Over the past three decades, nitric oxide (NO) has been recognised as one of the most versatile and important players in many aspects of physiology, including immune responses. More recently, S-nitrosylation, the incorporation of a NO moiety into a protein thiol group, has emerged as a major post-translational modification (PTM) during pathophysiological responses in plants and animals. The main goal of this work was to investigate the role of S-nitrosylation in physiology and innate immunity of animals using the genetic reference system, Drosophila melanogaster. The S-nitrosylated derivative of glutathione (GSH), S-nitrosoglutathione (GSNO), is the main non-protein S-nitrosothiol (SNO) in the cell and extracellular fluids. GSNO can trans-S-nitrosylate other thiols and is considered a reservoir of NO bioactivity. The levels of GSNO and total S-nitrosylation have been shown to be controlled by S-nitrosoglutathione reductase (GSNOR) in yeast, plants and mammals. By employing an overlapping deletion technique to knock-out gsnor, a role for S-nitrosylation in the immune response of D. melanogaster is proposed. Compared to wild type flies, gsnor overlapping deletion flies presented lower expression of antimicrobial peptides in response to infections, and succumbed more rapidly to both Gram-positive bacterial and fungal pathogens. As the Toll pathway mediates responses against these pathogens, key components of this network were tested for their propensity to being S-nitrosylated. Two CLIP-domain serine proteases of the Toll signalling pathway, Persephone (PSH) and Spätzle-Processing Enzyme (SPE), were shown to be S-nitrosylated both in vitro and in vivo and this process seemed to control the quaternary structure of these proteins and interfere with the immune response of D. melanogaster. At least for PSH, S-nitrosylation at C254 has an immune significance as the expression of non-Snitrosylable PSHC254S in gsnor knock-out flies partially recovered the resistance of these animals to infections with the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana. These findings might represent a novel mechanism by which NO and S-nitrosylation regulate immunity. Further results presented in this thesis reveal an interplay between reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) in D. melanogaster physiology and immunity. Similarly to what has been reported in Arabidopsis thaliana, gsnor knock-out flies presented higher tolerance to the herbicide paraquat, an inducer of superoxide (O2 -) production. Moreover, additional mutations in Catalase (Cat), a hydrogen peroxide (H2O2) scavenger enzyme, partially restored the immunodeficiency phenotypes of gsnor knock-out flies. These findings suggest an inter-relation between the levels of ROS and RNS during stress responses of plants and animals. In addition, CRISPR/Cas9 technology was employed to generate gsnor knock-outs in the genome of D. melanogaster. These flies were shown to have no GSNOR activity, presented lower tolerance to pharmacological-induced nitrosative stress and succumbed faster to infections with B. bassiana compared to wild type flies. These results support the role played by GSNOR in regulating NO homeostasis and immunity in D. melanogaster.

A hipertensão acomete aproximadamente 1 bilhão de pessoas em todo o mundo, no entanto, a sua etiologia exata é em muitos casos indefinida e o mecanismo de ação molecular não foi elucidado completamente. O óxido nítrico ( ) é liberado de forma contínua nos vasos de resistência, contribuindo para o controle fisiológico da pressão arterial, sendo que a redução em sua biodisponibilidade está correlacionada com o desenvolvimento da hipertensão. Durante muito tempo, acreditava-se que o nitrato e o nitrito eram apenas metabólitos inertes da via do e somente em 1994 foi demonstrado que o nitrito, derivado do nitrato, era um substrato para a produção do no estômago, de modo que a administração de nitrito de sódio exerce efeitos anti-hipertensivos. De fato, há diversas evidências demonstrando os efeitos do nitrito sobre a pressão arterial, porém, não há um consenso sobre o seu mecanismo de ação. Trabalhos recentes sugerem que os efeitos antihipertensivo do nitrito se baseiam na geração de S-nitrosotióis no estômago e na capacidade destas moléculas em nitrosar proteínas da parede vascular, alterando a sua função. Há diversas proteínas da parede vascular com função crítica no controle do tônus vascular que podem ser alvos para a nitrosação. Neste trabalho, optamos por avaliar o processo de nitrosação na sinalização do receptor -adrenérgico em ratos hipertensos e normotensos tratados com nitrito de sódio ou veículo pela via oral por 7 dias. Também foi realizada a incubação de anéis de aorta com nitrito de sódio ou S-nitrosoglutationa na presença ou ausência de ascorbato. O tratamento com nitrito de sódio oral por 7 dias foi responsável por reduzir a pressão arterial sistólica dos animais hipertensos e aumentar as quantidades de nitrito e espécies nitrosadas no plasma. Também foi observado uma redução na reatividade aórtica à fenilefrina em animais tratados com nitrito, sendo que este efeito é abolido na presença de ascorbato. A incubação de anéis de aorta com nitrito de sódio não demonstrou causar efeitos sobre a reatividade vascular, porém, o pré-tratamento com S-nitrosoglutationa seguido da sua remoção foi responsável por reduzir a reatividade aórtica à fenilefrina e aumentar a quantidade de proteínas nitrosadas na aorta. Estes efeitos também foram abolidos pela incubação com ascorbato. Estes resultados nos sugerem que os S-nitrosotióis, e não o nitrito, exercem efeito anti-hipertensivo através da redução da reatividade vascular na aorta, modulando a sinalização do receptor -adrenérgico. Estes efeitos aparentam se basear na nitrosação de proteínas, visto que a incubação com ascorbato é responsável por abolir estes efeitos e há um aumento na quantidade de proteínas nitrosadas na aorta após a pré-incubação com S-nitrosoglutationa / Hypertension affects approximately 1 billion people worldwide, however, its exact etiology is in many cases indefinite and the mechanism of molecular action has not been elucidated completely. Nitric oxide ( ) is released continuously in resistance vessels, contributing to the physiological control of blood pressure, and the reduction in its bioavailability is correlated with the development of hypertension. For a long time, it was believed that nitrate and nitrite were only inert metabolites of the pathway, and it was only in 1994 that nitrite derived from nitrate was shown to be a substrate for the production of in the stomach, so that administration of sodium nitrite exerts antihypertensive effects. In fact, there is a lot of evidence demonstrating the effects of nitrite on blood pressure, but there is no consensus on its mechanism of action. Recent work has suggested that the antihypertensive effects of nitrite are based on the generation of S-nitrosothiols in the stomach and on the ability of these molecules to nitrosate proteins in the vascular wall, altering their function. There are several vascular wall proteins with critical function in vascular tone control that may be targets for nitrosation. In this work, we chose to evaluate the process of nitrosation in -adrenergic receptor signaling in hypertensive and normotensive rats treated with sodium nitrite or vehicle orally for 7 days. Aortic rings were also incubated with sodium nitrite or S-nitrosoglutathione in the presence or absence of ascorbate. Treatment with oral sodium nitrite for 7 days was responsible for reducing the systolic blood pressure of hypertensive animals and increasing the amounts of nitrite and nitrosated species in the plasma. A reduction in aortic reactivity to phenylephrine has also been observed in nitrite treated animals, and this effect is abolished in the presence of ascorbate. The incubation of aortic rings with sodium nitrite was not shown to have an effect on vascular reactivity, however, pre-treatment with S-nitrosoglutathione followed by its removal was responsible for reducing aortic reactivity to phenylephrine and increasing the amount of nitrosated proteins in the aorta. These effects were also abolished by incubation with ascorbate. These results suggest that S-nitrosothiols, not nitrite, exert an antihypertensive effect by reducing vascular reactivity in the aorta, modulating -adrenergic receptor signaling. These effects appear to be based on protein nitrosation, since incubation with ascorbate is responsible for abolishing these effects and there is an increase in the amount of nitrosated proteins in the aorta after preincubation with S-nitrosoglutathione

Orientadores: Marcelo Ganzarolli de Oliveira, Lício Augusto Velloso / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-19T04:20:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_GabrielaFreitasPereirade_D.pdf: 2358320 bytes, checksum: 5cf57adeef1d3cfe0789e7a9320c4569 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: No presente estudo foram investigadas as ações fisiológicas associadas ao óxido nítrico (NO), obtidas topicamente na mucosa gástrica e sistemicamente nas administrações orais de dois S-nitrosotióis (RSNOs) doadores de NO, S-nitrosoglutationa (GSNO) e S-nitroso-N-acetilcisteína (SNAC) em modelos animais. A aplicação tópica ex-vivo de soluções de RSNOs na mucosa gástrica de ratos Sprague-Dawley levou ao aumento dose-dependente do fluxo sanguíneo gástrico (FSG), medido por fluxometria por laser-Doppler, com FSG máximo c.a. 5 x maior do que os obtidos pela aplicação de soluções equimolares de nitrito ou nitrato. A administração oral de soluções de GSNO e SNAC se refletiu em aumentos tempo e dose-dependentes do nível plasmático de nitrito+nitrato em camundongos Swiss. A administração de SNAC na doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) induzida em camundongos ob/ob ou Swiss não levou a alterações significativas na histologia hepática ou no padrão de aumento de massa dos animais. O acompanhamento cinético da estabilidade de soluções aquosas de GSNO e SNAC em função do pH e a identificação de seus produtos de decomposição, permitiram demonstrar que esses RSNOs se decompõem predominantemente através de mecanismos de hidrólise catalisada por ácido ou base com meias vidas máximas em torno do pH fisiológico. Observou-se que camundongos Swiss submetidos à dieta hiperlipídica apresentam um perfil heterogêneo de ganho de massa, que permite estabelecer uma correlação tempo-dependente da propensão e da resistência à obesidade com alterações nas expressões de neuropeptídios hipotalâmicos e na resistência à insulina e intolerância à glicose / Abstract: In the present study, the nitric oxide (NO)-associated physiological actions obtained topically on the gastric mucosa and systemically in oral administrations of two NO donors-S-nitrosothiols (RSNOs), S-nitrosoglutathione (GSNO) and S-nitroso-N-acetylcysteine (SNAC) were investigated in animal models. The topical ex vivo administration of RSNOs solutions on the gastric mucosa of Sprague-Dawley rats led to a dose-dependent increase in the gastric blood flow (GBF), measured by laser-Doppler flowmetry, with maximum GBF value c.a. 5 x higher than those obtained by equimolar applications of nitrite and nitrate solutions. The oral administration of GSNO and SNAC solutions was reflected in a time and dose-dependent increases in the plasma nitrite+nitrate level in Swiss mice. SNAC administration on non alcoholic fatty liver disease (NAFLD) induced in ob/ob or Swiss mice did not lead to significant changes in liver histology or in the mass gain pattern of the animals. The kinetic monitoring of the stability of aqueous GSNO and SNAC solutions as a function of pH and the identification of their decomposition products allowed to demonstrate that these RSNOs decay predominantly through mechanisms of acid or base-catalyzed hydrolysis, with maximum half-lives around the physiological pH. It was observed that Swiss mice fed a high-fat diet show an heterogeneous mass gain profile, which allows establishing a time-dependent correlation of obesity propensity and resistance with changes in the expressions of hypothalamic neuropeptides and in insulin resistance and glucose tolerance / Doutorado / Físico-Química / Doutor em Ciências

Orientadores: Marta Helena Krieger, Regina Celia Spadari-Bratfisch / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T07:50:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Garcia_JoseAntonioDias_D.pdf: 1987747 bytes, checksum: 1ec8d731703522ccf42a42dafd7b13a7 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Recentemente demonstrou-se que S-nitroso-N-acetilcisteína (SNAC) atenua o desenvolvimento da placa de aterosclerose na aorta em cerca de 55% de camundongos deficientes do receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDLr-/-). O presente estudo teve como objetivo: i) verificar se a deleção do gene do receptor de LDL pode alterar o perfil hemodinâmico e a resposta inotrópica do coração a agentes adrenérgicos; ii) determinar a capacidade do SNAC na prevenção das alterações estruturais e funcionais do miocárdio e; iii) verificar o efeito do SNAC na pressão arterial de camundongos hipercolesterolêmicos. Camundongos machos C57BL6 (Wild Type = WT) e camundongos LDLr-/- (S) foram alimentados com dieta comercial por 15 dias. Em relação aos camundongos WT, os camundongos S apresentaram aumento de 11% na pressão arterial, diminuição de 62% na contratilidade do átrio esquerdo, e aumento na expressão do CD40L e redução na expressão de NOSe no tecido ventricular esquerdo. Camundongos LDLr-/- alimentados com dieta enriquecida em 1,25% de colesterol, 20% de gordura e 0,5% de ácido cólico por 15dias (Chol) apresentaram hipertrofia ventricular esquerda (HVE) comparados aos camundongos S, a qual foi caracterizada por: a) aumento de 1,25 vezes na razão entre o peso ventricular esquerdo (mg) e o peso corporal (g) (4,17±0,09 vs 3,34±0,07 mg/g, respectivamente; p< 0,05); b) aumento do diâmetro dos cardiomiócitos (25±0,6 vs 19±0,7 µm, p<0.05); c) aumento na expressão das isoformas das NOS (óxido nítrico sintases) e hiperexpressão do CD40L; d) aumento do depósito de colágeno; e) sem alterações na performance contrátil do átrio esquerdo e na responsividade à noradrenalina. A administração do SNAC aos camundongos Chol (chol+SNAC) (0,51 µmol/kg/dia, i.p.), preveniu o aumento na razão do peso ventricular esquerdo (mg) e o peso corporal (g) (3.38±0.23 mg/g), no diâmetro dos cardiomiócitos (20±0.7 µm), no deposito de colágeno, na expressão das isoformas da NOS e a hiperexpressão do CD40L. O SNAC não apresentou efeito no aumento da pressão arterial e nem sobre a hipocontratilidade, mas recuperou a responsividade para noradrenalina. Em conclusão, o presente estudo demonstrou que camundongos com deleção do gene do receptor LDL apresentaram hipertensão e marcada redução contrátil. Essas características podem estar relacionados com o estresse oxidativo resultante do processo inflamatório e da hipoexpressão da NOSe. A dieta hiperlipídica promoveu hipertrofia ventricular esquerda (HVE), devida ao aumento nos processos inflamatório e oxidativo. O SNAC impediu o desenvolvimento da HVE por mecanismos que envolveram efeito antiinflamatório (detectado pela diminuição na expressão do CD40L), a hiperexpressão das NOS, a redução das alterações estruturais ventriculares induzidas pela hipercolesterolemia de maneira independente da hipertensão. No presente estudo, a necessidade de quantificar as análises histológicas exigiu a validação de um software interativo para analisar imagens de amostras teciduais. O software foi projetado para permitir que o usuário altere os tipos de coloração vermelha, verde e azul (RGB) para uma cor padrão que possa ser usada para segmentar a imagem e calcular a fração da área de interesse. Os resultados obtidos com a contagem manual e com a contagem feita com o uso do software foram similares, indicando que são métodos alternativos confiáveis para análises quantitativas de cortes histológicos. Entretanto, o software permite processar as imagens de maneira eficiente e confiável, além de reproduzir o corte tecidual em um menor tempo, e pode ser executado com o microscópio e o computador padrão / Abstract: Recently, it has been that S-nitroso-N-acetylcysteine (SNAC) attenuate in 55% the plaque development in low-density lipoprotein-receptor-deficient (LDLr-/-) mice fed a hypercholesterolemic diet for 15 days. The present study was designed to verify whether deletion of the low-density lipoprotein (LDL) receptor gene may affect the hemodynamic profile and adrenergic inotropic cardiac responses and, particularly, to identify the ability of SNAC to prevent the myocardial alterations and hypertension in hypercholesterolemic mice. C57BL6 wild-type (WT) and LDLr-/- male mice (S) were fed a commercial diet for 15 days. Control mice (S) showed 11 % blood pressure increase, 62% left atrial contractility decrease, CD40L overexpression and eNOS underexpression in comparison to WT. LDLr-/- mice which were fed for 15 days with 1,25% cholesterol, 20% of fat and 0.5% of colic acid enriched diet (Chol), showed significant left ventricular hypertrophy (LVH) versus S, which was characterized by: a) 1.25-fold increase in the LV weight (mg)/body weight (g) ratio (4.17±0.09 vs. 3.34±0.07 mg/g, respectively; p<0.05); b) increased cardiomyocyte diameter (25±0.6 vs. 19±0.7 µm, p<0.05); c) enhanced expression of the constitutive and inducible NOS isoforms and CD40L;d) increased collagen deposit; e) no alteration in the atrial contractile performance or responsiveness to norepinephrine. Administration of SNAC to Chol mice ( Chol +SNAC) (0.51 µmol/kg/day, for 15day, i.p.) prevented increases in the left ventricular weight/body weight ratio (3.38±0.23 mg/g), cardiomyocyte diameter (20±0.7 µm), collagen deposit, NOS isoforms and CD40L overexpression, but had no effect on increased blood pressure or atrial basal hypocontractility, although it recovered responsiveness to norepinephrine. In conclusion, the present study demonstrated that the deletion of the LDL receptor gene in mice determined hypertension and a marked left atrial contractile deficit. These findings may be related to oxidative stress, resulting from inflammation and eNOS underexpression. High-cholesterol diet promoted LVH in LDLr-/- mice associated with enhanced inflammatory and oxidant processes. SNAC prevented LVH by processes that involved decreased CD40L expression and NOS overexpression effects attenuating the ventricular structural alterations induced by hypercholesterolemia independent of hypertension. Histological quantization demanded the development of interactive software for image analysis of tissue samples. The software was designed to allow a user-oriented change of a chosen red, green and blue (RGB) staining in a standardized color that can be used to segment the image and calculate the fractional area of interest. Thus the method allows efficient, reliable and reproducible processing of tissue sections that is less time-consuming than conventional methods and can be performed with standard microscope and computer / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

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