O óxido nítrico (NO) é um mensageiro biológico que tem importância vital em muitos processos fisiológicos, tais como o controle cardiovascular, sinalização neural e defesa contra microrganismos e tumores. No entanto, a formação de outras espécies reativas, resultantes de reações químicas do NO com o ambiente biológico, impõe limites para o entendimento dos mecanismos celulares envolvidos em possíveis respostas biológicas. Devido ao potencial farmacológico e aos benefícios do NO, é de interesse o desenvolvimento de compostos que, quando estimulados, possam liberar esta molécula de forma controlada. Uma das possibilidades envolve complexos rutênionitrosilo termodinamicamente estáveis, mas que possam ser ativos sob estimulação. Este trabalho apresenta observações recentes de complexos rutênio-nitrosilo como agentes liberadores de NO e seus efeitos sobre linhagens de células B16-F10, L929 e Jukart. Para entender melhor o efeito NO como agente anticancerígeno o complexo [Ru(NO)(bdqi)(terpy)]Cl3 foi utilizado como agente doador de NO. O efeito biológico do composto, bem como o do seu produto após liberação de NO - [Ru(H2O)(bdqi)(terpy)]2+- foi avaliado pelos aspectos químicos e fotoquímicos. Os resultados mostraram que o NO, oriundo deste sistema, apresentou baixa citotoxicidade em células B16-F10. A atividade citotóxica foi maior quando o complexo foi encapsulado em nanopartículas lipídicas sólidas, diminuindo a viabilidade celular para cerca de 50 %. Além disso, sugere-se um efeito sinérgico da espécie aquo-rutênio, cuja viabilidade celular foi diminuída para 25% após 24 horas de incubação com este complexo. O efeito sinérgico do oxigênio singleto e NO foi também avaliado mediante a possibilidade de aplicação em terapia clínica. A produção de espécies radicalares de oxigênio tem sido utilizada para o tratamento do câncer, numa técnica conhecida como terapia fotodinâmica (TFD). O sucesso dessa terapia depende da concentração de oxigênio, e quando em hipóxia, geralmente culmina na formação reduzida de espécies reativas de oxigênio e consequente limitação clínica da TFD. Um dos objetivos deste trabalho é a avaliação do efeito sinérgico entre oxigênio singleto e NO. Para fins destes estudos, a espécie trinuclear [{Ru(NO)(bpy2)}2RuPc(pz)2](PF6)6 (I) foi sintetizada e proposta como fotogeradora de oxigênio singleto e NO. Ensaios fotobiológicos utilizando (I) a 0,4 ?M, em células B16-F10, resultaram na diminuição da viabilidade celular para 30% sob irradiação luminosa em 660 nm, ao final de 4 horas. Por outro lado, sem fotoestímulo e na mesma concentração do composto (I), a viabilidade celular foi de 90%. Estudos relacionados ao mecanismo de morte celular em consequência da ação do oxigênio singleto e NO gerados pelo composto (I) também foram discutidos neste trabalho. A possibilidade de aplicação de um sistema como o descrito em (I) no tratamento contra o câncer pode ser considerado interessante na terapia fotodinâmica / Nitric oxide (NO) is a biological messenger that has vital importance in many physiological processes, such as cardiovascular control, the neural signaling and defense against microorganisms and tumors. However, the formation of other reactive species, resulting from chemical reactions of NO with the biological environment, imposes limits on the understanding of the possible cellular mechanisms involved in biological responses. Due to potential pharmacological and benefits of NO, there is a need for development of compounds that can stabilize the NO until it\'s released. One possibility involves nitrosyl ruthenium complexes thermodynamically stable but actived under stimulation. In this work, the focus is on our recent investigations of nitrosyl ruthenium complexes as NO-delivery agents and their effects on B16-F10, L929 and Jukart cell lines. The high affinity of ruthenium for NO is a marked feature of its chemistry. To better understand the NO effect as anticancer agent it was used [Ru(NO)(bdqi)(terpy)]Cl3 complex as NO delivery agent. The biological effect of that nitrosyl compound and its subproduct after NO release - [Ru(H2O)(bdqi)(terpy)]2+- was evaluated as well as their chemical and photochemical studies. The results lead to the conclusion that NO released from [Ru(NO)(bdqi)(terpy)]3+ has low cytotoxicity effect in B16-F10 cell line but, when it is entrapped in solid lipid nanoparticles, this system is improved and cell viability decreases to 50 %. This effect seems to be dependent on cellular uptake of nitrosyl ruthenium complex. It is also suggested the synergistic activity of the aquoruthenium species once its cell viability decreases to around 25 % after 24 h of incubation with this complex. Synergistic effect of NO and singlet oxygen was also evaluated as a possibility to clinical therapy. Radical oxygen species generation has been used for cancer treatment in clinical therapy known as Photodynamic Therapy (PDT). The success of this therapy depends on oxygen concentration, and hypoxia usually culminates in diminished formation of reactive oxygen species triggering clinical failure of PDT. One of the aims of this thesis is propose synergistic effect of singlet oxygen and NO since it displays antitumor character depending on the NO concentration as an attempt to improve PDT. To this end, the trinuclear species [2RuPc(pz)2](PF6)6 (I) was synthesized and it has been proposed as NO and singlet oxygen photogenerator. Photobiological assays using (I) at 0,4 ?M in B16F10 cell line decreases cell viability to around 30 % under light irradiation at 660 nm, while at the same concentration of compound, without light (I) shows 90 % of cell viability. Studies concerning to cell death mechanism of this compound is also discussed in this work. The potential application of a system like (I) in clinical therapy against cancer must be considered an upgrade for photodynamic therapy.

O óxido nítrico (NO) é um mensageiro biológico que tem vital importância em muitos processos fisiológicos, tais como o controle cardiovascular, a sinalização neural e a defesa contra microorganismos e tumores. Sua natureza radicalar lhe confere grande reatividade e versatilidade e torna um desafio o entendimento de sua bioquímica. A molécula de NO reage rapidamente com alguns metais de transição e forma compostos estáveis denominados complexos nitrosilos, os quais podem ser utilizados como fonte geradora de óxido nítrico. Neste caso, faz-se necessário o entendimento do comportamento físico-químico desses compostos. No presente trabalho foram sintetizados os complexos: [RuII(terpy)(L)NO]n+ onde o ligante terpy = 2,2:6,2- terpiridina e L = cloreto (Cl-), 2,2-bipiridina (bpy), benzoquinonadiímina (bdqi-COOH) e benzoquinonadiamina (bdcat-COOH). Os estudos fotoquímicos e farmacológicos desses novos compostos do tipo [RuII(terpy)(L)NO]n+ foram feitos em meio aquoso. Os compostos nitrosilos de rutênio sintetizados mostraram fotolabilização do óxido nítrico (NO) sob irradiação em 355 nm com rendimento quântico de 0,14 0,02, 0,47 0,03 e 0,46 0,02 mol eistein-1 para L = bpy, bdqi-COOH e bdcat-COOH, respectivamente, e 0,0065 0,001 mol eistein-1 para irradiação em 532 nm a partir do complexo [Ru(bdqi-COOH)(terpy)NO]3+. O caminho fotoquímico para irradiação em 355 foi descrito envolvendo diferentes etapas de reação. No entanto, apenas um caminho reacional foi mais bem atribuído para a irradiação em 532 nm, envolvendo o mecanismo de transferência eletrônica fotoinduzida. O efeito de vasodilatador ocasionado pelo NO a partir da irradiação do complexo [Ru(bdqi-COOH)(terpy)NO]3+ na região do visível foi comparado ao nitroprussiato de sódio (NSP). Os resultados foram bastante semelhantes entre ambas as espécies. Similares estudos farmacológicos foram feitos para o complexo [Ru(NO2)(bpy)(terpy)]+ em meio fisiológico e sob irradiação em 355 nm. O mecanismo fotoquímico descrito para tal composto se baseia na formação de dois fotoprodutos, onde (I) há fotoaquação do fragmento RuII-NO2 produzindo as espécies RuII-H2O e NO2- e uma segunda etapa (II) devido à dissociação homolítica do NO a partir do nitrito coordenado, formando as espécie RuII-OH2 e NO. Baseado no mecanismo fotoquímico, o nitro complexo de rutênio foi incorporado a uma microemulsão água óleo (W/O) e utilizada em estudos de vasodilatação muscular. O tempo observado para o máximo de relaxamento muscular promovido pelo complexo [Ru(NO2)((bpy)terpy)]+ foi de 50 minutos. Todos os complexos nitrosilos de rutênio descritos neste trabalho foram avaliados como doadores de NO encapsulados em matrizes sólidas. Os complexos [RuII(terpy)(L)NO]n+ foram encapsulados em matrizes do tipo sol-gel e silicone e submetidos a irradiação na região do ultravioleta (355 nm) e visível (532 nm). Todos as matrizes mostraram se tratar de material amorfo. A microscopia eletrônica de varredura mostrou partículas com formas irregulares, com tamanho de 1000 m para ambas as matrizes e distribuição homogênea. A fotólise das matrizes encapsuladas com complexos nitrosilos de rutênio foram imersas em solução tampão pH = 7,40 e a 37,0 0C. A cinética de liberação de NO a partir desses sistemas mostrou ser do tipo primeira ordem . / Nitric oxide (NO) is a biological messenger. It has been implicated in many physiological processes, including cardiovascular control, neuronal signaling, and defence against microorganism and tumors. Its radicalar nature gives it great reactivity and versatility, and makes the knowledge of its biochemistry a challeng. The NO molecule reacts fast with some transition metal resulting stable compounds named nitrosyl complexes that can be used as nitric oxide producers. For such use, it is necessary a good understanding of the physical-chemical behavior of these complexes. In the present work, the following complexes were synthesized: [RuII(terpy)(L)NO]n+ where terpy = 2,2:6,2 - terpyridine and L = chloride (Cl- ), 2,2 -bipiridine (bpy), benzoquinonediimine (bdqi-COOH) e benzoquinonediamine (bdcat-COOH). The compounds were isolated and characterized by elementary analysis, by spectroscopy (UV-visible, infrared, and fluorescence), HPLC, electrochemical techniques (cyclic and differential pulse voltammetry) and spectroeletrochemistry. Infrared spectroscopy has show band at 1850 cm-1 1960 cm-1 region attributed, to nNO stretching. The oxidation state for benzoquinone ligands were also characterized by this technique and shows band at 1700 cm-1 and 1280 cm-1, for L = bdqi-COOH and bdcat-COOH species, respectively. UV-visible spectra have displayed bands in the ultraviolet region originated by p®p* transition of the unsatured ligands and bands in 350 - 380 nm region characterized as MLTC due dp(RuII)®p*(NO+) transition. The [Ru(bdqi-COOH)(terpy)NO]3+ spectrum has also shown the MLTC band in 510 nm due the dp(RuII)®p*(bdqi-COOH) transition. Electrochemical experiments have revealed two processes in the nitrosyl ligand: NO+/NO0 e NO0/NO-. The different nitrosyl redox potential depends on the inductive effects of ligand L. The complexes were irradiated in a Nd:YAG laser flash photolysis apparatus at ultraviolet (355 nm) and visible (532 nm) irradiation. During the irradiation the NO liberation was measured in situ by amperometry, and the solution spectral change was verified by UV-visible spectroscopy. The amperometric detection was done by a NO sensor electrode (NOmeter), which data were the base to calculate the quantum yields of NO liberation (fNO). For all complexes, fNO were determined in 355 nm light irradiation. The photochemical pathway at 355 nm light irradiation was described as a differents photochemical mechanism. The photochemical mechanism for NO releasing by [Ru(bdqi-COOH)(terpy)NO]3+ complex under 532 nm light irradiation involves an intramolecular photoinduced electron transfer. Biological studies showed that [Ru(bdqi-COOH)(terpy)NO]3+ complex can be considered a promising drug. Their vasodilatation action is similar to sodium nitroprusside (SNP) and cytotoxic action diminishi 74 % for celular viability for metastatic cell.

A atividade do óxido nítrico na Química e Biologia não é completamente conhecida. Centenas de artigos são publicados por ano, somente sobre este assunto. Muito mais estudos necessitam ser feitos nesta área. Cientistas no campo da Biologia que queiram estudar como o óxido nítrico se comporta em diferentes sistemas necessitam de algum tipo de composto modelo que libera NO, para auxiliá-los em seus estudos farmacocinéticos. O óxido nítrico (NO) é tão importante que há um grande desejo da sociedade cientifica em obter compostos que possibilitem liberá-lo. Ele apresenta aplicações diversificadas. Investigando a cinética de liberação de NO, poderemos saber como o mesmo pode ser aplicado nas mais diversas atividades, tais como: controlar a relaxação cardiovascular, pressão sanguínea ou mesmo o desenvolvimento do câncer. Neste trabalho sintetizamos e caracterizamos cis-[RuCl(NO)(bpy)2](PF6)2 e trans-[RuCl(NO)(bpy)2](PF6)2. Os valores obtidos para o complexo cis-[RuCl(NO)(bpy)2](PF6)2 por voltametria cíclica foram: E1/2= 0,21 V vs Fe ;UV-vis(298nm,332nm); FTIR:νNO= 1930 cm-1 ; para o complexo trans-[RuCl(NO)(bpy)2](PF6)2 a voltametria cíclica apresentou E1/2= 0,19 V vs Fe ;UV-vis (298nm,312nm); FTIR:νNO= 1921 cm-1. O desenvolvimento de sistemas de liberação de NO a partir de complexos nitrosilos de rutênio podem ser discutidos com particular referencia ao produto de necessidade médica. Uma compreensão apropriada das propriedades da molécula doadora de NO, em um sistema de liberação de fármaco, é essencial antes do uso de interesse na terapia clinica. Foram estudadas as propriedades físico-quimicas dos compostos cis / trans-[RuCl(NO)(bpy)2](PF6)2 em emulsão água / óleo (A/O) e avaliadas as taxas de liberação de NO encapsulado na fase aquosa interna da emulsão. O perfil de liberação de NO pelos complexos cis / trans-[RuCl(NO)(bpy)2](PF6)2 também foi estudada utilizando-se membrana de acetato de celulose, cujos resultados mostram um comportamento não linear com taxa de 4,53x10-4 mol/cm2 para a espécie cis-[RuCl(bpy)2NO]2+ e 3,33x10-4 mol/cm2 para a espécie trans-[RuCl(bpy)2NO]2+. A permeação transdérmica e a acumulação dos complexos cis /trans-[RuCl(bpy)2NO]2+ sobre a pele foi também estudada utilizando-se pele da orelha de porco. Os dados obtidos por espectro de absorção UV-visível exibiram aumentos da concentração acumulada dos complexos sobre a pele quando os mesmos foram formulados em emulsão na forma livre, para ambos os isômeros. Tais resultados mostraram que os complexos ficaram acumulados principalmente na epiderme. Também foram observados espectros UV-visível, utilizando-se acoplado um sensor seletivo para NO, que demonstraram que é possível liberar NO a partir dos complexos cis / trans-[RuCl(NO)(bpy)2](PF6)2 através da eletro-redução em meio aquoso ou em emulsão A/O, quando um potencial de 0,00 V vs Ag/AgCl foi aplicado. Estes resultados nos sugerem que o sistema de complexos de rutênio nitrosil veiculados em emulsão A/O poderia ser utilizado com sucesso no desenvolvimento de um sistema de liberação prolongada de NO / Nitric oxide activity in chemistry and biology is not yet fully discovered. There are more than 5,000 papers alone on this subject each year. A lot more work needs to be done in this area. For people in biology who want to study how nitric oxide works in different systems, they need some kind of model compound to release nitric oxide to help them do their pharmacokinetic studies. Nitric oxide (NO) is very important, there is a great need in the scientific society to have a compound that can release it. There are many applications. By investigating the nitric oxide releasing kinetics, we will know if it can be applied to any of these activities such as controlling cardiovascular relaxation, blood pressure or cancer growth. We have synthesized and characterized cis-[RuCl(NO)(bpy)2](PF6)2 and trans-[RuCl(NO)(bpy)2](PF6)2. We found that cis-[RuCl(NO)(bpy)2](PF6)2 show by cyclic voltammetry E1/2= 0,21 V vs Fe ;UV-vis(298nm,332nm); FTIR:νNO= 1930 cm-1 and trans-[RuCl(NO)(bpy)2](PF6)2 show by cyclic voltammetry E1/2= 0,19 V vs Fe ;UV-vis(298nm,312nm); FTIR:νNO= 1921 cm-1. The development of delivery systems for nitric oxide release from nitrosyl ruthenium complexes could be discussed with particular reference to the products of unmet medical needs. A proper understanding of the properties of the NO donor molecule in a drug delivery system is essential before an appropriate use in clinical therapy. We have studied the physical and chemical properties of cis/trans-[RuCl(bpy)2NO](PF6)2 in a water/oil emulsion (W/O) and evaluate release rates of nitric oxide encapsulated in internal aqueous phase. The cis/trans-[RuCl(bpy)2NO]2+ release was also studied with a cellulose membrane, which show non-linear behavior with rate of 4,53x10-4 mol/cm2 for cis-[RuCl(bpy)2NO]2+ and 3,33x10-4 mol/cm2 for trans-[RuCl(bpy)2NO]2+. The transdermal permeation and skin accumulation of is/trans-[RuCl(bpy)2NO]2+ on the percutaneous penetration was also studied through pig skin. Data showed that UV-vis absorber exhibited increases in skin accumulation when is formulated in emulsions in free form for both isomers. Those results showed that the complexes were mainly accumulated on epidermis. We also found by UV-visible and using a NO sensor that the cis/trans-[RuCl(bpy)2NO]2+ can release NO by electro-reduction in aqueous solution or in W/O emulsion when a potential of 0.0 V vs Ag/AgCl was applied. Those results suggest us that a W/O emulsion system bearing nitrosyl ruthenium complex could successfully be used in the development of long acting nitric oxide release system.

O óxido nítrico (NO) é um versátil agente biológico, atuando em diversas partes do organismo, tais como cérebro, artérias, sistema imunológico, fígado e pulmões. Alterações nos níveis basais de NO são relacionadas a causas de diversas doenças como hipertenção, câncer, doença de Raymond´s e agregação plaquetária. Visando suprir tal deficiência, mostrou-se de grande valia a obtenção de fármacos capazes de liberar quantidades significativas de NO e de maneira controlada. Uma das possibilidades é o uso de compostos de coordenação, com centro metálico rutênio coordenado ao ligante nitrosil, os quais possuem como característica liberação de NO por estímulo externo. Neste trabalho foram estudados as propriedades químicas, fotoquímicas, farmacológicas e tumoricidas do complexo trans-[RuC(MAC)NO]2+, onde MAC é 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano (cyclam) ou 1,4,8,12-tetraazaciclopentadecano ([15]aneN4), na presença do fotossensibilizador [Ru(NH3)5pz]2+. Os estudos fotoquímicos mostraram que o fotossensibilizador utilizado, [Ru(NH3)5pz]2+, possui tempo de vida no estado excitado de 113 ps, e apresenta processos de transferências eletrônicas e de energia fotoinduzida com o oxigênio molecular, gerando espécies reativas de oxigênio (EROS) como oxigênio singlete e ânion superóxido. Na presença do complexo macrocíclico trans-[RuC(MAC)NO]2+ a irradiação luminosa de [Ru(NH3)5pz]2+ na região do visível proporciona trasferência eletrônica fotoinduzida entre o fotosenssibilizador e o complexo nitrosilo com concomitante formação de NO. O rendimento quântico de NO (NO) é dependente do meio e é de cerca de 10-4 Einstein.mol.cm-1 em meio aquoso sob argônio e 10-2 Einstein.mol.cm-1 em meio oxigenado. Os estudos farmacológicos mostraram que a mistura proposta, em tampão fosfato pH 7,4, promoveu 75% de dilatação em musculatura de aorta pré-contraída com KC enquanto que, quando incorporados em sistemas carreadores de fármacos como emulsão óleo-em-água, HEG gel e membrana sol-gel, promoveram 40%, 35% e 35% de dilatação, respectivamente. A via vasodilatadora foi detectada como sendo pela ativação da GMPc (guanosina monofosfato cíclica), através da quantificação da concentração de cálcio citosólico. Os estudos das atividades anti-tumorais com os complexos doadores de NO foram realizados com linhagens celulares do tipo B16F10, Melan A, HL-60 WMs e Jurkat. Estes experimentos mostraram redução da viabilidade celular dos melanomas entre 50% e 75%, não apresentou ação em células normais (MelanA), mostrando-se seletivos ás células neoplasicas; e 95% de redução da viabilidade celular das células leucêmica (HL-60). Os resultados obtidos e descritos neste trabalho permitem vislumbrar que o uso de espécies doadoras de NO e oxigênio singlete possam ser utilizados no futuro em terapia clínica. / Nitric oxide (NO) is a multipurpose biological agent that shows important role in brain, arteries, immunological system, liver and lungs. The NO basal level alterations have correlation with several diseases as hypertension, cancer, Raymonds disease and platelet aggregation. Aiming supply this deficient NO level, it was necessary propose new compounds that can release NO at controlled manner. One of the possibilities is utilize nitrosyl ruthenium complexes that have ability to release NO under external stimulus. In this work we have studied, the chemical, photochemical, pharmacological and anti-tumoral properties of the trans-[RuC(MAC)NO]2+ complex, were MAC is 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane (cyclam) or 1,4,8,12-tetraazacyclopentadecane ([15]aneN4), in the presence of the sensitizer [Ru(NH3)5pz]2+. The photochemical studies of [Ru(NH3)5pz]2+ complex showed excited state lifetime of 113 ps and presented photoinduced electron and energy transfer with oxygen resulting in reactive oxygen species (ROS) generation as singlet oxygen and superoxide anion. In the presence of trans-[RuC(MAC)NO]2+ complex, the visible light irradiation of [Ru(NH3)5pz]2+ causes photoinduced electron transfer between the photosensitizer and the nitrosyl ruthenium complex resulting NO generation. The quantum yield (NO) is milieu dependent and showed 10-4 Einstein.mol.cm-1 in inert atmosphere and 10-2 Einstein.mol.cm-1 in aerated aqueous solution. The pharmacological studies showed that the proposed mixture in phosphate buffer, under visible irradiation, induce 75% of relaxation in aorta pre-contracted with KC while this system incorporated into drug delivery system as water-in-oil emulsion, HEG gel and sol-gel membrane, the nitric oxide generated induced 40%, 35% and 35% of relaxation, respectively. The quantification of cytosolic calcium concentration, using confocal image, showed that vasodilatation pathway observed was via cGMP (cyclic guanosine monophosphate) activation. The anti-tumoral studies using NO donors were carried out for B16F10, Melan A, HL-60, WMs and Jurkat cells. Those experiments showed decrease from 50% to 75% of cell viability of tumor cells and no toxicity in melanoma cells and 95% of reduction of leukemic cells (HL-60). The obtained results described in this work permit to glimpse that the use of NO donor species and singlet oxygen maybe is a useful tool in the future in clinical therapy.

O óxido nítrico (NO) é um mensageiro biológico que tem vital importância em muitos processos fisiológicos, tais como o controle cardiovascular, a sinalização neural e a defesa contra microorganismos e tumores. Sua natureza radicalar lhe confere grande reatividade e versatilidade e torna um desafio o entendimento de sua bioquímica. A molécula de NO reage rapidamente com alguns metais de transição e forma compostos estáveis denominados complexos nitrosilos, os quais podem ser utilizados como fonte geradora de óxido nítrico. Neste caso, faz-se necessário o entendimento do comportamento físico-químico desses compostos. No presente trabalho foram sintetizados os complexos: [RuII(terpy)(L)NO]n+ onde o ligante terpy = 2,2:6,2- terpiridina e L = cloreto (Cl-), 2,2-bipiridina (bpy), benzoquinonadiímina (bdqi-COOH) e benzoquinonadiamina (bdcat-COOH). Os estudos fotoquímicos e farmacológicos desses novos compostos do tipo [RuII(terpy)(L)NO]n+ foram feitos em meio aquoso. Os compostos nitrosilos de rutênio sintetizados mostraram fotolabilização do óxido nítrico (NO) sob irradiação em 355 nm com rendimento quântico de 0,14 0,02, 0,47 0,03 e 0,46 0,02 mol eistein-1 para L = bpy, bdqi-COOH e bdcat-COOH, respectivamente, e 0,0065 0,001 mol eistein-1 para irradiação em 532 nm a partir do complexo [Ru(bdqi-COOH)(terpy)NO]3+. O caminho fotoquímico para irradiação em 355 foi descrito envolvendo diferentes etapas de reação. No entanto, apenas um caminho reacional foi mais bem atribuído para a irradiação em 532 nm, envolvendo o mecanismo de transferência eletrônica fotoinduzida. O efeito de vasodilatador ocasionado pelo NO a partir da irradiação do complexo [Ru(bdqi-COOH)(terpy)NO]3+ na região do visível foi comparado ao nitroprussiato de sódio (NSP). Os resultados foram bastante semelhantes entre ambas as espécies. Similares estudos farmacológicos foram feitos para o complexo [Ru(NO2)(bpy)(terpy)]+ em meio fisiológico e sob irradiação em 355 nm. O mecanismo fotoquímico descrito para tal composto se baseia na formação de dois fotoprodutos, onde (I) há fotoaquação do fragmento RuII-NO2 produzindo as espécies RuII-H2O e NO2- e uma segunda etapa (II) devido à dissociação homolítica do NO a partir do nitrito coordenado, formando as espécie RuII-OH2 e NO. Baseado no mecanismo fotoquímico, o nitro complexo de rutênio foi incorporado a uma microemulsão água óleo (W/O) e utilizada em estudos de vasodilatação muscular. O tempo observado para o máximo de relaxamento muscular promovido pelo complexo [Ru(NO2)((bpy)terpy)]+ foi de 50 minutos. Todos os complexos nitrosilos de rutênio descritos neste trabalho foram avaliados como doadores de NO encapsulados em matrizes sólidas. Os complexos [RuII(terpy)(L)NO]n+ foram encapsulados em matrizes do tipo sol-gel e silicone e submetidos a irradiação na região do ultravioleta (355 nm) e visível (532 nm). Todos as matrizes mostraram se tratar de material amorfo. A microscopia eletrônica de varredura mostrou partículas com formas irregulares, com tamanho de 1000 m para ambas as matrizes e distribuição homogênea. A fotólise das matrizes encapsuladas com complexos nitrosilos de rutênio foram imersas em solução tampão pH = 7,40 e a 37,0 0C. A cinética de liberação de NO a partir desses sistemas mostrou ser do tipo primeira ordem . / Nitric oxide (NO) is a biological messenger. It has been implicated in many physiological processes, including cardiovascular control, neuronal signaling, and defence against microorganism and tumors. Its radicalar nature gives it great reactivity and versatility, and makes the knowledge of its biochemistry a challeng. The NO molecule reacts fast with some transition metal resulting stable compounds named nitrosyl complexes that can be used as nitric oxide producers. For such use, it is necessary a good understanding of the physical-chemical behavior of these complexes. In the present work, the following complexes were synthesized: [RuII(terpy)(L)NO]n+ where terpy = 2,2:6,2 - terpyridine and L = chloride (Cl- ), 2,2 -bipiridine (bpy), benzoquinonediimine (bdqi-COOH) e benzoquinonediamine (bdcat-COOH). The compounds were isolated and characterized by elementary analysis, by spectroscopy (UV-visible, infrared, and fluorescence), HPLC, electrochemical techniques (cyclic and differential pulse voltammetry) and spectroeletrochemistry. Infrared spectroscopy has show band at 1850 cm-1 1960 cm-1 region attributed, to nNO stretching. The oxidation state for benzoquinone ligands were also characterized by this technique and shows band at 1700 cm-1 and 1280 cm-1, for L = bdqi-COOH and bdcat-COOH species, respectively. UV-visible spectra have displayed bands in the ultraviolet region originated by p®p* transition of the unsatured ligands and bands in 350 - 380 nm region characterized as MLTC due dp(RuII)®p*(NO+) transition. The [Ru(bdqi-COOH)(terpy)NO]3+ spectrum has also shown the MLTC band in 510 nm due the dp(RuII)®p*(bdqi-COOH) transition. Electrochemical experiments have revealed two processes in the nitrosyl ligand: NO+/NO0 e NO0/NO-. The different nitrosyl redox potential depends on the inductive effects of ligand L. The complexes were irradiated in a Nd:YAG laser flash photolysis apparatus at ultraviolet (355 nm) and visible (532 nm) irradiation. During the irradiation the NO liberation was measured in situ by amperometry, and the solution spectral change was verified by UV-visible spectroscopy. The amperometric detection was done by a NO sensor electrode (NOmeter), which data were the base to calculate the quantum yields of NO liberation (fNO). For all complexes, fNO were determined in 355 nm light irradiation. The photochemical pathway at 355 nm light irradiation was described as a differents photochemical mechanism. The photochemical mechanism for NO releasing by [Ru(bdqi-COOH)(terpy)NO]3+ complex under 532 nm light irradiation involves an intramolecular photoinduced electron transfer. Biological studies showed that [Ru(bdqi-COOH)(terpy)NO]3+ complex can be considered a promising drug. Their vasodilatation action is similar to sodium nitroprusside (SNP) and cytotoxic action diminishi 74 % for celular viability for metastatic cell.

O óxido nítrico (NO) é um versátil agente biológico, atuando em diversas partes do organismo, tais como cérebro, artérias, sistema imunológico, fígado e pulmões. Alterações nos níveis basais de NO são relacionadas a causas de diversas doenças como hipertenção, câncer, doença de Raymond´s e agregação plaquetária. Visando suprir tal deficiência, mostrou-se de grande valia a obtenção de fármacos capazes de liberar quantidades significativas de NO e de maneira controlada. Uma das possibilidades é o uso de compostos de coordenação, com centro metálico rutênio coordenado ao ligante nitrosil, os quais possuem como característica liberação de NO por estímulo externo. Neste trabalho foram estudados as propriedades químicas, fotoquímicas, farmacológicas e tumoricidas do complexo trans-[RuC(MAC)NO]2+, onde MAC é 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano (cyclam) ou 1,4,8,12-tetraazaciclopentadecano ([15]aneN4), na presença do fotossensibilizador [Ru(NH3)5pz]2+. Os estudos fotoquímicos mostraram que o fotossensibilizador utilizado, [Ru(NH3)5pz]2+, possui tempo de vida no estado excitado de 113 ps, e apresenta processos de transferências eletrônicas e de energia fotoinduzida com o oxigênio molecular, gerando espécies reativas de oxigênio (EROS) como oxigênio singlete e ânion superóxido. Na presença do complexo macrocíclico trans-[RuC(MAC)NO]2+ a irradiação luminosa de [Ru(NH3)5pz]2+ na região do visível proporciona trasferência eletrônica fotoinduzida entre o fotosenssibilizador e o complexo nitrosilo com concomitante formação de NO. O rendimento quântico de NO (NO) é dependente do meio e é de cerca de 10-4 Einstein.mol.cm-1 em meio aquoso sob argônio e 10-2 Einstein.mol.cm-1 em meio oxigenado. Os estudos farmacológicos mostraram que a mistura proposta, em tampão fosfato pH 7,4, promoveu 75% de dilatação em musculatura de aorta pré-contraída com KC enquanto que, quando incorporados em sistemas carreadores de fármacos como emulsão óleo-em-água, HEG gel e membrana sol-gel, promoveram 40%, 35% e 35% de dilatação, respectivamente. A via vasodilatadora foi detectada como sendo pela ativação da GMPc (guanosina monofosfato cíclica), através da quantificação da concentração de cálcio citosólico. Os estudos das atividades anti-tumorais com os complexos doadores de NO foram realizados com linhagens celulares do tipo B16F10, Melan A, HL-60 WMs e Jurkat. Estes experimentos mostraram redução da viabilidade celular dos melanomas entre 50% e 75%, não apresentou ação em células normais (MelanA), mostrando-se seletivos ás células neoplasicas; e 95% de redução da viabilidade celular das células leucêmica (HL-60). Os resultados obtidos e descritos neste trabalho permitem vislumbrar que o uso de espécies doadoras de NO e oxigênio singlete possam ser utilizados no futuro em terapia clínica. / Nitric oxide (NO) is a multipurpose biological agent that shows important role in brain, arteries, immunological system, liver and lungs. The NO basal level alterations have correlation with several diseases as hypertension, cancer, Raymonds disease and platelet aggregation. Aiming supply this deficient NO level, it was necessary propose new compounds that can release NO at controlled manner. One of the possibilities is utilize nitrosyl ruthenium complexes that have ability to release NO under external stimulus. In this work we have studied, the chemical, photochemical, pharmacological and anti-tumoral properties of the trans-[RuC(MAC)NO]2+ complex, were MAC is 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane (cyclam) or 1,4,8,12-tetraazacyclopentadecane ([15]aneN4), in the presence of the sensitizer [Ru(NH3)5pz]2+. The photochemical studies of [Ru(NH3)5pz]2+ complex showed excited state lifetime of 113 ps and presented photoinduced electron and energy transfer with oxygen resulting in reactive oxygen species (ROS) generation as singlet oxygen and superoxide anion. In the presence of trans-[RuC(MAC)NO]2+ complex, the visible light irradiation of [Ru(NH3)5pz]2+ causes photoinduced electron transfer between the photosensitizer and the nitrosyl ruthenium complex resulting NO generation. The quantum yield (NO) is milieu dependent and showed 10-4 Einstein.mol.cm-1 in inert atmosphere and 10-2 Einstein.mol.cm-1 in aerated aqueous solution. The pharmacological studies showed that the proposed mixture in phosphate buffer, under visible irradiation, induce 75% of relaxation in aorta pre-contracted with KC while this system incorporated into drug delivery system as water-in-oil emulsion, HEG gel and sol-gel membrane, the nitric oxide generated induced 40%, 35% and 35% of relaxation, respectively. The quantification of cytosolic calcium concentration, using confocal image, showed that vasodilatation pathway observed was via cGMP (cyclic guanosine monophosphate) activation. The anti-tumoral studies using NO donors were carried out for B16F10, Melan A, HL-60, WMs and Jurkat cells. Those experiments showed decrease from 50% to 75% of cell viability of tumor cells and no toxicity in melanoma cells and 95% of reduction of leukemic cells (HL-60). The obtained results described in this work permit to glimpse that the use of NO donor species and singlet oxygen maybe is a useful tool in the future in clinical therapy.

A atividade do óxido nítrico na Química e Biologia não é completamente conhecida. Centenas de artigos são publicados por ano, somente sobre este assunto. Muito mais estudos necessitam ser feitos nesta área. Cientistas no campo da Biologia que queiram estudar como o óxido nítrico se comporta em diferentes sistemas necessitam de algum tipo de composto modelo que libera NO, para auxiliá-los em seus estudos farmacocinéticos. O óxido nítrico (NO) é tão importante que há um grande desejo da sociedade cientifica em obter compostos que possibilitem liberá-lo. Ele apresenta aplicações diversificadas. Investigando a cinética de liberação de NO, poderemos saber como o mesmo pode ser aplicado nas mais diversas atividades, tais como: controlar a relaxação cardiovascular, pressão sanguínea ou mesmo o desenvolvimento do câncer. Neste trabalho sintetizamos e caracterizamos cis-[RuCl(NO)(bpy)2](PF6)2 e trans-[RuCl(NO)(bpy)2](PF6)2. Os valores obtidos para o complexo cis-[RuCl(NO)(bpy)2](PF6)2 por voltametria cíclica foram: E1/2= 0,21 V vs Fe ;UV-vis(298nm,332nm); FTIR:νNO= 1930 cm-1 ; para o complexo trans-[RuCl(NO)(bpy)2](PF6)2 a voltametria cíclica apresentou E1/2= 0,19 V vs Fe ;UV-vis (298nm,312nm); FTIR:νNO= 1921 cm-1. O desenvolvimento de sistemas de liberação de NO a partir de complexos nitrosilos de rutênio podem ser discutidos com particular referencia ao produto de necessidade médica. Uma compreensão apropriada das propriedades da molécula doadora de NO, em um sistema de liberação de fármaco, é essencial antes do uso de interesse na terapia clinica. Foram estudadas as propriedades físico-quimicas dos compostos cis / trans-[RuCl(NO)(bpy)2](PF6)2 em emulsão água / óleo (A/O) e avaliadas as taxas de liberação de NO encapsulado na fase aquosa interna da emulsão. O perfil de liberação de NO pelos complexos cis / trans-[RuCl(NO)(bpy)2](PF6)2 também foi estudada utilizando-se membrana de acetato de celulose, cujos resultados mostram um comportamento não linear com taxa de 4,53x10-4 mol/cm2 para a espécie cis-[RuCl(bpy)2NO]2+ e 3,33x10-4 mol/cm2 para a espécie trans-[RuCl(bpy)2NO]2+. A permeação transdérmica e a acumulação dos complexos cis /trans-[RuCl(bpy)2NO]2+ sobre a pele foi também estudada utilizando-se pele da orelha de porco. Os dados obtidos por espectro de absorção UV-visível exibiram aumentos da concentração acumulada dos complexos sobre a pele quando os mesmos foram formulados em emulsão na forma livre, para ambos os isômeros. Tais resultados mostraram que os complexos ficaram acumulados principalmente na epiderme. Também foram observados espectros UV-visível, utilizando-se acoplado um sensor seletivo para NO, que demonstraram que é possível liberar NO a partir dos complexos cis / trans-[RuCl(NO)(bpy)2](PF6)2 através da eletro-redução em meio aquoso ou em emulsão A/O, quando um potencial de 0,00 V vs Ag/AgCl foi aplicado. Estes resultados nos sugerem que o sistema de complexos de rutênio nitrosil veiculados em emulsão A/O poderia ser utilizado com sucesso no desenvolvimento de um sistema de liberação prolongada de NO / Nitric oxide activity in chemistry and biology is not yet fully discovered. There are more than 5,000 papers alone on this subject each year. A lot more work needs to be done in this area. For people in biology who want to study how nitric oxide works in different systems, they need some kind of model compound to release nitric oxide to help them do their pharmacokinetic studies. Nitric oxide (NO) is very important, there is a great need in the scientific society to have a compound that can release it. There are many applications. By investigating the nitric oxide releasing kinetics, we will know if it can be applied to any of these activities such as controlling cardiovascular relaxation, blood pressure or cancer growth. We have synthesized and characterized cis-[RuCl(NO)(bpy)2](PF6)2 and trans-[RuCl(NO)(bpy)2](PF6)2. We found that cis-[RuCl(NO)(bpy)2](PF6)2 show by cyclic voltammetry E1/2= 0,21 V vs Fe ;UV-vis(298nm,332nm); FTIR:νNO= 1930 cm-1 and trans-[RuCl(NO)(bpy)2](PF6)2 show by cyclic voltammetry E1/2= 0,19 V vs Fe ;UV-vis(298nm,312nm); FTIR:νNO= 1921 cm-1. The development of delivery systems for nitric oxide release from nitrosyl ruthenium complexes could be discussed with particular reference to the products of unmet medical needs. A proper understanding of the properties of the NO donor molecule in a drug delivery system is essential before an appropriate use in clinical therapy. We have studied the physical and chemical properties of cis/trans-[RuCl(bpy)2NO](PF6)2 in a water/oil emulsion (W/O) and evaluate release rates of nitric oxide encapsulated in internal aqueous phase. The cis/trans-[RuCl(bpy)2NO]2+ release was also studied with a cellulose membrane, which show non-linear behavior with rate of 4,53x10-4 mol/cm2 for cis-[RuCl(bpy)2NO]2+ and 3,33x10-4 mol/cm2 for trans-[RuCl(bpy)2NO]2+. The transdermal permeation and skin accumulation of is/trans-[RuCl(bpy)2NO]2+ on the percutaneous penetration was also studied through pig skin. Data showed that UV-vis absorber exhibited increases in skin accumulation when is formulated in emulsions in free form for both isomers. Those results showed that the complexes were mainly accumulated on epidermis. We also found by UV-visible and using a NO sensor that the cis/trans-[RuCl(bpy)2NO]2+ can release NO by electro-reduction in aqueous solution or in W/O emulsion when a potential of 0.0 V vs Ag/AgCl was applied. Those results suggest us that a W/O emulsion system bearing nitrosyl ruthenium complex could successfully be used in the development of long acting nitric oxide release system.

O NO é uma molécula endógena, envolvida em numerosos processos fisiológicos e patológicos. Diversas substâncias capazes de liberar NO in vivo têm sido estudadas, incluindo os complexos nitrosilo de rutênio, como o [Ru(terpy)(bdqi-COOH)NO](PF6)3, capaz de liberar NO após fotoestímulo. Considerando que as funções específicas do NO dependem de sua localização e cinética de liberação, e que a sua aplicação tópica pode evitar possíveis efeitos colaterais, o objetivo deste trabalho foi estudar a absorção cutânea passiva e iontoforética do complexo [Ru(bdqi-COOH)(terpy)(NO)](PF6)3, assim como a do NO dele liberado. A atividade citotóxica do complexo também foi estudada em cultura de células tumorais A431 na presença e ausência de luz e de corrente elétrica. Foi desenvolvido e validado um método analítico para a quantificação do complexo de rutênio por CLAE e estudos de pré-formulação de solubilidade, coeficiente de partilha e estabilidade do complexo foram realizados antes dos estudos de penetração cutânea. O complexo de rutênio manteve-se estável em solução aquosa a temperatura ambiente até o período de 48h, mas instável em contato com a pele inteira, com a degradação de 61% após 8h. Em contato apenas com o estrato córneo (EC), no entanto, a degradação do complexo não foi considerada significativa após 4 h. A aplicação de uma corrente elétrica fraca a uma solução do complexo em pH fisiológico não alterou a estabilidade do mesmo, que não apresentou degradação significativa por 6h. Nos estudos de penetração passiva, observou-se por CLAE e por espectrometria de massas com fonte de plasma acoplado (ICP-MS) que o complexo foi capaz de penetrar o EC sem sofrer degradação, mas liberando parte do NO quando em contato com a epiderme viável. A aplicação da iontoforese aumentou significativamente a quantidade de rutênio na epiderme viável e solução receptora (6 e 15 vezes respectivamente), indicando maior penetração do complexo. O complexo Ru-NO assim como seu aquo complexo (formado após liberação do NO), não apresentaram citotoxicidade às células A431, na ausência de luz. A irradiação das células incubadas com o complexo, passivamente, em 377 e 532nm com diferentes doses também não acarretou morte celular significativa. No entanto, a aplicação de corrente elétrica constante (0,3mA cm-2) seguida de incubação por 4h com o complexo levou a morte celular de aproximadamente 50% das células A431 após irradiação em 377 nm com a dose de 10J cm-2. Para atingir este mesmo resultado com a irradiação em 532nm foi necessário aumentar o tempo de incubação com o complexo para 24h. Conclui-se, resumidamente, que a corrente elétrica aumentou a entrada do complexo na pele e nas células, levando a liberação de maior quantidade de NO dentro delas, com consequente morte celular. A liberação do NO do complexo estudado ocorre não apenas por estímulo luminoso mas também por reações de oxi-redução quando em contato com a pele ou com a cultura de células estudadas. Sendo assim, propõe-se a encapsulação deste complexo em sistemas de liberação com o intuito de controlar a liberação do NO. Experimentos preliminares de nanopartículas contendo o complexo estão descritos no Apêndice 1 desta tese. / NO is an endogenous molecule that is involved in numerous physiological and pathological processes. Several compounds capable of releasing NO in vivo have been studied, including nitrosyl ruthenium complexes such as the [Ru (terpy)(bdqi-COOH)NO](PF6)3 that is capable of releasing NO after photo-stimulus. Because the specific role of NO depends on its location and kinetics of release, and its topical application may avoid possible side effects, the aim of this work was to study the passive and the iontophoretic skin absorption of the [Ru(terpy)(bdqi-COOH)NO](PF6)3 complex, as well as its NO release. The cytotoxic activity of the complex was also studied in A431 tumor cells in the presence and absence of light and electrical current. An analytical method for the quantification of the ruthenium complex by HPLC was developed and validated; studies of pre-formulation such as solubility, partition coefficient and stability of the complex were also performed before the penetration studies. The ruthenium complex was stable in aqueous solution at room temperature for 48 hours, but unstable in contact with the full-thickness skin (61% was degraded after 8 h). However, the complexs contact for 4 h with the stratum corneum (SC) alone did not lead to the complex degradation. The application of a weak electric current in a solution of the complex at physiological pH did not affect its stability, which showed no significant degradation for 6 h. In the passive penetration studies it was observed, by HPLC and inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS), that the complex was able to penetrate the SC without degradation, but with some NO release when in contact with the epidermis. The application of iontophoresis significantly increased the amount of ruthenium in the viable epidermis and in the receiver solution (6 and 15 times, respectively), indicating greater complex penetration. The nitrosyl ruthenium complex and its aquo complex (formed after release of NO) showed no cytotoxicity to A431 cells in the absence of light. The irradiation of the cells incubated with the complex, passively, in 377 and 532 nm with different doses also did not cause significant cell death. However, the application of a constant electric current (0.3 mA cm-2) for 30 min followed by incubation for 4 h with the complex led to approximately 50% of A431 cell death after irradiation at 377 nm with a dose of 10J cm-2. To achieve this same result with irradiation at 532 nm it was necessary to increase the incubation time with the complex for 24 hours. In summary, the electric current increased the nitrosyl ruthenium complex skin and cell penetration, leading to release of higher amounts of NO into them, with consequent cell death. Furthermore, the release of NO from the ruthenium complex is showed to happen not only by light stimuli but also by redox reactions when it is in contact with the skin or with the culture of cells studied. Therefore, we propose the encapsulation of this complex in delivery systems in order to control the release of NO. Preliminary experiments with nanoparticles containing the complex are described in Appendix 1.

O NO é uma molécula endógena, envolvida em numerosos processos fisiológicos e patológicos. Diversas substâncias capazes de liberar NO in vivo têm sido estudadas, incluindo os complexos nitrosilo de rutênio, como o [Ru(terpy)(bdqi-COOH)NO](PF6)3, capaz de liberar NO após fotoestímulo. Considerando que as funções específicas do NO dependem de sua localização e cinética de liberação, e que a sua aplicação tópica pode evitar possíveis efeitos colaterais, o objetivo deste trabalho foi estudar a absorção cutânea passiva e iontoforética do complexo [Ru(bdqi-COOH)(terpy)(NO)](PF6)3, assim como a do NO dele liberado. A atividade citotóxica do complexo também foi estudada em cultura de células tumorais A431 na presença e ausência de luz e de corrente elétrica. Foi desenvolvido e validado um método analítico para a quantificação do complexo de rutênio por CLAE e estudos de pré-formulação de solubilidade, coeficiente de partilha e estabilidade do complexo foram realizados antes dos estudos de penetração cutânea. O complexo de rutênio manteve-se estável em solução aquosa a temperatura ambiente até o período de 48h, mas instável em contato com a pele inteira, com a degradação de 61% após 8h. Em contato apenas com o estrato córneo (EC), no entanto, a degradação do complexo não foi considerada significativa após 4 h. A aplicação de uma corrente elétrica fraca a uma solução do complexo em pH fisiológico não alterou a estabilidade do mesmo, que não apresentou degradação significativa por 6h. Nos estudos de penetração passiva, observou-se por CLAE e por espectrometria de massas com fonte de plasma acoplado (ICP-MS) que o complexo foi capaz de penetrar o EC sem sofrer degradação, mas liberando parte do NO quando em contato com a epiderme viável. A aplicação da iontoforese aumentou significativamente a quantidade de rutênio na epiderme viável e solução receptora (6 e 15 vezes respectivamente), indicando maior penetração do complexo. O complexo Ru-NO assim como seu aquo complexo (formado após liberação do NO), não apresentaram citotoxicidade às células A431, na ausência de luz. A irradiação das células incubadas com o complexo, passivamente, em 377 e 532nm com diferentes doses também não acarretou morte celular significativa. No entanto, a aplicação de corrente elétrica constante (0,3mA cm-2) seguida de incubação por 4h com o complexo levou a morte celular de aproximadamente 50% das células A431 após irradiação em 377 nm com a dose de 10J cm-2. Para atingir este mesmo resultado com a irradiação em 532nm foi necessário aumentar o tempo de incubação com o complexo para 24h. Conclui-se, resumidamente, que a corrente elétrica aumentou a entrada do complexo na pele e nas células, levando a liberação de maior quantidade de NO dentro delas, com consequente morte celular. A liberação do NO do complexo estudado ocorre não apenas por estímulo luminoso mas também por reações de oxi-redução quando em contato com a pele ou com a cultura de células estudadas. Sendo assim, propõe-se a encapsulação deste complexo em sistemas de liberação com o intuito de controlar a liberação do NO. Experimentos preliminares de nanopartículas contendo o complexo estão descritos no Apêndice 1 desta tese. / NO is an endogenous molecule that is involved in numerous physiological and pathological processes. Several compounds capable of releasing NO in vivo have been studied, including nitrosyl ruthenium complexes such as the [Ru (terpy)(bdqi-COOH)NO](PF6)3 that is capable of releasing NO after photo-stimulus. Because the specific role of NO depends on its location and kinetics of release, and its topical application may avoid possible side effects, the aim of this work was to study the passive and the iontophoretic skin absorption of the [Ru(terpy)(bdqi-COOH)NO](PF6)3 complex, as well as its NO release. The cytotoxic activity of the complex was also studied in A431 tumor cells in the presence and absence of light and electrical current. An analytical method for the quantification of the ruthenium complex by HPLC was developed and validated; studies of pre-formulation such as solubility, partition coefficient and stability of the complex were also performed before the penetration studies. The ruthenium complex was stable in aqueous solution at room temperature for 48 hours, but unstable in contact with the full-thickness skin (61% was degraded after 8 h). However, the complexs contact for 4 h with the stratum corneum (SC) alone did not lead to the complex degradation. The application of a weak electric current in a solution of the complex at physiological pH did not affect its stability, which showed no significant degradation for 6 h. In the passive penetration studies it was observed, by HPLC and inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS), that the complex was able to penetrate the SC without degradation, but with some NO release when in contact with the epidermis. The application of iontophoresis significantly increased the amount of ruthenium in the viable epidermis and in the receiver solution (6 and 15 times, respectively), indicating greater complex penetration. The nitrosyl ruthenium complex and its aquo complex (formed after release of NO) showed no cytotoxicity to A431 cells in the absence of light. The irradiation of the cells incubated with the complex, passively, in 377 and 532 nm with different doses also did not cause significant cell death. However, the application of a constant electric current (0.3 mA cm-2) for 30 min followed by incubation for 4 h with the complex led to approximately 50% of A431 cell death after irradiation at 377 nm with a dose of 10J cm-2. To achieve this same result with irradiation at 532 nm it was necessary to increase the incubation time with the complex for 24 hours. In summary, the electric current increased the nitrosyl ruthenium complex skin and cell penetration, leading to release of higher amounts of NO into them, with consequent cell death. Furthermore, the release of NO from the ruthenium complex is showed to happen not only by light stimuli but also by redox reactions when it is in contact with the skin or with the culture of cells studied. Therefore, we propose the encapsulation of this complex in delivery systems in order to control the release of NO. Preliminary experiments with nanoparticles containing the complex are described in Appendix 1.

O óxido nítrico (NO) é um versátil agente biológico, atuando em diversas partes do organismo, tais como cérebro, artérias, sistema imunológico, fígado e pulmões. Sua natureza radicalar lhe confere grande reatividade e versatilidade, tornando o entendimento de sua bioquímica um desafio. A molécula de NO tende a reagir rapidamente com alguns metais de transição, formando compostos estáveis denominados complexos nitrosilos, os quais podem ser utilizados como fonte geradora de óxido nítrico. A liberação de NO a partir de complexos nitrosilos pode ocorrer por redução química, eletroquímica e fotoquímica. No presente trabalho foi estudada a obtenção, caracterização e permeação cutânea de um complexo nitrosilo de rutênio, o trans-[RuC(cyclam)(NO)]C2 (cyclam-NO), que associado ao fotossensibilizador protoporfirina IX, possui a peculiaridade de absorver na região do visível, podendo então ser aplicados na terapia fotodinâmica (TFD) para tratamento de câncer de pele. A mistura dos compostos foi incorporada em nanodispersões de cristais líquidos, de fase cúbica (DFC) e de fase hexagonal (DFH), e sua penetração/permeação in vitro em pele de modelo animal foi avaliada, assim como o comportamento fotoquímico do sistema, no que se refere à liberação de NO, visando uma futura aplicação em TFD. A atividade citotóxica dos compostos isolados e em mistura foi avaliada frente às linhagens B16F10 e Melan-A, na ausência e presença de luz, mostrando maior atividade da mistura dos compostos quando irradiados em 630 nm. Foram construídos diagramas de fase binário e ternário e, a partir destes, foram escolhidas as formulações a serem estudadas. Estas formulações foram caracterizadas por microscopia de luz polarizada e difração de raios-X e foram avaliados o tamanho médio de partícula e o índice de polidispersividade das nanodispersões obtidas e sua estabilidade por turbidimetria. Também foi analisada a liberação de oxigênio singlete e de NO a partir dos compostos em solução e destes incorporados nas formulações. Foi desenvolvido e validado um método analítico por cromatografia líquida de alta eficiência para a quantificação simultânea dos compostos nos experimentos. A liberação dos compostos a partir das formulações usando membrana de acetato de celulose também foi avaliada, sendo possível detectar apenas o cyclam-NO. O estudo da eficiência de encapsulação mostrou que cerca de 70% da quantidade adicionada dos compostos foi incorporado na DFC e cerca de 80% na DFH. Os experimentos in vitro de permeação e retenção dos compostos em pele de orelha de porco mostraram aumento significativo da concentração dos compostos, comparado a controles contendo os mesmos em PEG. A DFH promoveu um aumento na concentração de PpIX no estrato córneo (EC) de 2,6 vezes e na epiderme+derme se EC ([E+D]) de 3,4 vezes, e para o cyclam-NO de 2,7 vezes no EC e 2,4 vezes na [E+D]. Já a DFC aumentou em 1,6 vezes a quantidade de PpIX no EC e 1,9 vezes na [E+D] e em 4,6 vezes a quantidade de cyclam-NO no EC e em 2,0 vezes na [E+D]. Os resultados obtidos permitem sugerir que estes sistemas são adequados para utilização como potenciais carreadores para a associação cyclam-NO e PpIX na TFD do câncer de pele e que esta associação apresentou efeito sinérgico, sendo mais eficiente que a utilização de apenas um dos compostos. / Nitric oxide (NO) is a versatile biological agent, acting in several parts of the body such as brain, arteries, immune system, liver and lungs. Its radical nature gives great versatility and reactivity, making the understanding of its biochemical a challenge. The NO molecule tends to react quickly with some transition metals, forming stable compounds called nitrosyl complexes, which can be used as a source of nitric oxide. NO release from nitrosyl complexes can occur by chemical, electrochemical or photochemical reduction. In this work, the acquisition, characterization and permeation of a nitrosyl ruthenium complex, trans-[RuC(cyclam)(NO)]C2 (cyclam-NO), which associated with the photosensitizer protoporphyrin IX, has the peculiarity of absorbing in the visible region, and could then be applied in photodynamic therapy (PDT) for treatment of skin cancer, were studied. The mixture of compounds was incorporated into liquid crystal nanodispersions, cubic (DFC) and hexagonal (DFH) phases, and its penetration/permeation in vitro in an animal model skin was evaluated, as well as the photochemical behavior of the system, with regard to NO release, seeking a future application in PDT. The cytotoxic activity of the compounds alone and in combination was evaluated against the B16F10 and Melan-A cell lines, in the absence and in the presence of light. Binary and ternary phase diagrams were constructed, and from these, the formulations to be studied were chosen. These formulations were characterized by polarized light microscopy and X-ray diffraction and were evaluated for particle size and polydispersity index of nanodispersions obtained and their stability by turbidimetry. Also, the release of singlet oxygen and NO from the compounds in solution and incorporated in the formulations was discussed. An analytical method using high efficiency liquid chromatography was developed and validated for simultaneous quantification of compounds in the experiments. The release of compounds from formulations using cellulose acetate membrane was evaluated, and only the cyclam-NO could be detect. The study of the encapsulation efficiency showed that about 70% of the added amount of the compounds was incorporated in the DFC and approximately 80% in DFH. In vitro permeation and retention experiments of the compounds in pig ear skin were performed, showing a significant increase in the concentration of the compounds in the skin layers, compared to controls containing compounds in polyethylene glycol. The DFH promoted an increase in the concentration of PpIX in the stratum corneum (EC) of 2.6 times and in the epidermis + dermis without EC ([E + D]) of 3.4 times, and the cyclam-NO by 2.7 times for EC and 2.4 times in the [E + D]. DFC already increased by 1.6 times the amount of PpIX in EC and 1.9 times at the [E+D] and 4.6 times the amount of cyclam-NO in EC and 2.0 times in the [E + D]. The results may suggest that these systems are suitable for use as potential carriers for the association of cyclam-NO and PpIX for use in skin cancer PDT and that this association showed a synergistic effect, being more efficient than the use of only one of the compounds.