Made available in DSpace on 2017-07-21T14:19:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 BARBARA S F.pdf: 4456843 bytes, checksum: 3391dc9c3b4a16b452d346cd9b46e209 (MD5) Previous issue date: 2016-09-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The organic soils from High-Elevation Grasslands of the Parana State are characterized by being large water tanks which fix carbon, have low pH and are poor in nutrients. Though are essential to the Atlantic Forest, there is little information on the microorganisms involved in its maintenance. In this work, microbiological data of organic soils in three different regions, during the dry and rainy seasons were analyzed. Using bioinformatics and statistic tools, nifH gene pirosequences were analyzed to determine the structure of diazotrophic communities and to identify the environmental factors that affect their diversity. The sequences of the nifH gene showed the prevalence of Proteobacteria (35.25%) followed by Spirochaetes (1.27%), Firmicutes (0.80%), Cyanobacteria (0.76%), Chlorobi (0.41%) Actinobacteria (0.10%) and Bacteriodetes (0.04%). Bradyrhizobium was the most abundant genus in the six libraries analyzed, presenting a positive correlation with the increase in the soil pH. Most of nifH gene OTUs showed to be cosmopolitan and the endemism was related to rare species. The OTUs classified as Proteobacteria, Calothrix, Spirochaeta, Halorhodospira, Rhizobiales, Alphaproteobacteria and Bradyrhizobium presented a significant correlation with the rainfall indexes. / Os solos orgânicos dos Campos de Altitude paranaense caracterizam-se por serem grandes reservatórios de água, fixarem carbono, terem baixo pH e serem pobres em nutrientes. Embora sejam essenciais para a Mata Atlântica, há pouca informação sobre os microrganismos envolvidos na sua manutenção. Nesse trabalho, foram analisados dados microbiológicos de solos orgânicos de três regiões distintas, durante as estações de seca e chuva. Utilizando ferramentas de bioinformática e estatística foram analisadas pirossequencias do gene nifH para determinar a estrutura das comunidades diazotróficas e para identificar os fatores ambientais que afetam a sua diversidade. As sequências do gene nifH mostraram a prevalência de Proteobactéria (35,25%) seguida por Spirochaetes (1,27%), Firmicutes (0,80%), Cyanobacteria (0,76%), Chlorobi (0,41%), Actinobacteria (0,10%) e Bacteriodetes (0,04%). Bradyrhizobium foi o gênero mais abundante nas seis bibliotecas analisadas, apresentando correlação positiva com o aumento do pH dos solos. A maioria das OTU do gene nifH foram cosmopolitas e o endemismo está relacionado às espécies raras. As OTU classificadas como Proteobacteria, Calothrix, Spirochaeta, Halorhodospira, Rhizobiales, Alfaproteobacteria e Bradyrhizobium apresentaram significativa correlação com os índices pluviométricos.

As cianobactérias caracterizam-se como o grupo de micro-organismos fotoautotrófico mais abundante encontrado nas regiões polares. Representantes deste grupo realizam a fotossíntese oxigênica e também podem fixar o nitrogênio atmosférico. A maioria dos levantamentos da comunidade de cianobactérias na Antártica tem sido realizada apenas por meio de observações microscópicas de amostras ambientais. O isolamento de linhagens e consequentes estudos fisiológicos, bem como, análises independentes de cultivo ainda são escassos. Neste estudo a comunidade de cianobactérias de duas ilhas oceânicas da Antártica foi investigada utilizando abordagens moleculares dependentes e independentes de cultivo. O papel ecológico das cianobactérias como fornecedoras de formas assimiláveis de nitrogênio e o potencial genético para biossíntese de produtos naturais também foi avaliado. Sessenta e oito linhagens de cianobactérias foram isoladas a partir de diferentes substratos coletados. Elas pertencem às ordens Chroococcales, Pseudanabaenales, Oscillatoriales e Nostocales, famílias Xenococcaceae, Dermocarpellaceae, Pseudanabaenaceae, Oscillatoriaceae, Nostocaceae, Microchaetaceae e Rivulariaceae. Análises filogenéticas baseadas nas sequências de RNAr 16S dessas cianobactérias revelou a existência de agrupamentos: formado exclusivamente por sequência de linhagem isolada nesse trabalho; composto por sequências antárticas oriundas desse e de outros trabalhos desenvolvidos em outras regiões antárticas; e por sequências originárias de diversas regiões do mundo. Quarenta e uma linhagens apresentaram fragmento do gene nifH, responsável pela codificação do complexo enzimático da nitrogenase, o qual está envolvido na fixação biológica do nitrogênio (FBN). Formas unicelulares (Chroococcales), homocitadas (Pseudanabaenales e Oscillatoriales) e heterocitadas (Nostocales) apresentaram potencial genético para realização da FBN, e 18 delas foram submetidas aos testes de redução de acetileno (ARA) com alta sensibilidade de detecção. Todas as linhagens testadas exibiram alguma atividade em resposta a diferentes concentrações de oxigênio e/ou a luminosidade em diferentes condições de temperatura. Filogeneticamente, as sequências do gene nifH apresentaram três padrões distintos de agrupamento, o que pode estar relacionado aos eventos evolutivos envolvidos na distribuição e ou manutenção deste gene. A presença de genes e ou regiões intergênicas evidenciaram o elevado potencial genético dessas linhagens para sintetizar produtos naturais com interesse biotecnológico. A abundância no número de cópias do gene nifH relacionado às cianobactérias nas amostras de biofilme reforça a importância desse grupo de microorganismos como fornecedor de formas reduzidas de N para o ambiente antártico. A análise da comunidade de cianobactérias por meio do sequenciamento do RNAr 16S de DNA metagenômico evidenciou predominância de UTOs relacionadas às ordens Nostocales, Oscillatoriales e Pseudanabaenales, famílias Pseudanabaenaceae, Phormidiaceae, Nostocaceae e Rivulariaceae. A árvore filogenética contendo as sequências de cianobactérias cultivadas e não-cultivadas mostrou que somente parte da comunidade presente em biofilmes foi acessada por isolamento, indicando a complementariedade entre as duas abordagens utilizadas na análise da comunidade de cianobactérias / Cyanobacteria are characterized as the most abundant group of photoautotrophic microorganisms found in the polar regions. Members of this group perform oxygenic photosynthesis and many of them can also fix atmospheric nitrogen. Investigations on the cyanobacterial community have been made mainly applying microscopic observations of environmental samples. Cyanobacterial isolation, physiological studies and cultureindependent analyses are scarce. In this study the cyanobacterial community from two oceanic islands in Antarctica was investigated using culture-dependent and independent approaches. Also, the ecological role of this group of microorganisms as nitrogen-fixing organisms and the genetic potential for biosynthesis of natural products were evaluated. Sixty-eight cyanobacterial strains were isolated from different environmental samples. They belong to the orders Chroococcales, Pseudanabaenales, Oscillatoriales and Nostocales, families Xenococcaceae, Dermocarpellaceae, Pseudanabaenaceae, Oscillatoriaceae, Nostocaceae, Microchaetaceae and Rivulariaceae. Phylogenetic analyses based on 16S rRNA sequences of these cyanobacteria revealed the existence of groups: exclusively formed by sequence of strain isolated in this work; intermixed sequences from this and other studies developed in other Antarctic regions; and sequences originated from different regions of the world. Fortyone cultured strains possess the nifH gene fragment encoding the nitrogenase enzyme complex, which is related to the biological nitrogen fixation (BNF). Unicellular (Chroococcales), homocytous (Pseudanabaenales and Oscillatoriales) and heterocytous forms (Nostocales) showed genetic potential for BNF, and 18 of them were subjected to acetylene reduction assay (ARA) coupled with a sensitive laser photoacoustic ethylene detector. All strains tested exhibited some nitrogenase activity in response to different concentrations of oxygen and or irradiance under different temperature conditions. Phylogenetically, the nifH gene sequences showed three distinct grouping patterns that may be related to the evolutionary events involved in the distribution and or maintenance of this gene. The presence of genes and or intergenic regions in these cyanobacterial strains underscores the genetic potential of them to synthesize natural products with biotechnological interest.The abundance of nifH gene copies related to cyanobacteria in biofilm samples highlights the importance of this group of microorganisms as suppliers of N reduced forms for Antarctic environment. The analysis of the cyanobacteria community revealed by 16S rRNA sequencing of metagenomic DNA showed a predominance of OTUs related to orders Nostocales, Oscillatoriales and Pseudanabaenales, families Pseudanabaenaceae, Phormidiaceae, Nostocaceae and Rivulariaceae. The phylogenetic tree containing Antarctic sequences from cultivated and uncultivated cyanobacteria showed that only part of this community in biofilms has been accessed by isolation, indicating the complementarity between the two approaches used in the analysis of cyanobacterial community

As cianobactérias caracterizam-se como o grupo de micro-organismos fotoautotrófico mais abundante encontrado nas regiões polares. Representantes deste grupo realizam a fotossíntese oxigênica e também podem fixar o nitrogênio atmosférico. A maioria dos levantamentos da comunidade de cianobactérias na Antártica tem sido realizada apenas por meio de observações microscópicas de amostras ambientais. O isolamento de linhagens e consequentes estudos fisiológicos, bem como, análises independentes de cultivo ainda são escassos. Neste estudo a comunidade de cianobactérias de duas ilhas oceânicas da Antártica foi investigada utilizando abordagens moleculares dependentes e independentes de cultivo. O papel ecológico das cianobactérias como fornecedoras de formas assimiláveis de nitrogênio e o potencial genético para biossíntese de produtos naturais também foi avaliado. Sessenta e oito linhagens de cianobactérias foram isoladas a partir de diferentes substratos coletados. Elas pertencem às ordens Chroococcales, Pseudanabaenales, Oscillatoriales e Nostocales, famílias Xenococcaceae, Dermocarpellaceae, Pseudanabaenaceae, Oscillatoriaceae, Nostocaceae, Microchaetaceae e Rivulariaceae. Análises filogenéticas baseadas nas sequências de RNAr 16S dessas cianobactérias revelou a existência de agrupamentos: formado exclusivamente por sequência de linhagem isolada nesse trabalho; composto por sequências antárticas oriundas desse e de outros trabalhos desenvolvidos em outras regiões antárticas; e por sequências originárias de diversas regiões do mundo. Quarenta e uma linhagens apresentaram fragmento do gene nifH, responsável pela codificação do complexo enzimático da nitrogenase, o qual está envolvido na fixação biológica do nitrogênio (FBN). Formas unicelulares (Chroococcales), homocitadas (Pseudanabaenales e Oscillatoriales) e heterocitadas (Nostocales) apresentaram potencial genético para realização da FBN, e 18 delas foram submetidas aos testes de redução de acetileno (ARA) com alta sensibilidade de detecção. Todas as linhagens testadas exibiram alguma atividade em resposta a diferentes concentrações de oxigênio e/ou a luminosidade em diferentes condições de temperatura. Filogeneticamente, as sequências do gene nifH apresentaram três padrões distintos de agrupamento, o que pode estar relacionado aos eventos evolutivos envolvidos na distribuição e ou manutenção deste gene. A presença de genes e ou regiões intergênicas evidenciaram o elevado potencial genético dessas linhagens para sintetizar produtos naturais com interesse biotecnológico. A abundância no número de cópias do gene nifH relacionado às cianobactérias nas amostras de biofilme reforça a importância desse grupo de microorganismos como fornecedor de formas reduzidas de N para o ambiente antártico. A análise da comunidade de cianobactérias por meio do sequenciamento do RNAr 16S de DNA metagenômico evidenciou predominância de UTOs relacionadas às ordens Nostocales, Oscillatoriales e Pseudanabaenales, famílias Pseudanabaenaceae, Phormidiaceae, Nostocaceae e Rivulariaceae. A árvore filogenética contendo as sequências de cianobactérias cultivadas e não-cultivadas mostrou que somente parte da comunidade presente em biofilmes foi acessada por isolamento, indicando a complementariedade entre as duas abordagens utilizadas na análise da comunidade de cianobactérias / Cyanobacteria are characterized as the most abundant group of photoautotrophic microorganisms found in the polar regions. Members of this group perform oxygenic photosynthesis and many of them can also fix atmospheric nitrogen. Investigations on the cyanobacterial community have been made mainly applying microscopic observations of environmental samples. Cyanobacterial isolation, physiological studies and cultureindependent analyses are scarce. In this study the cyanobacterial community from two oceanic islands in Antarctica was investigated using culture-dependent and independent approaches. Also, the ecological role of this group of microorganisms as nitrogen-fixing organisms and the genetic potential for biosynthesis of natural products were evaluated. Sixty-eight cyanobacterial strains were isolated from different environmental samples. They belong to the orders Chroococcales, Pseudanabaenales, Oscillatoriales and Nostocales, families Xenococcaceae, Dermocarpellaceae, Pseudanabaenaceae, Oscillatoriaceae, Nostocaceae, Microchaetaceae and Rivulariaceae. Phylogenetic analyses based on 16S rRNA sequences of these cyanobacteria revealed the existence of groups: exclusively formed by sequence of strain isolated in this work; intermixed sequences from this and other studies developed in other Antarctic regions; and sequences originated from different regions of the world. Fortyone cultured strains possess the nifH gene fragment encoding the nitrogenase enzyme complex, which is related to the biological nitrogen fixation (BNF). Unicellular (Chroococcales), homocytous (Pseudanabaenales and Oscillatoriales) and heterocytous forms (Nostocales) showed genetic potential for BNF, and 18 of them were subjected to acetylene reduction assay (ARA) coupled with a sensitive laser photoacoustic ethylene detector. All strains tested exhibited some nitrogenase activity in response to different concentrations of oxygen and or irradiance under different temperature conditions. Phylogenetically, the nifH gene sequences showed three distinct grouping patterns that may be related to the evolutionary events involved in the distribution and or maintenance of this gene. The presence of genes and or intergenic regions in these cyanobacterial strains underscores the genetic potential of them to synthesize natural products with biotechnological interest.The abundance of nifH gene copies related to cyanobacteria in biofilm samples highlights the importance of this group of microorganisms as suppliers of N reduced forms for Antarctic environment. The analysis of the cyanobacteria community revealed by 16S rRNA sequencing of metagenomic DNA showed a predominance of OTUs related to orders Nostocales, Oscillatoriales and Pseudanabaenales, families Pseudanabaenaceae, Phormidiaceae, Nostocaceae and Rivulariaceae. The phylogenetic tree containing Antarctic sequences from cultivated and uncultivated cyanobacteria showed that only part of this community in biofilms has been accessed by isolation, indicating the complementarity between the two approaches used in the analysis of cyanobacterial community

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A castanheira-do-Brasil (Bertholletia excelsa H.B.K.), Lecythidaceae, é uma espécie nativa de potencial interesse para sistemas agroflorestais (SAFs) na Amazônia. Uma das dificuldades da propagação da castanheira é seu processo germinativo desuniforme, que constitui um problema no estabelecimento de mudas para cultivos. Pouco se sabe sobre os micro-organismos benéficos associados às raízes de castanheira-do-Brasil, sendo que o uso de micro-organismos promotores do crescimento vegetal pode ser uma biotecnologia positiva para a produção de mudas de qualidade. O objetivo desse trabalho foi caracterizar fenotípica e genotipicamente bactérias isoladas de raízes de castanheira-do-Brasil cultivadas e nativas e avaliar a presença de características para promoção do crescimento vegetal. Foram isoladas 303 bactérias de raízes de castanheiras em Roraima, sendo 81 oriundas da área de monocultivo de castanheira, 154 de SAF e 68 de área de floresta nativa. As bactérias foram isoladas utilizando meios semissólidos NFB, LGI, JMV e DYGS. A caracterização fenotípica dos isolados foi avaliada através das análises de proteína totais por SDS-PAGE, solubilização de fosfato de cálcio em meio sólido, solubilização de fosfato de alumínio em meio liquido e produção de ácido indol acético. Baseado nos perfis de proteínas (SDS-PAGE) foi estimado o índice de diversidade de Shannon e análise de rarefação. A caracterização genotípica foi realizada através da avaliação da presença ou ausencia do gene nifH e pelo sequenciamento parcial do 16S rRNA. Das 303 bactérias foram obtidas o perfil proteico de 290. Através da análise dos perfis proteicos foram gerados quatro dendrogramas referentes a cada meio de isolamento, JMV, LGI, DYGS e NFB. A partir desses dendrogramas, foi realizada uma seleção de bactérias a partir de grupos formados a 80% de similaridade em cada meio de isolamento, sendo selecionadas 100 bactérias. Na avaliação da diversidade em cada ambiente, os índices de diversidade foram similares para as três localidades de onde foram isoladas as bactérias. Das 100 bactérias avaliadas quanto a capacidade de solubilização de fosfato de cálcio em meio sólido, observou-se que 69% apresentaram esta característica e 90% apresentaram capacidade de solubilizar fosfato de alumínio em meio liquido. Setenta bactérias sintetizaram acido indol acético, onde 44 sintetizaram em meio sem triptofano, 61 em meio com triptofano e 35 apresentaram nos dois meios. Das 100 bactérias submetidas à amplificação da região do gene nifH apenas 18 apresentaram bandas específica de amplificação correspondente do gene nifH, sendo oito isoladas em meio semisseletivo para Azospirilum sp. (NFB e LGI), e 10 isoladas de meio não seletivo (DYGS). Entre as bactérias avaliadas, 24 se destacaram para futuros testes de inoculação na produção de mudas, por apresentarem no mínimo duas ou mais caracaterísticas de promoção do crescimento vegetal. Através da análise do gene 16S rRNA, as sequências de nucleotídeos obtidas resultaram na distribuição das bactérias em 18 gêneros distintos. Foram detectadas sequências de gêneros pertencentes às classes α-Proteobacteria, β-Proteobacteria, γ-Proteobacteria, Bacilli e Actinobacteria. Estes resultados indicam uma elevada diversidade de gêneros de bactérias endofíticas promotoras do crescimento presentes em raízes de castanheira-do-Brasil. Trata-se do primeiro trabalho de caracterização de bactérias endofíticas promotoras de crescimento em raízes de castanheira-do-Brasil.

Marine primary productivity in large parts of the oceans is supported by nitrogen fixers (diazotrophs). Richelia, a genus of multiple closely related species of heterocystous filamentous cyanobacterial diazotrophs, are often found in symbioses with a few genera of diatoms. Several Richelia species: R. euintracellularis, R. intracellularis and R. rhizosoleniae, form stable host specific partnerships and these populations are important for the nitrogen (N) cycle, especially in the oligotrophic open oceans. In general, the gene nifH, which encodes the enzyme nitrogenase for N2 fixation, is used as a molecular marker for presence (DNA level) and activity (RNA level) of diazotrophs. However, evidence of cross-reactivity of the nifH assays between two of the Richelia species shows the risk of incorrect estimations of abundance and activity. Moreover, transcript abundance is rarely normalized to a housekeeping gene.  The aims of this work were to develop and assess new assays for the detection of three symbiotic Richelia species: R. euintracellularis, R. intracellularis and R. rhizosoleniae. These new assays targeted molecular markers that were indicative nutrient acquisition. For example, one assay targets a gene encoding the high affinity phosphate transporter (pstS), a second targets a gene involved in iron (Fe) transport (exbB) (indicator of P transport, Fe transport, respectively), and a third assays a housekeeping gene encoding Ribonuclease P protein (rnpA). All assays were used to estimate abundance and expression in lab and field based samples. The new assays have high species specificity as revealed by BlastN analyses and lab-based cross-hybridization assays. We applied the assays to samples from a lab-based experiment of the facultative symbiont R. rhizosoleniae RrhiSC01 in order to investigate the temporal dynamics of expression. This revealed periodic expression of nifH and pstS related to the photoperiod with higher expression in the early and late photoperiod, respectively. The peak of pstS expression in the late photoperiod is likely to support the high P requirement of both photosynthesis and N2 fixation. Given the temporal regulation of pstS (and nifH) expression shown here, one must consider these results when sampling and/or interpreting field studies. Moreover, a comparison of the Richelia draft genomes and environmental metagenomic assembled genomes (MAGs) show that gene copy number per genome of exbB and pstS varies between strains. Given that Richelia tend to live in low nutrient environments, including N, P, and often Fe, the increased copy number per genome for pstS and exbB could be suggestive/evidence of adaptation to constant nutrient limitation. In addition, the assays were applied to natural samples containing populations of R. intracellularis and R. euintracellularis collected in the North and South Atlantic Ocean from multiple depths (5-90 meters). The DNA based gene copy abundances showed higher estimates when nifH is used compared to rnpA, which is likely due to a higher degree of cross-reactivity in the nifH assays. Gene expression was present but low for all targets. However, expression of exbB and pstS was higher in surface water – where nutrients are expected to be depleted. Lastly, bulk fixation rates of N2 and carbon (C) showed that the activity was low and fixation rates did not increase with the addition of dissolved organic phosphate (DOP) (a 1:4 mixture of 2-aminoethylphosphonic acid and beta-glycerophosphate disodium salt hydrate). This could be due to patchiness and low abundance of diazotrophs and discrepancies between samples, seasonal variation or that the populations were not P limited. In summary, the new assays constitute a better option to interspecific detection of Richelia. However, more work is required to assess how the expression relates to limitation of nutrients and other external factors to better understand the activity of these biogeochemically important populations. / I stora delar av haven stöds marin primärproduktion av kvävefixerare (diazotrofer). Richelia är ett släkte med ett flertal närbesläktade arter av heterocysta, filamentösa och kvävefixerande cyanobakterier som lever i symbios med ett fåtal kiselalger. Dessa är viktiga för kvävecykeln, särskilt i de oligotrofa (kvävefattiga) öppna haven. Genen nifH som kodar för det kvävefixerande enzymet nitrogenas, brukar användas som en molekylär markör för att detektera diazotrofa populationer och dess genuttryck används som en indikator för kvävefixering. Det finns emellertid tecken på att nifH ger felaktiga uppskattningar av dessa populationers abundans och aktivitet. Dessutom, när nifH-uttryck används som ett mått på aktivitet är det endast kvävefixering man observerar. Andra faktorer som begränsar förekomsten av dessa organismer, t.ex. brist på järn eller fosfor, kan inte avläsas. Dessutom har uttrycket av nifH sällan normaliserats till en stabilt uttryckt gen vilket gör jämförelser svåra. Syftet med detta arbete var att utveckla och utvärdera nya kvantitativ realtidspolymeraskedjereaktion (qPCR)-analyser för specifik detektion av identitet, abundans och aktivitet av tre symbiotiska Richelia-arter: R. euintracellularis, R. intracellularis och R. rhizosoleniae. De nya analyserna är inriktade på generna som kodar för högaffinitetsfosfattransportören pstS och biopolymertransportproteinet exbB (indikator för P-transport respektive Fe-transport). Genen som kodar för ribonukleas P-protein, rnpA, en gen med stabilt uttryck, användes för att uppskatta abundans och för att normalisera uttrycket av de andra målgenerna.  BlastN-analyser och labb-baserade korshybridiseringsanalyser visar att de nya analyserna har hög artspecificitet. Vi tillämpade analyserna på en kultur av den fakultativa symbionten R. rhizosoleniae RrhiSC01 för att undersöka det periodiska uttrycksmönster av målgenerna kopplat till tid på dygnet. Resultatet visade på ett periodiskt uttryck av nifH och pstS relaterat till fotoperioden med högre uttryck i den tidiga, respektive sena fotoperioden.  Det ökade uttrycket av pstS i den sena fotoperioden stödjer sannolikt det höga P-kravet för både fotosyntes och N2-fixering. Den tidsmässiga regleringen av pstS-uttryck som visas här, behöver man ta hänsyn till vid provtagning och tolkning av fältstudier. ​​ Dessutom visar en jämförelse av Richelia-genom att genkopiantalet för exbB och pstS varierar mellan stammar av Richelia. Med tanke på att Richelia tenderar att leva i miljöer med låga nivåer av näringsämnen, inklusive kväve, fosfor och ofta järn, kan det ökade antalet kopior per genom av pstS och exbB ett tecken på anpassning till konstant näringsbegränsning. Analyserna tillämpades även på naturliga populationer av R. intracellularis och R. euintracellularis i norra och södra Atlanten. DNA-baserad estimering av abundans (genkopior) visar på en högre uppskattning när nifH används som markör jämfört med rnpA - troligtvis på grund av en högre grad av korsreaktivitet i nifH-analyserna. Genuttryck var närvarande men lågt för alla målgener i norra och södra Atlanten. Uttrycket av exbB och pstS var dock högre i ytvatten – där halter av näringsämnen förväntas vara låga. Slutligen var kväve- och kolfixering i planktonsamhället låg och ökade inte vid tillsats av fosfor, vilket kan bero på ojämn fördelning av celler, låg förekomst av diazotrofer och diskrepanser mellan prover, säsongsvariationer eller att populationerna inte var primärt begränsade av fosfor. Sammanfattningsvis utgör de nya analyserna ett bättre alternativ för specifik detektion av Richelia. Det krävs dock mer arbete för att bedöma hur uttrycket påverkas av  näringsbrist och yttre faktorer och för att bättre förstå aktiviteten hos dessa ovärderliga populationer.

La mer Méditerranée est une des zones océaniques les plus oligotrophes de la planète pour laquelle la fixation biologique d’azote a été proposée comme jouant un rôle important dans les flux de carbone et d’azote. Comme les organismes planctoniques potentiellement responsables de cette activité n’y ont jamais été étudiés, les objectifs de cette thèse étaient de caractériser la diversité (abondance et richesse spécifique), la distribution spatio-temporelle, et les facteurs de contrôle des diazotrophes, en s’axant particulièrement sur les cyanobactéries unicellulaires (UCYN). Pour cela, des hybridations in situ (TSAFISH)sur différentes fractions de taille en combinaison avec des comptages microscopiques et des analyses phylogénétiques sur les gènes 16S ADNr et nifH ont été réalisées, à la fois lors d’un cycle saisonnier à la station côtière SOMLIT de Marseille, et lors du transect Méditerranéen BOUM. Alors que les cyanobactéries filamenteuses Richelia intra cellularis et Trichodesmium sp. ont été détectées seulement ponctuellement dans le temps et dans l’espace, en très faible concentration (0.02 filament.ml-1), la communauté des cyanobactéries diazotrophes était dominée à 99,9% par du picoplancton hybridé avec la sonde Nitro821, spécifique aux UCYN. Ces cellules, de petite (0.7-1.5 μm) ou de grande (2.5-3.2 μm)taille, ont été retrouvées en faible concentration (1-6 cellule.ml-1) dans toute la Méditerranée et tout au long de l’année, à l’exception de l’été 2006 lorsque la concentration des petites cellules a atteint 5300 cellule.ml-1 au cours d’un évènement exceptionnel de pollution atmosphérique urbaine. Des efflorescences similaire sont été observées suite à des enrichissements en poussières sahariennes à une station côtière en Corse et au large au centre de la Méditerranée, simultanément avec des augmentations de l’activité de fixation d’azote.L’affiliation des petites cellules aux UCYN-A a été confirmée par phylogénie dans les eaux du large de la Méditerranée occidentale. Les librairies de clones nifH de la fraction de taille picoplanctonique étaient dominées par des séquences d’α-protéobactéries appartenant à un nouveau groupe marin de Bradyrhizobium. D’autres groupes de rhizobia et des γ-protéobactéries ont été détectés ponctuellement.Alors que l’absence de Trichodesmium sp. au large pourrait être liée aux faibles concentrations en phosphate et en fer, les facteurs inhibant le développement des UCYN-B et –C restent inconnus. Lesdiazotrophes picoplanctoniques (Bradyrhizobium, rhizobia, UCYN-A) pourraient avoir développé des stratégies spécifiques, telles que des associations avec des eucaryotes ou des particules inertes, et/ou la capacité de photosynthèse, pour acquérir le carbone nécessaire au soutien du processus de la diazotrophie / The Mediterranean Sea is one of the most oligotrophic marine areas on earth where nitrogenfixation has been formally believed to play an important role in carbon and nitrogen fluxes. Although thisview is under debate, the diazotrophs responsible for this activity have still not been investigated. The aimsof this PhD were to characterise the diversity (abundance and species richness) and the spatio-temporaldistribution of diazotrophs, as well as factors controlling their development, with a particular focus onunicellular cyanobacteria. A combination of microscopic counts with size fractionated in situ hybridization(TSA-FISH), and 16S rDNA and nifH phylogenies were done, either over a year and a half seasonal cycle atthe coastal SOMLIT station off Marseilles, and across the entire Mediterranean Sea during the BOUMtransect. Low concentrations of diazotrophic cyanobacteria were detected and this community wasdominated at 99.9% by picoplankton hybridized with Nitro821 probe, specific for unicellular diazotrophiccyanobacteria (UCYN). Among filamentous cyanobacteria, only 0.02 filament ml-1 of Richeliaintracellularis and Trichodesmium sp. were detected sporadically in time and space. Small (0.7-1.5 μm) andlarge (2.5-3.2 μm) Nitro821-targeted cells were recovered in low concentrations (1-6 cell ml-1) across theentire Mediterranean Sea and all the year long, except over a month period in summer 2006 whenconcentrations of small cells reached 5300 cell ml-1, during an exceptionally high urban pollution event.Similar blooms of small and large cells were reported after Saharan dust inputs off Corsica and at open Sea,simultaneously with increases in N2 fixation rates. The affiliation of the small Nitro821-targeted cells toUCYN-A was confirmed by 16S and nifH phylogenies offshore in the western Mediterranean Sea. Rhizobiasequences, including the ones of a new marine group of Bradyrhizobium, were dominating nifH clonelibraries from picoplanktonic size fractions. A few sequences of γ-proteobacteria were also detected incentral Mediterranean Sea. While low phosphate and iron concentrations could explain the absence ofTrichodesmium sp. offshore, the factors that prevent the development of UCYN-B and C remain unknown.It is proposed that the dominating Mediterranean picoplankters (Bradyrhizobium, rhizobia, UCYN-A)probably developed specific strategies, such as associations with protists or particles, and/or photosyntheticactivity, to acquire carbon for sustaining diazotrophy.

In aquatic environments the availability of nitrogen (N) generally limits primary production. N2-fixing prokaryotes (diazotrophs) can convert N2 gas into ammonium and provide significant input of N into the oceans. Cyanobacteria are thought to be the main N2-fixers but diazotrophs also include a wide range of heterotrophic bacteria. However, their activity and regulation in the water column is largely unknown. In this thesis the distribution, diversity, abundance, and activity of marine and estuarine heterotrophic diazotrophs was investigated. With molecular methods targeting the nifH gene, encoding the nitrogenase enzyme for N2 fixation, it was shown that diverse nifH genes affiliating with heterotrophic bacteria were ubiquitous in surface waters from ten marine locations world-wide and the estuarine Baltic Sea. Through enrichment cultures of Baltic Sea surface water in anaerobic N-free medium, heterotrophic N2 fixation was induced showing that there was a functional N2-fixing community present and isolates of heterotrophic diazotrophs were obtained. In Sargasso Sea surface waters, transcripts of nifH related to heterotrophic bacteria were detected indicating heterotrophic N2-fixing activity. Nitrogenase expression is thought to be highly regulated by the availability of inorganic N and the presence of oxygen. Low oxygen zones within the water column can be found in association with plankton. The presence of diazotrophs as symbionts of heterotrophic dinoflagellates was investigated and nifH genes related to heterotrophic diazotrophs rather than the cyanobacterial symbionts were found, suggesting that a symbiotic co-existence prevailed. Oxic-anoxic interfaces could also be potential sites for heterotrophic N2 fixation. The Baltic Sea contains large areas of anoxic bottom water. At the chemocline and in anoxic deep water heterotrophic diazotrophs were diverse, abundant and active. These findings extend the currently known regime of N2 fixation to also include ammonium-rich anaerobic waters. The results of this thesis suggest that heterotrophic diazotrophs are diverse and widely distributed in marine and estuarine waters and that they can also be active. However, limits in the knowledge on their physiology and factors which regulate their N2 fixation activity currently prevent an evaluation of their importance in the global marine N budget.

Dans cette étude de trois lacs sujets aux efflorescences de cyanobactéries, nous avons examiné la diversité des bactéries diazotrophes et des cyanobactéries toxiques. Nous avons tenté de définir les facteurs environnementaux influençant la composition des communautés phytoplanctoniques, la concentration ainsi que la composition des microcystines (MCs). Nous avons émis l’hypothèse que l’azote jouerait un rôle majeur dans le façonnement des communautés cyanobactériennes et influencerait la concentration et composition des MCs. Des concentrations de cette toxine ainsi que le gène mcyE codant pour l’enzyme microcystine synthétase ont été détectés à chaque échantillonnage dans tous les lacs. L’azote, particulièrement sous sa forme organique dissoute (AOD) ainsi que la température de l’eau étaient les facteurs environnementaux expliquant le mieux les concentrations des MCs, tandis que la biomasse de Microcystis spp. était globalement le meilleur prédicteur. Le gène nifH codant pour l’enzyme nitrogénase (fixation d’azote) a aussi été détecté dans chaque échantillon. Malgré les concentrations faibles en azote inorganique dissous (AID) et les densités importantes d’hétérocystes, aucun transcrits du gène n’a été détecté par réverse-transcription (RT-PCR), indiquant que la fixation d’azote n’avait pas lieu à des niveaux détectables au moment de l’échantillonnage. De plus, le pyroséquençage révèle que les séquences des gènes nifH et mcyE correspondaient à différents taxons, donc que les cyanobactéries n’avaient pas la capacité d’effectuer les deux fonctions simultanément. / In this study of three eutrophic lakes prone to cyanobacterial blooms, we examined the diversity of diazotrophic bacteria and toxic cyanobacteria. We evaluated the environmental factors effects on the community composition, the concentration and composition of the family of toxins microcystins (MCs). Since the assimilation of nitrogen and the synthesis of MCs in cyanobacteria are thought to be under the same control of the NtcA transcriptor, we hypothesised that nitrogen played a major role in shaping cyanobacterial communities and influenced indirectly the concentration and composition of MCs. The mcyE gene coding for the microcystin synthetase enzyme and MCs concentrations were detected at each sampling date in all lakes. Nitrogen, particularly under its organic dissolved form (DON) as well as water temperature were the environmental factors explaining the most variation in MC concentration although Microcystis spp. biomass was overall the best predictor. The nifH gene coding for the nitrogenase enzyme (N2-fixation) was also detected at all times. Even though the concentrations of dissolved inorganic nitrogen were relatively low, and that heterocysts were present in high densities, no nifH transcripts were detected by RT-PCR, indicating that no N2-fixation was going on at detectable levels at the time of sampling. Moreover, pyrosequencing revealed that sequences of the genes nifH and mcyE corresponded to different taxa, thus cyanobacteria did not have the capacity to perform both functions simultaneously.

A Mata Atlântica é um importante bioma da costa brasileira, apresenta grande diversidade de plantas e animais, porém, pouco se sabe sobre a diversidade microbiana. Da mesma forma, pouco se sabe sobre o papel funcional desses microrganismos. Vários microrganismos estão envolvidos na ciclagem do nitrogênio na Mata Atlântica, e dentre eles os diazotróficos são de particular interesse, pois contribuem para o aporte direto de nitrogênio nos ecossistemas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade de bactérias diazotróficas que nodulam leguminosas em duas parcelas permanentes do Parque Estadual da Serra do Mar em diferentes altitudes. Nódulos de raízes foram coletados nas quatro estações do ano. As bactérias foram isoladas do interior dos nódulos, resultando em 105 isolados. A análise de diversidade genética destas bactérias foi feita utilizando-se BOX-PCR e sequenciamento parcial do gene 16S rRNA. A capacidade de nodulação dos isolados foi determinada através da formação de nódulos em caupi (Vignia unguiculata). Os resultados indicaram que há uma diferença na distribuição espacial e temporal dos nódulos nas áreas estudadas. A maior quantidade de nódulos foi encontrada na parcela de Picinguaba, em estações com menores índices pluviométricos. Os isolados apresentaram uma grande diversidade fenotípica, sendo separados em 6 grupos com características culturais semelhantes. Os perfis de BOX-PCR formaram 8 grupos genotípicos com mais de 80% de similaridade, agrupando tanto isolados de Picinguaba quanto de Santa Virgínia. Os perfis dos géis do BOX-PCR apresentaram variação no número e mobilidade das bandas. Os dados foram transformados em uma matriz binária de presença e ausência que possibilitou a análise de agrupamento hierárquicos com 8 grupos genotípicos com mais de 80% de similaridade, agrupando tanto isolados de Picinguaba quanto de Santa Virgínia. Através do sequenciamento parcial de fragmentos de gene rRNA 16S verificou-se que a estrutura das comunidades diazotróficas de Picinguaba e Santa Virgínia não apresentaram diferença estatisticamente significativa, indicando que não há seleção de populações bacterianas especificas nas áreas.Dos isolados testados, 88% apresentaram capacidade de nodular caupi, porém alguns não foram eficientes em promover o crescimento das plantas. Nas duas áreas predominou UTOs filogeneticamente associados ao gênero Paenibacillus nos nódulos, sugerindo que essas bactérias são importantes para nodulação de leguminosas na Mata Atlântica. / The Atlantic Rainforest is a major biome of the Brazilian coast, which harbors great diversity of flora and fauna, but little is known about its microbial diversity. Furthermore, little is known about the functional role of these abundant microorganisms. Several microorganisms are involved in cycling of the Atlantic Rainforests nitrogen, among them the diazotrophs which are of particular interest because they contribute to the direct input of nitrogen to ecosystems. The aim of this study was to evaluate the diversity of legumes nodulating diazotrophs in two permanent plots of the Serra do Mar State Park at different altitudes. Root nodules were collected throughout the four seasons. The bacteria were isolated from inside of the nodules, resulting in 105 isolates. The analysis of genetic diversity was performed using BOX-PCR and rRNA 16S sequencing. The nodulation capacity of the isolates was determined by the nodule formation in cowpea (Vigna unguiculata). The results indicated that there are spatial and temporal differences distribution in the areas studied. The largest number of nodules was found in the Picinguaba plot during seasons of low rainfall. The isolates showed a wide phenotypic diversity, hence divided into six groups with similar cultural characteristics. The BOX-PCR profiles formed eight genotypic groups with more than 80% similarity, when comparing the isolates from Picinguaba those from Santa Virginia. The BOX-PCR gel profiles showed variation in number and mobility of bands. The data was transformed into a binary matrix of presence and absence that allowed the hierarchical cluster analysis of eight genotypic groups with more than 80% similarity, again comparing both isolates Picinguaba and Santa Virginia. Through partial sequencing of 16S rRNA gene fragments no statistically significant difference was found between the diazotrophs community structures of Picinguaba the and that of Santa Virginia , indicating no selection for specific bacterial populations in these areas. In both isolates tested, 88% showed cowpea nodulating capacity, but some were not effective in promoting plant growth. In both areas OTUs phylogenetically associated with nodule of genus Paenibacillus predominated, suggesting that these bacteria are important for legume nodulation in the Atlantic Rainforest.

A Mata Atlântica é um importante bioma da costa brasileira, apresenta grande diversidade de plantas e animais, porém, pouco se sabe sobre a diversidade microbiana. Da mesma forma, pouco se sabe sobre o papel funcional desses microrganismos. Vários microrganismos estão envolvidos na ciclagem do nitrogênio na Mata Atlântica, e dentre eles os diazotróficos são de particular interesse, pois contribuem para o aporte direto de nitrogênio nos ecossistemas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade de bactérias diazotróficas que nodulam leguminosas em duas parcelas permanentes do Parque Estadual da Serra do Mar em diferentes altitudes. Nódulos de raízes foram coletados nas quatro estações do ano. As bactérias foram isoladas do interior dos nódulos, resultando em 105 isolados. A análise de diversidade genética destas bactérias foi feita utilizando-se BOX-PCR e sequenciamento parcial do gene 16S rRNA. A capacidade de nodulação dos isolados foi determinada através da formação de nódulos em caupi (Vignia unguiculata). Os resultados indicaram que há uma diferença na distribuição espacial e temporal dos nódulos nas áreas estudadas. A maior quantidade de nódulos foi encontrada na parcela de Picinguaba, em estações com menores índices pluviométricos. Os isolados apresentaram uma grande diversidade fenotípica, sendo separados em 6 grupos com características culturais semelhantes. Os perfis de BOX-PCR formaram 8 grupos genotípicos com mais de 80% de similaridade, agrupando tanto isolados de Picinguaba quanto de Santa Virgínia. Os perfis dos géis do BOX-PCR apresentaram variação no número e mobilidade das bandas. Os dados foram transformados em uma matriz binária de presença e ausência que possibilitou a análise de agrupamento hierárquicos com 8 grupos genotípicos com mais de 80% de similaridade, agrupando tanto isolados de Picinguaba quanto de Santa Virgínia. Através do sequenciamento parcial de fragmentos de gene rRNA 16S verificou-se que a estrutura das comunidades diazotróficas de Picinguaba e Santa Virgínia não apresentaram diferença estatisticamente significativa, indicando que não há seleção de populações bacterianas especificas nas áreas.Dos isolados testados, 88% apresentaram capacidade de nodular caupi, porém alguns não foram eficientes em promover o crescimento das plantas. Nas duas áreas predominou UTOs filogeneticamente associados ao gênero Paenibacillus nos nódulos, sugerindo que essas bactérias são importantes para nodulação de leguminosas na Mata Atlântica. / The Atlantic Rainforest is a major biome of the Brazilian coast, which harbors great diversity of flora and fauna, but little is known about its microbial diversity. Furthermore, little is known about the functional role of these abundant microorganisms. Several microorganisms are involved in cycling of the Atlantic Rainforests nitrogen, among them the diazotrophs which are of particular interest because they contribute to the direct input of nitrogen to ecosystems. The aim of this study was to evaluate the diversity of legumes nodulating diazotrophs in two permanent plots of the Serra do Mar State Park at different altitudes. Root nodules were collected throughout the four seasons. The bacteria were isolated from inside of the nodules, resulting in 105 isolates. The analysis of genetic diversity was performed using BOX-PCR and rRNA 16S sequencing. The nodulation capacity of the isolates was determined by the nodule formation in cowpea (Vigna unguiculata). The results indicated that there are spatial and temporal differences distribution in the areas studied. The largest number of nodules was found in the Picinguaba plot during seasons of low rainfall. The isolates showed a wide phenotypic diversity, hence divided into six groups with similar cultural characteristics. The BOX-PCR profiles formed eight genotypic groups with more than 80% similarity, when comparing the isolates from Picinguaba those from Santa Virginia. The BOX-PCR gel profiles showed variation in number and mobility of bands. The data was transformed into a binary matrix of presence and absence that allowed the hierarchical cluster analysis of eight genotypic groups with more than 80% similarity, again comparing both isolates Picinguaba and Santa Virginia. Through partial sequencing of 16S rRNA gene fragments no statistically significant difference was found between the diazotrophs community structures of Picinguaba the and that of Santa Virginia , indicating no selection for specific bacterial populations in these areas. In both isolates tested, 88% showed cowpea nodulating capacity, but some were not effective in promoting plant growth. In both areas OTUs phylogenetically associated with nodule of genus Paenibacillus predominated, suggesting that these bacteria are important for legume nodulation in the Atlantic Rainforest.