Orientadores: Eduardo Rochete Ropelle, José Rodrigo Pauli / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T03:45:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lenhare_Luciene_M.pdf: 1233501 bytes, checksum: 008c68d0add97d05e569e31f1aa030f4 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: SIRT1 são proteínas NAD+ dependentes que formam uma classe de proteínas com atividade desacetilase, que exercem um papel crítico na biogênese mitocondrial, homeostase da glicose e sensibilidade à insulina. No entanto o mecanismo pós-translacional de controle da atividade da SIRT1 permanece obscuro. No presente estudo investigou-se o papel da enzima Óxido Nítrico Sintase (iNOS) na S-nitrosação da SIRT1 no músculo de camundongos idosos. Primeiro identificou-se alto níveis da proteína iNOS no músculo esquelético de animais envelhecidos, tal fato foi acompanhado pelo aumento da S-nitrosação da SIRT1 e aumento da acetilação da PGC1? e FOXO1 levando ao comprometimento da biogênese mitocondrial. Foi demonstrado que o tratamento com óxido nítrico (NO) induziu a S-nitrosação da SIRT1 e reduziu a sua atividade desacetilase. Curiosamente, os camundongos knockout iNOS exibiram baixos níveis de S-nitrosação da SIRT1 e uma maior biogênese mitocondrial durante o envelhecimento, quando comparado com os camundongos do tipo selvagem. Finalmente, foi demonstrado que a S-nitrosação da SIRT1 é um mecanismo reversível, uma vez que a administração do inibidor farmacológico da iNOS (L-NIL) foi capaz de reduzir a S-nitrosação da SIRT1 e aumentar a atividade da SIRT1 incluindo a atividade dos seus substratos PGC1?, FOXO1 e AMPK no músculo de camundongos idosos. Coletivamente, o nosso estudo fornece evidências substanciais que a iNOS induz a S-nitrosação da SIRT1 e está associada com a diminuição da função mitocondrial no músculo esquelético de camundongos idosos / Abstract: SIRT1, an NAD + deacetylase -dependent, exerts a critical role on mitochondrial biogenesis, glucose homeostasis and insulin sensitivity. However, the post-translational mechanism that SIRT1 controls the activity remains unclear. Here we investigate the role of Nitric Oxide Sythase (iNOS) on SIRT1 S-nitrosation in muscle of old mice. First we identify high levels of iNOS protein levels the skeletal muscle of aged mice and it was accompanied by the augment of SIRT1 S-nitrosation, PGC1? and FOXO1 acetylation and impairment of mitochondrial biogenesis. We demonstrated that nitric oxide (NO) donor treatment induced SIRT1 S-nitrosation and it reduced deacetylase activity. Interestingly, iNOS knockout mice exhibited low levels of SIRT1 S-nitrosation and higher mitochondrial biogenesis during aging, when compared to wild type mice. Finally, we that demonstrated SIRT1 S-nitrosation is a reversible mechanism, once the pharmacological iNOS inhibitor (L-NIL) administration, reduced SIRT1 S-nitrosation and increase the activity of the SIRT1 substrates, including, PGC1?, FOXO1 and AMPK in muscle of old mice. Collectively, our study provides substantial evidences the SIRT1 induces iNOS S-nitrosation and it is associated with the impairment of mitochondrial function in the skeletal muscle of aged mice / Mestrado / Clinica Medica / Mestra em Clínica Médica

A hipertensão acomete aproximadamente 1 bilhão de pessoas em todo o mundo, no entanto, a sua etiologia exata é em muitos casos indefinida e o mecanismo de ação molecular não foi elucidado completamente. O óxido nítrico ( ) é liberado de forma contínua nos vasos de resistência, contribuindo para o controle fisiológico da pressão arterial, sendo que a redução em sua biodisponibilidade está correlacionada com o desenvolvimento da hipertensão. Durante muito tempo, acreditava-se que o nitrato e o nitrito eram apenas metabólitos inertes da via do e somente em 1994 foi demonstrado que o nitrito, derivado do nitrato, era um substrato para a produção do no estômago, de modo que a administração de nitrito de sódio exerce efeitos anti-hipertensivos. De fato, há diversas evidências demonstrando os efeitos do nitrito sobre a pressão arterial, porém, não há um consenso sobre o seu mecanismo de ação. Trabalhos recentes sugerem que os efeitos antihipertensivo do nitrito se baseiam na geração de S-nitrosotióis no estômago e na capacidade destas moléculas em nitrosar proteínas da parede vascular, alterando a sua função. Há diversas proteínas da parede vascular com função crítica no controle do tônus vascular que podem ser alvos para a nitrosação. Neste trabalho, optamos por avaliar o processo de nitrosação na sinalização do receptor -adrenérgico em ratos hipertensos e normotensos tratados com nitrito de sódio ou veículo pela via oral por 7 dias. Também foi realizada a incubação de anéis de aorta com nitrito de sódio ou S-nitrosoglutationa na presença ou ausência de ascorbato. O tratamento com nitrito de sódio oral por 7 dias foi responsável por reduzir a pressão arterial sistólica dos animais hipertensos e aumentar as quantidades de nitrito e espécies nitrosadas no plasma. Também foi observado uma redução na reatividade aórtica à fenilefrina em animais tratados com nitrito, sendo que este efeito é abolido na presença de ascorbato. A incubação de anéis de aorta com nitrito de sódio não demonstrou causar efeitos sobre a reatividade vascular, porém, o pré-tratamento com S-nitrosoglutationa seguido da sua remoção foi responsável por reduzir a reatividade aórtica à fenilefrina e aumentar a quantidade de proteínas nitrosadas na aorta. Estes efeitos também foram abolidos pela incubação com ascorbato. Estes resultados nos sugerem que os S-nitrosotióis, e não o nitrito, exercem efeito anti-hipertensivo através da redução da reatividade vascular na aorta, modulando a sinalização do receptor -adrenérgico. Estes efeitos aparentam se basear na nitrosação de proteínas, visto que a incubação com ascorbato é responsável por abolir estes efeitos e há um aumento na quantidade de proteínas nitrosadas na aorta após a pré-incubação com S-nitrosoglutationa / Hypertension affects approximately 1 billion people worldwide, however, its exact etiology is in many cases indefinite and the mechanism of molecular action has not been elucidated completely. Nitric oxide ( ) is released continuously in resistance vessels, contributing to the physiological control of blood pressure, and the reduction in its bioavailability is correlated with the development of hypertension. For a long time, it was believed that nitrate and nitrite were only inert metabolites of the pathway, and it was only in 1994 that nitrite derived from nitrate was shown to be a substrate for the production of in the stomach, so that administration of sodium nitrite exerts antihypertensive effects. In fact, there is a lot of evidence demonstrating the effects of nitrite on blood pressure, but there is no consensus on its mechanism of action. Recent work has suggested that the antihypertensive effects of nitrite are based on the generation of S-nitrosothiols in the stomach and on the ability of these molecules to nitrosate proteins in the vascular wall, altering their function. There are several vascular wall proteins with critical function in vascular tone control that may be targets for nitrosation. In this work, we chose to evaluate the process of nitrosation in -adrenergic receptor signaling in hypertensive and normotensive rats treated with sodium nitrite or vehicle orally for 7 days. Aortic rings were also incubated with sodium nitrite or S-nitrosoglutathione in the presence or absence of ascorbate. Treatment with oral sodium nitrite for 7 days was responsible for reducing the systolic blood pressure of hypertensive animals and increasing the amounts of nitrite and nitrosated species in the plasma. A reduction in aortic reactivity to phenylephrine has also been observed in nitrite treated animals, and this effect is abolished in the presence of ascorbate. The incubation of aortic rings with sodium nitrite was not shown to have an effect on vascular reactivity, however, pre-treatment with S-nitrosoglutathione followed by its removal was responsible for reducing aortic reactivity to phenylephrine and increasing the amount of nitrosated proteins in the aorta. These effects were also abolished by incubation with ascorbate. These results suggest that S-nitrosothiols, not nitrite, exert an antihypertensive effect by reducing vascular reactivity in the aorta, modulating -adrenergic receptor signaling. These effects appear to be based on protein nitrosation, since incubation with ascorbate is responsible for abolishing these effects and there is an increase in the amount of nitrosated proteins in the aorta after preincubation with S-nitrosoglutathione

Orientador: José Barreto Campello Carvalheira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T11:00:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Katashima_CarlosKiyoshi_M.pdf: 6242705 bytes, checksum: 14f5c6a197ed1c006f1c1b224511fe54 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O hipotálamo é uma região do sistema nervoso central que angaria informações do status nutricional e governa a liberação de múltiplos sinais metabólicos, tais como insulina e leptina para manutenção da homeostase energética. Entretanto, o aumento da prevalência de obesidade vem se revelando como um dos importantes fenômenos clínico-epidemiológicos da atualidade. Fatores como o hábito alimentar e o estilo de vida sedentário desempenham papel relevante na patogênese desta doença: Observação: O resumo, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The hypothalamus is a region of the central nervous system which raises and nutritional status information governing the release of multiple metabolic signals, such as leptin and insulin for maintenance of energy homeostasis. However, the increased prevalence of obesity is becoming one of the important clinical-epidemiological phenomena today. Factors such as eating habits and sedentary lifestyles play an important role in the pathogenesis of this disease ...Note: The complete abstract is available with the full electronic document / Mestrado / Clinica Medica / Mestre em Clinica Medica

Neste trabalho foram investigados os mecanismos e o perfil cinético de processos nitrosativos do ponto de vista da nitrosação do indicador 4,5-diamino fluoresceina (DAF2) em células do tipo RAW 264.7. Também foi investigado o papel que ferro lábil (LIP) exerce em tais processos. O estudo cinético mostrou que a nitrosação do DAF2 é dependente de superóxido intracelular e se processa por dois mecanismos distintos denominados nitrosilação oxidativa e nitrosação. Observou-se que o perfil cinético da nitrosaçao do DAF2 sofre uma transição passando de dependente para independente com relação à concentração de NO, quando a concentração de NO se aproxima de 100-110nM. Este perfil está relacionado com a dinâmica de recombinação entre NO e O2¯ que dispara todo o processo de nitrosação do DAF2. No trabalho fica claro que processos nitrosativos que ocorrem pelos mesmos mecanismos podem apresentar perfis cinéticos completamente diferentes dependendo da localização onde ocorre a recombinação entre NO e O2¯. O ponto mais interessante foi a constatação de que quelantes permeáveis à membranas biológicas estimulam a nitrosação do DAF2 intracelular. Este efeito é decorrente da remoção de LIP intracelular que, surpreendementemente, apresenta papel antinitrosativo nas condições experimentais estudadas. O papel incomum antinitrosativo apresentado por LIP é analizado do ponto de vista da reação entre LIP e ONOO¯ que tem como produto nitrito, uma espécie não nitrosante. Estes resultados podem alterar a forma como LIP é visto em processos oxidativos e nitrosativos. / In this work, we investigated the mechanisms and kinetic profiles of nitrosative processes using fluorescent indicator 4,5-diaminofluorescein (DAF2) in RAW 264.7 cells. The labile iron pool (LIP) influence in nitrosative processes was also evaluated. Intracellular DAF2 nitrosation is superoxide dependent and proceeds by two distinct mechanisms: Oxidative nitrosylation and nitrosation. The former mechanism is the most relevant under all experimental conditions tested. Interestingly, the DAF2 nitrosation rate increases linearly with NO concentration of up 100-110 nM but thereafter undergoes a sharp transition and becomes insensitive to NO. This peculiar kinetic behavior has never been reported and it is linked with NO and superoxide recombination dynamics. When NO reaches a concentration capable to outcompete superoxide dismutase for superoxide, the rate of DAF2 nitrosation becomes insensitive to NO. The most striking finding is the LIP´s influence in nitrosative processes. LIP removal by cell membrane permeable metal chelantors increases DAF2 nitrosation rate significantly, suggesting tha LIP can act as an anti-nitrosant species. This increase is probably related with LIP´s direct reaction with peroxynitrite, wich produces non-nitrosant species like nitrite. This controversial LIP´s anti-nitrosative role in cellular systems is rather interesting since it can change the way we understand it´s role in nitrosative and oxidative processes.

Neste trabalho foram investigados os mecanismos e o perfil cinético de processos nitrosativos do ponto de vista da nitrosação do indicador 4,5-diamino fluoresceina (DAF2) em células do tipo RAW 264.7. Também foi investigado o papel que ferro lábil (LIP) exerce em tais processos. O estudo cinético mostrou que a nitrosação do DAF2 é dependente de superóxido intracelular e se processa por dois mecanismos distintos denominados nitrosilação oxidativa e nitrosação. Observou-se que o perfil cinético da nitrosaçao do DAF2 sofre uma transição passando de dependente para independente com relação à concentração de NO, quando a concentração de NO se aproxima de 100-110nM. Este perfil está relacionado com a dinâmica de recombinação entre NO e O2¯ que dispara todo o processo de nitrosação do DAF2. No trabalho fica claro que processos nitrosativos que ocorrem pelos mesmos mecanismos podem apresentar perfis cinéticos completamente diferentes dependendo da localização onde ocorre a recombinação entre NO e O2¯. O ponto mais interessante foi a constatação de que quelantes permeáveis à membranas biológicas estimulam a nitrosação do DAF2 intracelular. Este efeito é decorrente da remoção de LIP intracelular que, surpreendementemente, apresenta papel antinitrosativo nas condições experimentais estudadas. O papel incomum antinitrosativo apresentado por LIP é analizado do ponto de vista da reação entre LIP e ONOO¯ que tem como produto nitrito, uma espécie não nitrosante. Estes resultados podem alterar a forma como LIP é visto em processos oxidativos e nitrosativos. / In this work, we investigated the mechanisms and kinetic profiles of nitrosative processes using fluorescent indicator 4,5-diaminofluorescein (DAF2) in RAW 264.7 cells. The labile iron pool (LIP) influence in nitrosative processes was also evaluated. Intracellular DAF2 nitrosation is superoxide dependent and proceeds by two distinct mechanisms: Oxidative nitrosylation and nitrosation. The former mechanism is the most relevant under all experimental conditions tested. Interestingly, the DAF2 nitrosation rate increases linearly with NO concentration of up 100-110 nM but thereafter undergoes a sharp transition and becomes insensitive to NO. This peculiar kinetic behavior has never been reported and it is linked with NO and superoxide recombination dynamics. When NO reaches a concentration capable to outcompete superoxide dismutase for superoxide, the rate of DAF2 nitrosation becomes insensitive to NO. The most striking finding is the LIP´s influence in nitrosative processes. LIP removal by cell membrane permeable metal chelantors increases DAF2 nitrosation rate significantly, suggesting tha LIP can act as an anti-nitrosant species. This increase is probably related with LIP´s direct reaction with peroxynitrite, wich produces non-nitrosant species like nitrite. This controversial LIP´s anti-nitrosative role in cellular systems is rather interesting since it can change the way we understand it´s role in nitrosative and oxidative processes.