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Diversité du microbiote digestif humain par culturomics et pyroséquençageLagier, Jean-Christophe 15 May 2013 (has links)
Les relations entre le microbiote intestinal et la santé humaine ont été suggérées par les études métagénomiques. Microbial culturomics utilise de nombreuses conditions de culture avec une méthode d'identification rapide par MALDI-TOF, ou par séquençage de l'ARN 16S pour les colonies non identifiées. L'étude pionnière a permis d'identifier 340 bactéries différentes, dont 31 nouvelles espèces bactériennes et 174 espèces bactériennes décrite pour la première de l'intestin humain. Le séquençage du génome de chaque nouvelle espèce a permis de décrire le plus grand génome d'une bactérie isolée chez l'homme (Microvirga massiliensis, 9,3 Mo) et de générer environ 10 000 gènes précédemment inconnus (ORFans) facilitant les futures études métagénomiques. Le pyroséquençage sur les mêmes échantillons a révélé que seulement 51 espèces étaient détectées par les 2 techniques. Culturomics a démontré sa supériorité par rapport au pyroséquençage lors de l'étude d'une selle d'une patiente traitée pour une tuberculose ultra-résistante. Le pyroséquençage de 2 échantillons de selles de patients traités par antibiotiques a révélé 45 à 80% de séquences assignées au phylum des Verrucomicrobia. L'étude par culture de ces mêmes échantillons n'a pas permis d'isoler cette espèce.Grâce à l'étude de 14 échantillons de selles différents par culturomics, nous avons cultivé 520 espèces bactériennes différentes, dont 57 nouvelles espèces bactériennes et 260 espèces décrites pour la première fois à partir du microbiote digestif. Après cette phase de description, les études suivantes pourront tenter d'établir un lien entre les nouvelles espèces bactériennes et le statut clinique des patients étudiés. / Relationships between gut microbiota and human health have been already suggested thanks to metagenomics studies. Microbial culturomics is based on the use of a large number of culture conditions with a rapid identification method by MALDI-TOF or by 16SrRNA amplification and sequencing for the unidentified colonies. The seminal study allowed to identify 340 different bacteria including 31 new bacterial species, 174 bacterial species first described from the human gut. The genome sequencing of each new species allowed to describe the largest genome for a human bacteria (Microvirga massiliensis; 9,3 Mb) and to generate approximately 10,000 previously unknown genes (ORFans) facilitating the future metagenomics studies. In parallel, pyrosequencing performed on the 3 same samples revealed a dramatic low overlapping between the 2 methods with only 51 species detected. In addition, culturomics has demonstrated its superiority than pyrosequencing of a stool from a patient treated for a XDR-tuberculosis. Conversely, the pyrosequencing performed on 2 stool samples of patients treated by antibiotics revealed from 45 to 80% of sequences assigned to Verrucomicrobia although the culturomics study of these same samples did not allowed to culture this species.Currently, thanks to the study of 14 different stool samples by culturomics, we have cultured 520 different bacterial species including 57 new bacterial species and 260 species first described from human gut. After this comprehensive description phase, the following studies will attempt to make a link between new bacterial species and clinical status of the patients studied.
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La génomique : un outil robuste et émergent utilisé dans la taxonomie bactérienne et l'analyse comparative / Genomics a robust emerging tool for bacterial taxonomy and comparative analysisAbou Abdallah, Rita 05 July 2018 (has links)
Le nombre de nouvelles espèces bactériennes identifiées augmente constamment. L'un des facteurs les plus importants de cette situation est l'approche culturomique. Par conséquent, la nécessité de classifier et de décrire taxonomiquement ces microorganismes pour comprendre leur évolution, leurs caractéristiques et leurs relations avec d'autres organismes vivants a émergé. À ce jour, plus de 170000 génomes bactériens sont disponibles. Face à cette situation, la taxonomie bactérienne ne peut être éloignée des informations fournies par le génome entier. La stratégie taxonogénomique a été élaborée dans notre laboratoire pour inclure les séquences du génome dans le schéma taxonomique. Cette nouvelle stratégie consiste en la combinaison de diverses données phénotypiques, et l'analyse génomique et la comparaison, aboutissant à une description rationnelle et complète de nouveaux taxons bactériens. Un deuxième aspect de notre travail de thèse a été l'analyse pangénomique de Coxiella burnetii. Profitant de la disponibilité de 75 génomes de C. burnetii, nous avons montré que ce pangénome est ouvert, ce qui s’oppose à ceux des autres bactéries intracellulaires. Aucun contenu génique spécifique à une maladie, ou à un géovar spécifique n'a pu être identifié. En revanche, l'analyse phylogénétique basée sur le core génome correspondait à celle obtenue à partir du typage. Ainsi, nous démontrons ici que le séquençage du génome peut être bien adapté à la description officielle ainsi que l'analyse pangénomique des bactéries associées à l'homme, et permettre de répondre à de nombreuses questions microbiologiques telles que l'évolution, la résistance aux antibiotiques et la pathogénicité. / The number of new identified bacterial species is constantly increasing. One of the most important contributors to this situation is the microbial culturomics approach. Consequently, the need to classify and taxonomically describe those microorganisms to understand their evolution, characteristics and relationships with other living organisms has emerged. To date, more than 170000 bacterial genomes are available. Facing this situation, bacterial taxonomy cannot be disconnected from the information provided from the whole genome. The taxono-genomics strategy was elaborated in our laboratory to include genome sequences in the taxonomic scheme. This new strategy consists in the combination of various phenotypic data and genomic analysis and comparison, resulting in a rational and comprehensive description of new bacterial taxa. A second aspect of our thesis work was the pangenomic analysis of Coxiella burnetii. Taking advantage of the availability of 75 C. burnetii genomes, we showed that this pangenome is open, which contrasts with those of other intracellular bacteria. No disease-specific, or geovar-specific gene content could be identified. In contrast, the core gene-based phylogenetic analysis matched that obtained from multi-spacer typing. Thus, we herein demonstrate that genome sequencing may, among its many applications, be well suited for the official description as well as pangenome analysis of human-associated bacteria, including pathogens, and may allow addressing many microbiological questions, such as evolution, outbreaks, antibiotic resistance, and pathogenicity.
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Comparative Genomics of Faecalibacterium spp. / Génomique comparative de faecalibacterium spp.Benevides, Leandro 24 May 2018 (has links)
Dans le côlon humain, le genre Faecalibacterium est le membre principal du groupe Clostridium leptum et comprend le deuxième genre représentatif le plus commun dans les échantillons fécaux, après Clostridium coccoides. Il a été reconnu comme une bactérie importante favorisant la santé intestinale et est aujourd'hui considéré comme un probiotique de prochaine génération. Jusqu'à récemment, on croyait qu'il n'y avait qu'une seule espèce dans ce genre, mais depuis 2012, certaines études ont commencé à suggérer l'existence de deux phylogroupes dans le genre. Cette nouvelle proposition de reclassification dans ce genre augmente l'importance de nouvelles études, toutes souches confondues, pour mieux comprendre la diversité, les interactions avec l'hôte et les aspects sécuritaires dans son utilisation comme probiotique. Brièvement, dans ce travail, nous introduisons les analyses de génomique comparative au genre Faecalibacterium en effectuant une étude phylogénétique profonde et en évaluant les aspects de sécurité pour son utilisation comme probiotique. Les analyses phylogénétiques comprenaient non seulement l'utilisation classique du gène de l'ARNr 16S, mais aussi l'utilisation de 17 génomes et techniques complets comme le typage de séquence multi-locus (wgMLST), l'identité nucléotidique moyenne (ANI), le synténie génique et le pangénome. C'est aussi le premier travail à combiner une analyse du développement du pangénome avec l'analyse ANI afin de corroborer l'attribution de souches à de nouvelles espèces. Les analyses phylogénétiques ont confirmé l'existence de plus d'une espèce dans le genre Faecalibacterium. De plus, l'évaluation de la sécurité impliquait (1) la prédiction des régions acquises horizontalement (îlots de résistance aux antibiotiques, îlots métaboliques et régions phagiques), (2) la prédiction des voies métaboliques, (3) la recherche de gènes liés à la résistance aux antibiotiques et des bactériocines. Ces analyses ont identifié des îlots génomiques dans tous les génomes, mais aucun d'entre eux n'est exclusif à une souche ou à une génospécie. En outre, ont été identifiés 8 gènes liés aux mécanismes de résistance aux antibiotiques répartis entre les génomes. 126 voies métaboliques ont été prédites et parmi certaines ont été mises en évidence: la dégradation du bisphénol A, le métabolisme du butanoate et la biosynthèse de la streptomycine. En outre, nous avons étudié le contexte génomique d'une protéine (molécule anti-inflammatoire microbienne - MAM) décrite pour la première fois par notre groupe. Cette recherche montre que la MAM apparaît proche des gènes liés au processus de sporulation et, dans certaines souches, proche d'un transporteur ABC. / Within the human colon, the genus Faecalibacterium is the main member of the Clostridium leptum cluster and comprises the second-most common representative genus in fecal samples, after Clostridium coccoides. It has been recognized as an important bacterium promoting the intestinal health and today is considered as a potential next generation probiotic. Until recently, it was believed that there was only one species in this genus, but since 2012, some studies have begun to suggest the existence of two phylogroups into the genus. This new proposition of reclassification into this genus increases the importance of new studies, with all strains, to better understand the diversity, the interactions with the host and the safety aspects in its use as probiotic. Briefly, in this work we introduce the comparative genomics analyzes to the genus Faecalibacterium performing a deep phylogenetic study and evaluating the safety aspects for its use as a probiotic. The phylogenetic analyzes included not only the classical use of 16S rRNA gene, but also the utilization of 17 complete genomes and techniques like whole genome Multi-Locus Sequence Typing (wgMLST), Average Nucleotide Identity (ANI), gene synteny, and pangenome. Also, this is the first work to combine an analysis of pangenome development with ANI analysis in order to corroborate the assignment of strains to new species. The phylogenetic analyzes confirmed the existence of more than one species into the genus Faecalibacterium. Moreover, the safety assessment involved the (1) prediction of horizontally acquired regions (Antibiotic resistance islands, Metabolic islands and phage regions), (2) prediction of metabolic pathways, (3) search of genes related to antibiotic resistance and (4) search of bacteriocins. These analyzes identified genomic islands in all genomes, but none of than are exclusive to one strain or genospecies. Also, were identified 8 genes related to antibiotic resistance mechanisms distributed among the genomes. 126 metabolic pathways were predicted and among than some were highlighted: Bisphenol A degradation, Butanoate metabolism and Streptomycin biosynthesis. In addition, we studied the genomic context of one protein (Microbial Anti-inflammatory Molecule - MAM) first described by our group. This investigation shows that MAM appears close to genes related to sporulation process and, in some strains, close to an ABC-transporter.
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Applicabilité de la PCR "universelle" 16S comme outil d'identification et de détection bactérienne en laboratoire hospitalier de bactériologieRenvoisé, Aurélie 02 July 2012 (has links)
La PCR universelle ciblant le gène codant pour l'ARNr 16S à l'aide d'amorces universelles, a d'abord été développée pour des études phylogénétiques. En effet ce gène est universellement retrouvé chez les bactéries et sa fonction est conservée. Ainsi, il peut servir d'« horloge moléculaire » pour mesurer les distances phylogénétiques entre les différentes espèces bactériennes. La PCR universelle a ensuite été appliquée en microbiologie clinique dans deux domaines distincts : la détection et l'identification bactériennes. Dans ce travail, nous avons évalué l'applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil diagnostique dans un centre hospitalier universitaire (hôpital la Timone, Marseille, France). Tout d'abord, nous avons décrit comment la PCR universelle permet l'identification de souches bactériennes mal identifiées par les techniques phénotypiques conventionnelles. Puis, nous avons montré que la PCR universelle peut être utilisée pour détecter l'ADN bactérien dans des prélèvements à culture négative, soit parce que le patient a reçu une antibiothérapie préalable, soit parce que le microorganisme responsable est de croissance difficile. Enfin, nous avons montré que la PCR 16S utilisée pour l'identification permet de mettre en évidence des souches susceptibles de représenter de nouvelles espèces et/ou de nouveaux genres bactériens. Ainsi, la PCR universelle est applicable dans un laboratoire de bactériologie de routine dans les trois objectifs ci-dessus. Elle permet une identification précise des souches bactériennes et l'amélioration du diagnostic des infections associées à des cultures négatives et, par là-même, l'amélioration de la prise en charge des patients. / Broad-range 16S rDNA PCR using universal primers was first developed for phylogenetic purpose since 16S rRNA gene is found in every bacterial species with a conserved function; consequently 16S rRNA gene can be used as a molecular clock for assessing bacterial phylogeny. Broad-range PCR was then applied to medical microbiological diagnosis in two distinct fields: molecular detection and bacteria identification. In the present work, we evaluated the applicability of broad-range PCR as a diagnostic tool in a teaching hospital (Timone Hospital, Marseilles, France). First, we showed that broad-range PCR allows identification of bacteria obtained in culture but misidentified by conventional phenotypic methods. Second, we showed that universal PCR permits bacterial detection in culture-negative infection. Third, we exemplified that using broad-range PCR is a valuable tool to identify new bacterial species and/or genera. Consequently, universal PCR is applicable in routine laboratories in the three above fields; it allows a more accurate identification of bacterial strains and permits to diagnose culture-negative bacterial infections, thus improving patient's management. It also improves our knowledge of infectious diseases together with bacterial diversity and phylogeny. Although universal PCR presents certain limitations (discussed in this work), it remains today the gold-standard for molecular identification and detection in routine laboratories.
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