Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La nitración de proteínas en tirosina in vivo es reconocida como un marcador de estrés oxidativo. Se ha asociado un aumento en su concentración con diversas patologías tales como alzheimer, isquemia, enfermedad obstructiva pulmonar crónica, artritis reumatoide, osteoartritis, entre otras. Con el objetivo de describir el comportamiento de la nitración de proteínas en tirosina en articulación metacarpofalángica equina con un grado leve de osteoartritis (OA), se sometieron a “western blot” homogeneizados de membrana sinovial de equino postmortem para detectar 3-nitrotirosina (3-NT). Se clasificaron las muestras en dos grupos de 10 articulaciones de acuerdo al recuento de células nucleadas (RCN) presentes en el líquido sinovial: grupo A, con un RCN menor a 1.000 células por μL de líquido sinovial y; grupo B, con un RCN igual o mayor a 1.000 células por μL de líquido sinovial. Se realizó un análisis histológico del cartílago articular de ambos grupos, encontrándose una mayor cantidad de grupos isógenos en el grupo B. Por lo tanto, este grupo se encontraba en una etapa inicial de OA. En el “western blot” se observó una reacción inespecífica del anticuerpo secundario con albúmina de equino. Sin embargo, al incubar con los anticuerpos primario y secundario se encontró una mayor intensidad en esta banda. No se detectó la presencia de otras proteínas nitradas en ambos grupos. Como control positivo se usó líquido sinovial proveniente de una articulación metacarpofalángica con un cuadro séptico. Una parte de este líquido sinovial fue sometido a estrés nitrosativo in vitro con peroxinitrito y la otra fue utilizada como control. En ambas muestras se detectaron bandas proteicas nitradas en tirosina pero se observó una mayor intensidad en la muestra tratada con peroxinitrito. En conclusión, no hay diferencia en el grado de 3-NT de membranas sinoviales provenientes de articulación metacarpofalángica equina normal y con OA temprana

Os mecanismos oxidativos pelos quais macrófagos exercem atividade microbicida permanecem em discussão, e estudos com hospedeiros animais serão essenciais para elucidar tal questão. Nesse trabalho, estudamos os mecanismos microbicidas de macrófagos in vivo comparando parâmetros de infecção nas lesões de camundongos resistentes (C57Bl/6) e suscetíveis (BALB/c) ao protozoário Leishmania amazonensis. A comparação mostrou que o controle da infecção pelos camundongos resistentes é dependente da ativação de macrófagos com expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível, síntese de óxido nítrico e extensa nitração e hidroxilação das proteínas dos parasitas dentro dos fagolisossomos dos macrófagos. O principal agente tóxico aos parasitas parece ser derivado do peroxinitrito porque a nitração dos parasitas ocorreu na ausência virtual de células polimorfonucleares e foi acompanhada de hidroxilação. Além disso, tempol um inibidor de reações de nitração mediadas por peroxinitrito, inibiu a nitração de proteínas da lesão e aumentou o número de parasitas nelas presentes. Também, estudos com parasitas em cultura confirmaram que o peroxinitrito é citotóxico aos parasitas enquanto o óxido nítrico é citostático. O camundongo suscetível se mostrou capaz de sintetizar óxido nítrico mas o fez em estágios tardios da infecção e, provavelmente, em resposta a uma infecção secundária por bactérias. Tomados conjuntamente, os resultados indicam que o peroxinitrito e radicais dele derivados são os principais agentes leishmanicidas produzidos por macrófagos in vivo. / Macrophage oxidative microbicidal mechanisms remain debatable and their elucidation is likely to depend on studies with mammalian hosts. To examine macrophage microbicidal mechanisms in vivo, we compared infection parameters in the lesions of resistant (C57Bl/6) and susceptible (BALB/c) mice to the protozoan Leishmania amazonensis. This comparison demonstrated that infection control by resistant mice relied on macrophage activation with inducible nitric oxide synthase expression, nitric oxide synthesis and extensive nitration and hydroxylation of the proteins of the parasites inside macrophage phagolysosomes. The toxic agent to the parasite is likely to be peroxynitrite-derived because parasite nitration occurred in the virtual absence of polymorphonuclear cells and was accompanied by parasite hydroxylation. In addition, tempol, an inhibitor of peroxynitrite-mediated nitrations, inhibited protein nitration of the lesions and increased the number of parasites in them. Also, studies with parasite cultures confmed that peroxynitrite is cytotoxic to the parasites whereas nitric oxide is cytostatic. The susceptible mice were also able to synthesize nitric oxide but only at late infection time and, most likely, in response to a secondary bacterial infection. Taken together, the results indicate that peroxynitrite and derived radicals are the main leishrnanicidal agents produced by macrophages in vivo.

In this work we developed an electrochemical sensor modified with multi-walled carbon nanotubes and 5-nitroindole (5-NI) for the simultaneous determination of ascorbic (AA) and uric (UA) acids in urine and serum samples and a biosensor based on dsDNA for determination of 3-nitro-L-tyrosine ethyl ester (3NO2TEE), as a biomarker of biological peroxynitration. The polymer of 5-NI was electrogenerated in situ on the carbon nanotubes deposited on glassy carbon electrode (GCE). Thereafter, the aromatic nitro group, present in the molecule, was reduced, generating a hydroxylamine/nitroso redox couple, then used for detection and quantification of the analytes in the biological samples. The electrochemical behavior of the modified electrodes were studied using cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry and chronoamperometry, which were used for the detection of the analytes and to obtain the kinetic parameters and the analytical characterization of the platforms. The chronoamperometric studies were performed in order to obtain more information about the redox processes between AA and the sensor, since it proved to be an electrocatalytic process. Thus, by means of graphs and Cottrell equations, it was possible to obtain values for the diffusion coefficient (DAA) and the catalytic constant (kcat) for the AA electrocatalytic oxidation. The values for DAA and kcat, determined for AA were 4.2 x10-6 cm-2 s-1 and 1.1 x 106 M-1 s-1, respectively. The platform for the detection of AA e AU showed good sensitivity and stability in urine and serum samples, with LOD of 1.9 mol L-1 for AA and 2.1 mol L-1 for UA. The analytical performance obtained for the nanostructured platform GCE/MWCNT/poly-5-NID justifies its use as a sensor for the simultaneous determination of AA and UA. Studies of 3NO2TEE in protic media (pH 4.5 acetate buffer and pH 7.4 and 10.0, in phosphate buffer) and in aprotic media (DMF/TBAPF6, 0.1 mol L-1), using Pt and glassy carbon electrodes, were necessary before the construction of the CT-DNA biosensor. The spectrolectrochemistry of 3NO2TEE, held in aprotic media was useful for rationalizing the electrochemical behavior of 3NO2TEE and intermediates generated during the reduction. For the biosensor construction, the amount of dsDNA, the conditioning time for reduction of the analyte, the pH value, on GCE, were optimized. The developed biosensor was used to determine the concentration of 3NO2TEE and showed a linear range from 60 to 320 nmol L-1 and LOD and LOQ of 58 nmol L-1 and 200 nmol L-1, respectively. These results indicate that the prepared sensor and biosensor were effective for the detection of substances with biological interest. (P.S.: some expressions out of formatting) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Neste trabalho foram desenvolvidos um sensor eletroquímico modificado com nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNT) e 5-nitroindol (5-NI) para determinação simultânea dos ácidos ascórbico (AA) e úrico (AU), em amostras de urina e soro, e um biossensor à base de dsDNA para determinação do éster etílico da 3-nitro-L-tirosina (3NO2TEE), como biomarcador de peroxinitração biológica. O trímero do 5-nitroindol foi eletrogerado in situ sobre os nanotubos de carbono depositados em eletrodo de carbono vítreo (ECV). Após esse processo, o grupo nitro aromático, presente na molécula foi reduzido gerando o par redox hidroxilamina/nitroso, utilizado para detecção e quantificação dos analitos presentes nas amostras biológicas. Os comportamentos eletroquímicos dos eletrodos modificados foram estudados, empregando as técnicas de voltametria cíclica, voltametria de pulso diferencial e cronoamperometria, as quais foram utilizadas para a detecção dos analitos e para obtenção dos parâmetros cinéticos e caracterização analítica da plataforma. Os estudos cronoamperométricos foram realizados com o objetivo de obter maiores informações dos processos redox entre AA e o sensor, uma vez que este demonstrou ser um processo eletrocatalítico. Assim, por meio de gráficos e equações de Cottrell, foi possível obter os valores para o coeficiente de difusão (DAA) e a constante catalítica (kcat) da reação para o AA. Os valores do DAA e de kcat, determinados para AA, foram de 4,2 x10-6 cm-2 s-1 e 1,1 x 106 M-1 s-1, respectivamente. O método desenvolvido de detecção de AA e AU apresentou boa sensibilidade e estabilidade em amostras de urina e soro, com limite de detecção (LD) de 1,9 mol L-1 para AA e 2,1 mol L-1 para AU. A partir do desempenho analítico obtido da plataforma nanoestruturada ECV/MWCNT/poli-5-NID, justifica-se a sua utilização deste como sensor para a determinação simultânea de AA e AU. Antes da construção do biossensor de DNA, para nitroaromáticos de importância biológica, foi necessária a realização dos estudos da 3NO2TEE, em meios prótico: tampão acetato pH 4,5 e tampão fosfato pH 7,4 e 10,0 e, em meio aprótico (DMF/ TBAPF6, 0,1 mol L-1), utilizando eletrodo de Pt e carbono vítreo, como eletrodos de trabalho. A espectroeletroquímica de 3NO2TEE, realizada em meio aprótico, foi útil para racionalizar o comportamento eletroquímico de 3NO2TEE e de seus intermediários gerados durante a redução. Para a construção do biossensor, sobre o eletrodo de carbono vítreo, foram otimizados: concentração de dsDNA, tempo de condicionamento para a redução do nitrocomposto, valor de pH. O biossensor ECV/dsDNA apresentou faixa linear de 60 - 320 nmol L-1 e LD e LQ (limite de quantificação) encontrados foram 58 nmol L-1 e 200 nmol L-1. Estes resultados indicaram que o sensor e o biossensor foram produzidos e aplicados de forma eficaz para detecção de substâncias de interesse biológico. (obs.: algumas expressões fora da formatação)

Os mecanismos oxidativos pelos quais macrófagos exercem atividade microbicida permanecem em discussão, e estudos com hospedeiros animais serão essenciais para elucidar tal questão. Nesse trabalho, estudamos os mecanismos microbicidas de macrófagos in vivo comparando parâmetros de infecção nas lesões de camundongos resistentes (C57Bl/6) e suscetíveis (BALB/c) ao protozoário Leishmania amazonensis. A comparação mostrou que o controle da infecção pelos camundongos resistentes é dependente da ativação de macrófagos com expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível, síntese de óxido nítrico e extensa nitração e hidroxilação das proteínas dos parasitas dentro dos fagolisossomos dos macrófagos. O principal agente tóxico aos parasitas parece ser derivado do peroxinitrito porque a nitração dos parasitas ocorreu na ausência virtual de células polimorfonucleares e foi acompanhada de hidroxilação. Além disso, tempol um inibidor de reações de nitração mediadas por peroxinitrito, inibiu a nitração de proteínas da lesão e aumentou o número de parasitas nelas presentes. Também, estudos com parasitas em cultura confirmaram que o peroxinitrito é citotóxico aos parasitas enquanto o óxido nítrico é citostático. O camundongo suscetível se mostrou capaz de sintetizar óxido nítrico mas o fez em estágios tardios da infecção e, provavelmente, em resposta a uma infecção secundária por bactérias. Tomados conjuntamente, os resultados indicam que o peroxinitrito e radicais dele derivados são os principais agentes leishmanicidas produzidos por macrófagos in vivo. / Macrophage oxidative microbicidal mechanisms remain debatable and their elucidation is likely to depend on studies with mammalian hosts. To examine macrophage microbicidal mechanisms in vivo, we compared infection parameters in the lesions of resistant (C57Bl/6) and susceptible (BALB/c) mice to the protozoan Leishmania amazonensis. This comparison demonstrated that infection control by resistant mice relied on macrophage activation with inducible nitric oxide synthase expression, nitric oxide synthesis and extensive nitration and hydroxylation of the proteins of the parasites inside macrophage phagolysosomes. The toxic agent to the parasite is likely to be peroxynitrite-derived because parasite nitration occurred in the virtual absence of polymorphonuclear cells and was accompanied by parasite hydroxylation. In addition, tempol, an inhibitor of peroxynitrite-mediated nitrations, inhibited protein nitration of the lesions and increased the number of parasites in them. Also, studies with parasite cultures confmed that peroxynitrite is cytotoxic to the parasites whereas nitric oxide is cytostatic. The susceptible mice were also able to synthesize nitric oxide but only at late infection time and, most likely, in response to a secondary bacterial infection. Taken together, the results indicate that peroxynitrite and derived radicals are the main leishrnanicidal agents produced by macrophages in vivo.

Introdução: Poucos estudos avaliaram marcadores inflamatórios associados à nitração da placa aterosclerótica no prognóstico da doença arterial coronariana (DAC). Assim, o objetivo deste estudo é analisar a influência dos níveis de atividade da mieloperoxidase (MPO) e nitrotirosina (NT) na sobrevida em curto e longo prazo, em uma coorte prospectiva de síndrome coronariana aguda (SCA), Estratégia de Registro de Síndrome Coronariana Aguda (estudo ERICO). Métodos: Avaliou-se a influência da atividade da MPO e dos níveis de NT, ambos dosados até 10 dias após a síndrome coronariana aguda (SCA), em relação à mortalidade em até 4 anos de seguimento. A atividade da MPO e os níveis de NT, coletados durante a fase aguda e subaguda do início dos sintomas da síndrome coronariana aguda (SCA) (infarto do miocárdio (IAM) com supra e sem supra do segmento ST e angina instável), foram avaliados em 342 pacientes. Em 180 dias, 1 ano, 2 anos e 4 anos foram calculadas as taxas de letalidade geral, assim como as curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier e os modelos de regressão logística de Cox com respectivas razões de risco (RR) cumulativas (intervalo de confiança de 95%; IC 95%), de acordo os tercis de atividade da MPO e de NT para mortalidade (geral, cardiovascular e por IAM fatal). As RR cumulativas para atividade da MPO e NT foram calculadas sem ajuste, ajustadas por idade e sexo e com ajuste adicional para tabagismo, diabetes, hipertensão e níveis de colesterol LDL e HDL. Resultados: No geral, o valor mediano para a atividade da MPO foi de 29,6 mU / ml (variação: 1,8 a 282,1 mU / ml) e NT foi de 208,33 nmol / L (variação: 3,09 a 1.500,00 nmol / L), independentemente do subtipo de SCA. Durante o seguimento de 4 anos, observamos 55 (16,1%) óbitos. A taxa de sobrevida global foi de 287 (83,9%) (tempo mediano de sobrevida foi 1.517, IIQ: 1.1391.904 dias). A atividade de MPO e os níveis de NT não se associaram com as taxas de letalidade e nem de sobrevivência (mortalidade geral, cardiovascular e por IAM fatal) pelas RR de 180 dias até 4 anos de seguimento. Conclusões: A atividade da MPO, assim como, os níveis de NT não foram preditores de morte após SCA em curto e longo prazo no estudo ERICO / Introduction: Few studies have evaluated inflammatory markers associated with atherosclerotic plaque nitration in the prognosis of coronary artery disease (CAD). Thus, the objective of this study is to analyze the influence of levels of myeloperoxidase (MPO) activity and nitrotyrosine (NT) on short- and long-term survival in a prospective cohort of acute coronary syndrome (ACS), Coronary Syndrome Registry Strategy Acute (ERICO study). Methods: The influence of MPO activity and NT levels, both dosed up to 10 days after acute coronary syndrome (ACS), was evaluated in relation to mortality up to 4 years of follow-up. The MPO activity and NT levels, collected during the acute and subacute phase of the onset of ACS symptoms (myocardial infarction (MI) with supra and non-ST-segment elevation and unstable angina), were evaluated in 342 patients. Overall, case-fatality rates, as well as, Kaplan-Meier survival curves and Cox logistic regression models with cumulative hazard ratios (HR) were calculated for 180 days, 1 year, 2 years and 4 years (range (95% confidence interval, 95% CI), according to tertiles of MPO and NT activity for mortality (overall, cardiovascular and fatal MI). Cumulative RRs for MPO and NT activity were calculated as crude, age and sex-adjusted, and with additional adjustment for smoking, diabetes, hypertension, and LDL and HDLcholesterol levels. Results: Overall, the median value for MPO activity was 29.6 mU / ml (range: 1.8 to 282.1 mU / ml) and NT of 208.33 nmol / L (range: 3, 09 to 1,500.00 nmol / L), regardless of the subtype of ACS. During the 4-year follow-up, we observed 55 (16.1%) deaths. The overall survival rate was 287 (83.9%) (median survival time was 1,517, IQR: 1,139-1,904 days). MPO activity and NT levels were nor associated with case-fatality neither survival rates (overall, cardiovascular and fatal MI mortality ) by HRs from 180 days to 4 years of follow-up. Conclusions: MPO activity, as well as, NT levels were not predictors of short- and long-term mortality after ACS in the ERICO study

Protein nitration is considered as a marker of reactive nitrogen species formation. Heme oxygenases (HOs) are important for the defence against oxidative stress. We evaluated the involvement of the neuronal (nNOS), the endothelial (eNOS), and the inducible (iNOS) in nitrotyrosine formation and localitzation, and both the expression and funcional significance (HO inhibition and contractility studies) of HOs in sepsis-induced muscle contractile dysfunction. Sepsis was elicited by injecting rats and transgenic mice deficient in either nNOS, eNOS, or iNOS isoforms with E.Coli lipolysaccharide (LPS). Nitrotyrosine formation and HO expressions were assessed by immunoblotting. Oxidative stress was assessed measuring protein oxidation, lipid peroxidation, and muscle glutathione. We conclude that protein tyrosine nitration occurs in normal muscles, and sepsis-mediated increase in nitrotyrosine formation is limited to the mitochondria and membrane muscle fractions. The iNOS isoform is mostly involved in nitrotyrosine formation. HOs protect normal and septic muscles from the deleterious effects of oxidants. / En un model de sepsi de disfunció diafragmàtica, s´ha avaluat el paper de les sintetases de l'òxid nítric (NOS) en la formació i localitzacio de 3-nitrotirosina, i l´expressió i significat biològic de les hemo oxigenases (HOs) (inhibidor de les HOs i estudis de contractilitat) davant l' estrès oxidatiu. La sepsi s'induí mitjançant injecció de 20 mg/kg del lipolisacàrid (LPS) d´Escherichia Coli a rates, i a ratolins deficients en les NOS induïble (iNOS), neuronal (nNOS) i endotelial (eNOS). Les proteïnes nitrificades i les HOs es van detectar amb anticossos específics. L' estrès oxidatiu s' avaluà mitjançant l' oxidació proteica, la peroxidació lipídica i el glutation muscular. Concloem que hi han proteïnes nitrificades en el múscul normal i aquestes s'incrementen durant la sepsi en les fraccions mitocondrial i membranar. L'isoforma iNOS és majorment responsable de la formació de nitrotirosina. Les HOs protegirien el múscul normal i sèptic dels efectes deleteris dels oxidants.