoniae. Les résultats obtenus ont pu démontrer un rôle pour la galectine-3 dans Tactivation, l'adhésion et la transmigration p2-intégrines indépendante des neutrophiles. De plus, les différents modes d'actions de la galectine-3, ainsi que leurs liens avec les différentes activités de celle-ci ont été élucidés. Ces données permettent donc une meilleure compréhension de l'importance de la galectine-3 dans les différentes étapes de la réponse immunitaire innée et suggèrent des moyens de la réguler afin de favoriser une résolution rapide de la réaction inflammatoire.

Les polymorphonucléaires neutrophiles sont les principales cellules effectrices du système immunitaire inné. Les cristaux d'urate monosodique sont l'agent étiologique de l'arthrite goutteuse. L'interaction directe entre les neutrophiles humains et les cristaux d'UMS est essentielle pour le déclenchement de la crise de goutte aiguë. Le principal objectif de ce projet de recherche est d'identifier les voies de signalisation activées par les cristaux d'UMS et de caractériser leurs fonctions dans les réponses des neutrophiles humains.

Les neutrophiles jouent un rôle important dans les défenses immunitaires contre l'invasion des bactéries et des virus. Cette fonction est facilitée par l'expression de divers récepteurs à la surface des neutrophiles dont les récepteurs Toll-like (TLR). Les TLR reconnaissent des motifs moléculaires associés à des pathogènes (PAMP) qui sont exprimés sur les agents infectieux, et leur activation induit la médiation de la production de cytokines nécessaires pour le réponse immunitaire efficace. Les neutrophiles expriment divers TLR comme par exemple le TLR1/2 qui est activé par les composants de bactéries Gram-positives comme les peptidoglycane et les lipopeptides, . En plus des TLRs, les neutrophiles expriment des récepteurs P2, qui sont activés par des nucléotides extracellulaires. Plusieurs évidences montrent que les récepteurs P2 régulent des réponses pro-inflammatoires importantes chez le neutrophile. De plus, l'adhérence des neutrophiles à l'endothélium est médiée par une classe de protéines membranaires appelé intégrines dont l’antigène Macrophage-1 (ou αMβ2 intégrine) qui est un récepteur du complément (« CR3 ») composé de CD11b (intégrine αM) et CD18 (intégrine β2). Mac-1 (CD11b/CD18) est l'une des molécules d'adhésion importantes qui régule l'adhérence des neutrophiles à l'endothélium. Des études antérieures ont montré que les récepteurs P2 sont impliqués dans la migration des neutrophiles via la stimulation de la libération de chimiokines. Dans cette maîtrise nous avons cherché à savoir si ces récepteurs sont impliqués dans ces réponses induites par l’activation du TLR1/2. En accord avec un rôle des récepteurs P2, l'induction de l’adhérence des neutrophiles stimulées par un agoniste du TLR1/2 était inhibées par les antagonistes des récepteurs de P2, la suramine et le réactif bleu 2 (RB-2). La participation des récepteurs P2Y4 P2Y1, P2Y6 et P2Y11 ont été exclus avec des antagonistes sélectifs. Comme il n'y a pas d'antagoniste spécifique du récepteur P2Y2, un agoniste spécifique non hydrolysable pour P2Y2 à savoir PSB1114 a été utilisé. PSB1114 a régulé à la hausse l'expression de Mac-1 à la surface des neutrophiles, indiquant que P2Y2 est impliqué dans cette régulation. En outre, UTP et l'ATP, les ligands naturels du P2Y2 ont potentialisés fortement cette réponse induite par un agoniste du TLR1/2 (Pam3CSK4) à faible concentration. Cependant l'ATP et UTP seul ont induit une réponse modéré sur l'adhésion des neutrophiles sur une plaque coaté avec du fibrinogène. Nos résultats suggèrent que le récepteur P2Y2 contrôlent l’induction de l’expression de Mac-1 induite par le TLR1/2 in vitro et nous avons aussi confirmé que tel que nous nous attendions le P2Y2 contrôlait aussi l’adhesion des neutrophiles. / Neutrophils play an important role in immune defences against invading bacteria and viruses. This function is facilitated by the expression of Toll-like receptor (TLR) family members by neutrophils. TLRs recognize pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) that are expressed on infectious agents, and mediate the production of cytokines necessary for the development of effective immunity. Neutrophils express various TLRs. For example TLR1/2 is activated by peptidoglycan and lipopeptide, components of Gram-positive bacteria. In addition to TLR, neutrophil express P2 receptors, those are activated by extracellular nucleotides. There is growing evidence indicating that P2 receptors mediate some important pro-inflammatory responses. Moreover, neutrophil adhesion to endothelium is mediated by a class of membrane proteins called integrins. Macrophage-1 antigen (or integrin αMβ2) is a complement receptor ("CR3") consisting of CD11b (integrin αM) and CD18 (integrin β2) Mac-1(CD11b/CD18 is one of the important adhesion molecules that mediate neutrophil adhesion to the endothelium. Previous studies showed that P2 receptors are involved in neutrophil migration via stimulation of chemokine release and by facilitating chemoattractant gradient sensing. Here, we have investigated whether these receptors are involved in TLR1/2-induced neutrophil activation and adhesion. In line with a role of P2 receptors, neutrophil activation and adhesion induced by a TLR1/2 agonist were inhibited by the P2 receptor antagonists, suramin and reactive blue 2 (RB-2). The involvement of P2Y4 was unlikely as this receptor is insensitive to suramin while P2Y1, P2Y6 and P2Y11 were excluded with selective antagonists. As there is no specific antagonist for P2Y2 receptor, a non-hydrolysable specific agonist for P2Y2 namely PSB1114 was used. PSB1114 up-regulates surface expression of Mac-1 a result that suggests that P2Y2 involved in the regulation of Mac-1. Moreover, UTP and ATP, the natural P2Y2 ligands, markedly potentiated TLR1/2 agonist-induced neutrophil adhesion. Interestingly, ATP and UTP without Pam3CSK4 stimulation have shown a moderate effect on neutrophil adhesion in fibrinogen adhesion assay. Our data suggest that P2Y2 receptors control the TLR1/2 agonist-induced neutrophil adhesion in vitro via up regulation of Mac-1.

La réaction inflammatoire est un mécanisme de défense de l’hôte, toutefois, dans certaines circonstances, il arrive que cette réaction se retourne contre l’organisme. Il est donc important de comprendre l’origine de ce problème afin d’y trouver des solutions. Une étape majeure de la réaction inflammatoire est la migration des leucocytes du sang vers la région affectée. De ces cellules, le neutrophile est le premier à se rendre au site inflammatoire. Outre son rôle de défense de première ligne, le neutrophile a également la capacité de libérer divers médiateurs qui lui permettent d’orchestrer la réponse immunitaire. Le neutrophile est un réservoir majeur de protéines S100A8, S100A9 et S100A12. Depuis une vingtaine d’années, ces protéines ne cessent d’être associées à diverses pathologies infectieuses ou inflammatoires. Elles sont en effet détectées à de fortes concentrations dans le sérum de patients atteints d’arthrites, de maladies inflammatoires de l’intestin, de tuberculose, etc. Elles sont au demeurant des marqueurs sensibles de l’activité de ces maladies. Des études indiquent que ces protéines sont sécrétées dans des conditions inflammatoires et qu’elles exercent dans le milieu extracellulaire des fonctions pro-inflammatoires. Plus particulièrement, elles sont associées à la migration des leucocytes. Toutefois, les mécanismes d’action précis de ces protéines restent à élucider. Dans ces travaux de thèse, nous nous sommes intéressés aux rôles des protéines S100 dans la migration transendothéliale et tissulaire des neutrophiles. Nous avons observé que l’ajout de la protéine S100A9, dans des modèles in vitro, favorise l’adhésion des neutrophiles d’une part à l’endothélium et d’autre part à la fibronectine par l’activation des intégrines β2 et favorise ainsi la migration de ces cellules au site inflammatoire. S100A9 joue donc un rôle d’amplificateur de la réponse inflammatoire. Ces travaux nous aident à mieux comprendre le rôle des protéines S100 dans l’inflammation et plus particulièrement dans la migration des neutrophiles. Ces protéines constituant des cibles thérapeutiques potentielles, il est donc important de détailler leurs rôles dans le contexte inflammatoire. / Inflammation is one of the body’s defence mechanisms. In some cases, this reaction can be detrimental to the host it is supposed to protect. It is thus important to understand the origin of such reactions in order to find solutions. A key step of inflammatory reactions is leukocyte migration from blood to the injured area. Among leukocytes, neutrophils are the first to reach the inflammatory site. In addition to their role as the body’s first line of defence, neutrophils also help orchestrate the immune response through the release of inflammatory mediators. The neutrophils are a major reservoir of S100A8, S100A9, and S100A12 proteins. In the past 20 years, these proteins have been increasingly associated with various infectious and inflammatory diseases as they were detected at high concentrations in the serum of patients suffering from arthritis, inflammatory bowel diseases and tuberculosis to name a few. Moreover, they were shown to be sensitive markers of these diseases’ activity. Some studies have indicated that these proteins are secreted in inflammatory conditions and that they have pro-inflammatory activities in the extracellular space. Specifically, they were associated with leukocyte migration. However, the precise mechanisms through which these proteins affect the inflammatory response remain to be elucidated. In this work, we investigated the roles of S100 proteins in neutrophil transendothelial and tissue migration. We observed that S100A9 protein increased neutrophil adhesion to the endothelium and fibronectin by activating β2 integrins which led to the stimulation of cell migration to the inflammatory site in in vitro models. This work provided insight on the roles of S100 proteins in inflammation and more specifically in neutrophil migration. As these proteins represent potential therapeutic targets, it remains important to further understand their roles in inflammatory conditions.