Os nucleotídeos da adenina (ATP, ADP e AMP) e o nucleosídeo adenosina são importantes moléculas sinalizadoras que estão envolvidas nos mecanismos de crescimento e diferenciação celular, angiogênese, fluxo sanguíneo, condução e taxa cardíaca, e sensibilidade à estimulação adrenérgica no coração. Paralelamente a esses efeitos extracelulares, algumas evidências com fibras musculares permeabilizadas e vesículas de retículo sarcoplasmático cardíaco (chamados de microssomas) têm sugerido que estas purinas poderiam modular correntes de Ca²+ do retículo sarcoplasmático, ativando diretamente o canal iônico. Mudanças nos níveis de ATP, ADP, AMP e adenosina alteram suas ações, o que tem sido implicado em diversos processos patofisiológicos do coração. Consequentemente, as enzimas que metabolizam nucleotídeos, denominadas ectonucleotidases, que fazem parte da sinalização purinérgica, desempenham um componente modulatório essencial, pois controlam a quantidade e a taxa de degradação dos nucleotídeos além da formação do respectivo nucleosídeo. No presente estudo, foi analisada a presença dos membros das famílias das E-NTPDases, E-NPPs e ecto-5'-nucleotidase em frações solúvel e microssomal cardíacas de ratos. No estudo das E-NTPDases, a caracterização bioquímica das atividades de hidrólise de ATP e ADP em condições de inibição da atividade da ATPase mitocondrial e da adenilato cinase, revelou enzimas dependentes de cátions divalentes que apresentam pH ótimo de 8,0 na fração solúvel e 7,5 na fração microssomal. Os valores de KM aparente calculados a partir do plot de Eadie-Hofstee na fração solúvel foram 131,2 e 57,1 µM e de Vmax 71,3 e 9,3 nmol Pi/ min /mg de proteína para a hidrólise de ATP e ADP, respectivamente. Na fração microsomal, os valores de KM calculados para ATP e ADP foram 315,2 e 131 µM, e os valores de Vmax foram 1180,6 and 100,4 nmol Pi/ min/ mg de proteína, respectivamente. Considerando a atividade da ecto-5'-nucleotidase, utilizando AMP como substrato, os resultados mostraram que o cation e a concentração requerida para a atividade máxima nas duas frações, foi magnésio na concentração final de 1 mM. O pH ótimo para ambas frações foi 9,5. Os valores de KM foram 59,7 µM e 134,8 µM com um valor de Vmax calculado de 6,7 e 143,8 nmol Pi/ min/ mg de proteína para fração solúvel e microsomal, respectivamente. A análise de Western blotting para a ecto-5'-nucleotidase revelou uma proteína de 70kDa nas duas frações e uma maior densidade na fração microssomal. Usando p-nitrofenil-5'-timidina monofosfato (p-Nph-5'-TMP) como substrato para as E-NPPs, nós observamos um pH ótimo alcalino e dependência para cations divalentes. Os valores de KM corresponderam a 118,5 e 91,9 µM e os valores do Vmax calculado foram 2,5 e 113,8 nmol p-nitrofenol/ min/ mg de proteína para a fração solúvel e microsomal, respectivamente. A presença dessas enzimas no coração tem, provavelmente, uma função fisiológica na geração de adenosina. Além disso, na fração microsomal, essas enzimas poderiam exercer um papel na modulação do processo de excitação-contração do coração através do envolvimento com o influxo de Ca²+ para o retículo sarcoplasmático. Com o intuito de investigar os possíveis efeitos da cafeína sobre a atividade das ectonucleotidases na fração solúvel e microssomal cardíaca, nós utilizamos a administração aguda e crônica de cafeína. Para o estudo agudo, nós administramos a cafeína por oral gavage em uma única dose de 5, 15 ou 45 mg/Kg. Os controles receberam salina e todos os animais foram mortos 1,5h após a gavage. No tratamento crônico, a cafeína (0,3 or 1,0 mg/mL) foi oralmente administrada por 14 dias na água e os animais foram mortos no 15º dia. Os resultados preliminares mostram que tanto o tratamento agudo quanto o crônico foram capazes de alterar diferentemente a hidrólise dos nucleotídeos em ambas frações. Todavia, mais dados são necessários para tentar relacionar os resultados encontrados e os conhecidos efeitos da cafeína no coração. / Adenine nucleotides (ATP, ADP, and AMP) and the nucleoside adenosine are important signaling molecules that are very much involved in the mechanisms of cell growth and differentiation, angiogenesis, coronary blood flow, cardiac conduction and heart rate, and sensitivity to adrenergic stimulation in the heart. Besides these extracellular effects, some evidences with permeabilized muscle fibers and cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles (called microsomes) have suggested that these purines could modulate Ca²+ currents of the sarcoplasmic reticulum activating directly the ionic channel. Changes in the adenine nucleotides and adenosine levels alter their actions and have been implicated in diverse patho-physiological processes of the heart. Consequently, nucleotide-metabolizing enzymes (ectonucleotidases) play an essential modulatory component of the purine signaling once that controls the rate, amount and timing of nucleotide degradation and ultimately, the nucleoside formation. In the present study, we have analyzed the presence of the E-NTPDase family members, E-NPPs and ecto-5'-nucleotidase in rat cardiac soluble and microsomal fractions. In the E-NTPDase study, biochemical characterization of ATPase and ADPase activities, under conditions where mitochondrial ATPase and adenylate kinase activities were blocked, demonstrates divalent-cation dependent enzymes that presented optimum pH of 8.0 to soluble, and 7.5 to microsomal fraction. The apparent KM values calculated from the Eadie-Hofstee plot for ATP and ADP in soluble fraction were 131.2 and 57.1 µM, respectively. Vmax values calculated were 71.3 and 9.3 nmol Pi/ min/ mg of protein for ATP and ADP hydrolysis, respectively. In microsomal fraction, the KM values calculated for ATP and ADP were 315.2 and 131 µM, respectively. Vmax values in this fraction were 1180.6 and 100.4 nmol Pi/ min/ mg of protein when using ATP and ADP as substrates, respectively. Considering ecto-5’-nucleotidase activity with AMP as substrate, the results showed that the cation and the concentration required for maximal activity in the two fractions was magnesium in the final concentration of 1.0 mM. The pH optimum for both fractions was 9.5. The apparent KM calculated were 59.7 µM and 134.8 µM with a Vmax values calculated of 6.7 and 143.8 nmol Pi/ min/ mg of protein from soluble and microsomal fractions, respectively. Western blotting analysis to ecto-5'-nucleotidase revealed a 70kDa protein in both fractions and a major density in the microsomal fraction. Using p-nitrophenyl-5'-thymidine monophosphate (p-Nph-5'-TMP) as substrate for E-NPPs, we observed an alkaline optimum pH and divalent cation dependence. he KM value corresponded to 118.5 and 91.9 µM and Vmax value calculated were 2.5 and 113.8 nmol p-nitrophenol/ min/ mg of protein from soluble and microsomal fractions, respectively The presence of these enzymes in the heart probably has a physiological function in the generation of signaling adenosine. Furthermore, in the microsomal fraction, they could have a role in the modulation of the excitation-contraction coupling process throughout the involvement with the Ca²+ influx to sarcoplasmic reticulum. To investigate the possible effects of caffeine on ectonucleotidase activity in cardiac soluble and microsomal fractions of rats, we used acute and chronic caffeine administration. For the acute study, we administrate to the rats by gavage, a single oral dose of 5, 15 or 45 mg/Kg b.w. of caffeine. Controls received saline and all animals were euthanized 1.5h after gavage. In the chronic treatment, caffeine (0.3 or 1.0 mg/mL) was orally administered for 14 days in the drinking water and the animals were euthanized on the day 15. Preliminary results showed that acute and chronic caffeine treatment were capable of differently alter nucleotide hydrolysis in both fractions. However, more data are necessary to correlate the results founded and the known cardiac effects of caffeine.

Os nucleotídeos da adenina (ATP, ADP e AMP) e o nucleosídeo adenosina são importantes moléculas sinalizadoras que estão envolvidas nos mecanismos de crescimento e diferenciação celular, angiogênese, fluxo sanguíneo, condução e taxa cardíaca, e sensibilidade à estimulação adrenérgica no coração. Paralelamente a esses efeitos extracelulares, algumas evidências com fibras musculares permeabilizadas e vesículas de retículo sarcoplasmático cardíaco (chamados de microssomas) têm sugerido que estas purinas poderiam modular correntes de Ca²+ do retículo sarcoplasmático, ativando diretamente o canal iônico. Mudanças nos níveis de ATP, ADP, AMP e adenosina alteram suas ações, o que tem sido implicado em diversos processos patofisiológicos do coração. Consequentemente, as enzimas que metabolizam nucleotídeos, denominadas ectonucleotidases, que fazem parte da sinalização purinérgica, desempenham um componente modulatório essencial, pois controlam a quantidade e a taxa de degradação dos nucleotídeos além da formação do respectivo nucleosídeo. No presente estudo, foi analisada a presença dos membros das famílias das E-NTPDases, E-NPPs e ecto-5'-nucleotidase em frações solúvel e microssomal cardíacas de ratos. No estudo das E-NTPDases, a caracterização bioquímica das atividades de hidrólise de ATP e ADP em condições de inibição da atividade da ATPase mitocondrial e da adenilato cinase, revelou enzimas dependentes de cátions divalentes que apresentam pH ótimo de 8,0 na fração solúvel e 7,5 na fração microssomal. Os valores de KM aparente calculados a partir do plot de Eadie-Hofstee na fração solúvel foram 131,2 e 57,1 µM e de Vmax 71,3 e 9,3 nmol Pi/ min /mg de proteína para a hidrólise de ATP e ADP, respectivamente. Na fração microsomal, os valores de KM calculados para ATP e ADP foram 315,2 e 131 µM, e os valores de Vmax foram 1180,6 and 100,4 nmol Pi/ min/ mg de proteína, respectivamente. Considerando a atividade da ecto-5'-nucleotidase, utilizando AMP como substrato, os resultados mostraram que o cation e a concentração requerida para a atividade máxima nas duas frações, foi magnésio na concentração final de 1 mM. O pH ótimo para ambas frações foi 9,5. Os valores de KM foram 59,7 µM e 134,8 µM com um valor de Vmax calculado de 6,7 e 143,8 nmol Pi/ min/ mg de proteína para fração solúvel e microsomal, respectivamente. A análise de Western blotting para a ecto-5'-nucleotidase revelou uma proteína de 70kDa nas duas frações e uma maior densidade na fração microssomal. Usando p-nitrofenil-5'-timidina monofosfato (p-Nph-5'-TMP) como substrato para as E-NPPs, nós observamos um pH ótimo alcalino e dependência para cations divalentes. Os valores de KM corresponderam a 118,5 e 91,9 µM e os valores do Vmax calculado foram 2,5 e 113,8 nmol p-nitrofenol/ min/ mg de proteína para a fração solúvel e microsomal, respectivamente. A presença dessas enzimas no coração tem, provavelmente, uma função fisiológica na geração de adenosina. Além disso, na fração microsomal, essas enzimas poderiam exercer um papel na modulação do processo de excitação-contração do coração através do envolvimento com o influxo de Ca²+ para o retículo sarcoplasmático. Com o intuito de investigar os possíveis efeitos da cafeína sobre a atividade das ectonucleotidases na fração solúvel e microssomal cardíaca, nós utilizamos a administração aguda e crônica de cafeína. Para o estudo agudo, nós administramos a cafeína por oral gavage em uma única dose de 5, 15 ou 45 mg/Kg. Os controles receberam salina e todos os animais foram mortos 1,5h após a gavage. No tratamento crônico, a cafeína (0,3 or 1,0 mg/mL) foi oralmente administrada por 14 dias na água e os animais foram mortos no 15º dia. Os resultados preliminares mostram que tanto o tratamento agudo quanto o crônico foram capazes de alterar diferentemente a hidrólise dos nucleotídeos em ambas frações. Todavia, mais dados são necessários para tentar relacionar os resultados encontrados e os conhecidos efeitos da cafeína no coração. / Adenine nucleotides (ATP, ADP, and AMP) and the nucleoside adenosine are important signaling molecules that are very much involved in the mechanisms of cell growth and differentiation, angiogenesis, coronary blood flow, cardiac conduction and heart rate, and sensitivity to adrenergic stimulation in the heart. Besides these extracellular effects, some evidences with permeabilized muscle fibers and cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles (called microsomes) have suggested that these purines could modulate Ca²+ currents of the sarcoplasmic reticulum activating directly the ionic channel. Changes in the adenine nucleotides and adenosine levels alter their actions and have been implicated in diverse patho-physiological processes of the heart. Consequently, nucleotide-metabolizing enzymes (ectonucleotidases) play an essential modulatory component of the purine signaling once that controls the rate, amount and timing of nucleotide degradation and ultimately, the nucleoside formation. In the present study, we have analyzed the presence of the E-NTPDase family members, E-NPPs and ecto-5'-nucleotidase in rat cardiac soluble and microsomal fractions. In the E-NTPDase study, biochemical characterization of ATPase and ADPase activities, under conditions where mitochondrial ATPase and adenylate kinase activities were blocked, demonstrates divalent-cation dependent enzymes that presented optimum pH of 8.0 to soluble, and 7.5 to microsomal fraction. The apparent KM values calculated from the Eadie-Hofstee plot for ATP and ADP in soluble fraction were 131.2 and 57.1 µM, respectively. Vmax values calculated were 71.3 and 9.3 nmol Pi/ min/ mg of protein for ATP and ADP hydrolysis, respectively. In microsomal fraction, the KM values calculated for ATP and ADP were 315.2 and 131 µM, respectively. Vmax values in this fraction were 1180.6 and 100.4 nmol Pi/ min/ mg of protein when using ATP and ADP as substrates, respectively. Considering ecto-5’-nucleotidase activity with AMP as substrate, the results showed that the cation and the concentration required for maximal activity in the two fractions was magnesium in the final concentration of 1.0 mM. The pH optimum for both fractions was 9.5. The apparent KM calculated were 59.7 µM and 134.8 µM with a Vmax values calculated of 6.7 and 143.8 nmol Pi/ min/ mg of protein from soluble and microsomal fractions, respectively. Western blotting analysis to ecto-5'-nucleotidase revealed a 70kDa protein in both fractions and a major density in the microsomal fraction. Using p-nitrophenyl-5'-thymidine monophosphate (p-Nph-5'-TMP) as substrate for E-NPPs, we observed an alkaline optimum pH and divalent cation dependence. he KM value corresponded to 118.5 and 91.9 µM and Vmax value calculated were 2.5 and 113.8 nmol p-nitrophenol/ min/ mg of protein from soluble and microsomal fractions, respectively The presence of these enzymes in the heart probably has a physiological function in the generation of signaling adenosine. Furthermore, in the microsomal fraction, they could have a role in the modulation of the excitation-contraction coupling process throughout the involvement with the Ca²+ influx to sarcoplasmic reticulum. To investigate the possible effects of caffeine on ectonucleotidase activity in cardiac soluble and microsomal fractions of rats, we used acute and chronic caffeine administration. For the acute study, we administrate to the rats by gavage, a single oral dose of 5, 15 or 45 mg/Kg b.w. of caffeine. Controls received saline and all animals were euthanized 1.5h after gavage. In the chronic treatment, caffeine (0.3 or 1.0 mg/mL) was orally administered for 14 days in the drinking water and the animals were euthanized on the day 15. Preliminary results showed that acute and chronic caffeine treatment were capable of differently alter nucleotide hydrolysis in both fractions. However, more data are necessary to correlate the results founded and the known cardiac effects of caffeine.

Os nucleotídeos da adenina (ATP, ADP e AMP) e o nucleosídeo adenosina são importantes moléculas sinalizadoras que estão envolvidas nos mecanismos de crescimento e diferenciação celular, angiogênese, fluxo sanguíneo, condução e taxa cardíaca, e sensibilidade à estimulação adrenérgica no coração. Paralelamente a esses efeitos extracelulares, algumas evidências com fibras musculares permeabilizadas e vesículas de retículo sarcoplasmático cardíaco (chamados de microssomas) têm sugerido que estas purinas poderiam modular correntes de Ca²+ do retículo sarcoplasmático, ativando diretamente o canal iônico. Mudanças nos níveis de ATP, ADP, AMP e adenosina alteram suas ações, o que tem sido implicado em diversos processos patofisiológicos do coração. Consequentemente, as enzimas que metabolizam nucleotídeos, denominadas ectonucleotidases, que fazem parte da sinalização purinérgica, desempenham um componente modulatório essencial, pois controlam a quantidade e a taxa de degradação dos nucleotídeos além da formação do respectivo nucleosídeo. No presente estudo, foi analisada a presença dos membros das famílias das E-NTPDases, E-NPPs e ecto-5'-nucleotidase em frações solúvel e microssomal cardíacas de ratos. No estudo das E-NTPDases, a caracterização bioquímica das atividades de hidrólise de ATP e ADP em condições de inibição da atividade da ATPase mitocondrial e da adenilato cinase, revelou enzimas dependentes de cátions divalentes que apresentam pH ótimo de 8,0 na fração solúvel e 7,5 na fração microssomal. Os valores de KM aparente calculados a partir do plot de Eadie-Hofstee na fração solúvel foram 131,2 e 57,1 µM e de Vmax 71,3 e 9,3 nmol Pi/ min /mg de proteína para a hidrólise de ATP e ADP, respectivamente. Na fração microsomal, os valores de KM calculados para ATP e ADP foram 315,2 e 131 µM, e os valores de Vmax foram 1180,6 and 100,4 nmol Pi/ min/ mg de proteína, respectivamente. Considerando a atividade da ecto-5'-nucleotidase, utilizando AMP como substrato, os resultados mostraram que o cation e a concentração requerida para a atividade máxima nas duas frações, foi magnésio na concentração final de 1 mM. O pH ótimo para ambas frações foi 9,5. Os valores de KM foram 59,7 µM e 134,8 µM com um valor de Vmax calculado de 6,7 e 143,8 nmol Pi/ min/ mg de proteína para fração solúvel e microsomal, respectivamente. A análise de Western blotting para a ecto-5'-nucleotidase revelou uma proteína de 70kDa nas duas frações e uma maior densidade na fração microssomal. Usando p-nitrofenil-5'-timidina monofosfato (p-Nph-5'-TMP) como substrato para as E-NPPs, nós observamos um pH ótimo alcalino e dependência para cations divalentes. Os valores de KM corresponderam a 118,5 e 91,9 µM e os valores do Vmax calculado foram 2,5 e 113,8 nmol p-nitrofenol/ min/ mg de proteína para a fração solúvel e microsomal, respectivamente. A presença dessas enzimas no coração tem, provavelmente, uma função fisiológica na geração de adenosina. Além disso, na fração microsomal, essas enzimas poderiam exercer um papel na modulação do processo de excitação-contração do coração através do envolvimento com o influxo de Ca²+ para o retículo sarcoplasmático. Com o intuito de investigar os possíveis efeitos da cafeína sobre a atividade das ectonucleotidases na fração solúvel e microssomal cardíaca, nós utilizamos a administração aguda e crônica de cafeína. Para o estudo agudo, nós administramos a cafeína por oral gavage em uma única dose de 5, 15 ou 45 mg/Kg. Os controles receberam salina e todos os animais foram mortos 1,5h após a gavage. No tratamento crônico, a cafeína (0,3 or 1,0 mg/mL) foi oralmente administrada por 14 dias na água e os animais foram mortos no 15º dia. Os resultados preliminares mostram que tanto o tratamento agudo quanto o crônico foram capazes de alterar diferentemente a hidrólise dos nucleotídeos em ambas frações. Todavia, mais dados são necessários para tentar relacionar os resultados encontrados e os conhecidos efeitos da cafeína no coração. / Adenine nucleotides (ATP, ADP, and AMP) and the nucleoside adenosine are important signaling molecules that are very much involved in the mechanisms of cell growth and differentiation, angiogenesis, coronary blood flow, cardiac conduction and heart rate, and sensitivity to adrenergic stimulation in the heart. Besides these extracellular effects, some evidences with permeabilized muscle fibers and cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles (called microsomes) have suggested that these purines could modulate Ca²+ currents of the sarcoplasmic reticulum activating directly the ionic channel. Changes in the adenine nucleotides and adenosine levels alter their actions and have been implicated in diverse patho-physiological processes of the heart. Consequently, nucleotide-metabolizing enzymes (ectonucleotidases) play an essential modulatory component of the purine signaling once that controls the rate, amount and timing of nucleotide degradation and ultimately, the nucleoside formation. In the present study, we have analyzed the presence of the E-NTPDase family members, E-NPPs and ecto-5'-nucleotidase in rat cardiac soluble and microsomal fractions. In the E-NTPDase study, biochemical characterization of ATPase and ADPase activities, under conditions where mitochondrial ATPase and adenylate kinase activities were blocked, demonstrates divalent-cation dependent enzymes that presented optimum pH of 8.0 to soluble, and 7.5 to microsomal fraction. The apparent KM values calculated from the Eadie-Hofstee plot for ATP and ADP in soluble fraction were 131.2 and 57.1 µM, respectively. Vmax values calculated were 71.3 and 9.3 nmol Pi/ min/ mg of protein for ATP and ADP hydrolysis, respectively. In microsomal fraction, the KM values calculated for ATP and ADP were 315.2 and 131 µM, respectively. Vmax values in this fraction were 1180.6 and 100.4 nmol Pi/ min/ mg of protein when using ATP and ADP as substrates, respectively. Considering ecto-5’-nucleotidase activity with AMP as substrate, the results showed that the cation and the concentration required for maximal activity in the two fractions was magnesium in the final concentration of 1.0 mM. The pH optimum for both fractions was 9.5. The apparent KM calculated were 59.7 µM and 134.8 µM with a Vmax values calculated of 6.7 and 143.8 nmol Pi/ min/ mg of protein from soluble and microsomal fractions, respectively. Western blotting analysis to ecto-5'-nucleotidase revealed a 70kDa protein in both fractions and a major density in the microsomal fraction. Using p-nitrophenyl-5'-thymidine monophosphate (p-Nph-5'-TMP) as substrate for E-NPPs, we observed an alkaline optimum pH and divalent cation dependence. he KM value corresponded to 118.5 and 91.9 µM and Vmax value calculated were 2.5 and 113.8 nmol p-nitrophenol/ min/ mg of protein from soluble and microsomal fractions, respectively The presence of these enzymes in the heart probably has a physiological function in the generation of signaling adenosine. Furthermore, in the microsomal fraction, they could have a role in the modulation of the excitation-contraction coupling process throughout the involvement with the Ca²+ influx to sarcoplasmic reticulum. To investigate the possible effects of caffeine on ectonucleotidase activity in cardiac soluble and microsomal fractions of rats, we used acute and chronic caffeine administration. For the acute study, we administrate to the rats by gavage, a single oral dose of 5, 15 or 45 mg/Kg b.w. of caffeine. Controls received saline and all animals were euthanized 1.5h after gavage. In the chronic treatment, caffeine (0.3 or 1.0 mg/mL) was orally administered for 14 days in the drinking water and the animals were euthanized on the day 15. Preliminary results showed that acute and chronic caffeine treatment were capable of differently alter nucleotide hydrolysis in both fractions. However, more data are necessary to correlate the results founded and the known cardiac effects of caffeine.

As células estreladas hepáticas (HSCs) são a principal fonte de componentes de matriz extracelular em doenças crônicas do fígado e, por esta razão, exercem um papel fundamental no desenvolvimento e na manutenção da fibrose hepática. Os nucleotídeos e nucleosídeos são moléculas sinalizadoras que regulam diversos processos no fígado e têm um importante papel na patogênese da fibrose hepática. As ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases), ecto-nucleotídeo pirofosfatase fosfodiesterases (E-NPPs), ecto-5’-nucleotidase (eNT/CD73) e a fosfatase alcalina tecido inespecífica (TNALP) são enzimas localizadas na superfície celular que regulam a concentração dos nucleotídeos no meio extracelular e, desse modo, modulam os efeitos biológicos mediados por eles via ativação dos receptores P1 e P2. Assim, neste estudo nós comparamos o metabolismo extracelular de nucleotídeos e o nível transcricional das ectoenzimas em HSCs quiescentes e ativadas usando uma linhagem de células estreladas hepáticas murina GRX. Estas células expressam o fenótipo miofibroblástico em meio basal e o tratamento com retinol ou indometacina induz a mudança das células GRX para o fenótipo quiescente das HSCs. Os dois fenótipos das células GRX expressam as NTPDase3 e 5, NPP1, 2 e 3, ecto-5’- nucleotidase e TNALP. Entretanto, apenas as HSCs ativadas expressam a NTPDase6. Nas HSCs quiescentes, a hidrólise de nucleosídeos trifosfatados foi significativamente mais alta e foi correlacionada com o aumento na expressão do mRNA da Entpd3 e ENPP3. Os nucleosídeos difosfatados foram hidrolisados de maneira similar pelos dois fenótipos das células GRX e esta atividade foi associada com o aumento da expressão do mRNA da Entpd5 nas células quiescentes e com a expressão da Entpd6 apenas nas HSCs ativadas. A atividade AMPásica foi maior nas células quiescentes do que nas células ativadas e foi relacionada com o aumento da atividade e da expressão do mRNA da ecto-5’-nucleotidase. O tratamento com retinol também envolve a ativação transcricional da TNALP. Para analisar o papel fisiológico da eNT/CD73 nas HSCs, o mRNA e a expressão desta proteína foram reduzidos nas células GRX utilizando a técnica de RNAi. O knockdown da eNT/CD73 aumentou a expressão do mRNA da TNALP e do colágeno I e alterou a adesão e a migração celular através de um mecanismo independente da hidrólise de nucleotídeos. Nós também avaliamos o efeito da adenosina na regulação de marcadores de ativação das HSCs. Este nucleosídeo diminuiu a proliferação, a migração, a transcrição de colágeno I e das metaloproteinases 2 e 9 e diminuiu a transcrição da eNT/CD73. As diferenças na atividade e expressão das ectonucleotidases entre os dois fenótipos das células GRX sugerem que estas enzimas modulam a concentração de nucleotídeos/nucleosídeos e geram efeitos distintos na sinalização purinérgica nos dois fenótipos e podem ser importantes alvos na regulação das funções das HSCs. / Hepatic stellate cells (HSC) are recognized as a primary cellular source of matrix components in chronic liver disease and, therefore, play a critical role in the development and maintenance of liver fibrosis. Nucleotides and nucleosides are signaling molecules that regulate a variety of activities within the liver and play a role in the pathogenesis of hepatic fibrosis. Ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases), ecto-nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterases (E-NPPs), ecto- 5’-nucleotidase (eNT/CD73) and tissue non-specific alkaline phosphatase (TNALP) are enzymes that are located at the cell surface and regulate the concentration of extracellular nucleotides, thereby modulating their biological effects by the activation of P1 and P2 receptors. Thus, in the study we compared the extracellular metabolism of nucleotides and transcriptional levels of ectoenzymes in activated and quiescent HSC of the mouse hepatic stellate cell line GRX. This cell line expresses a myofibroblast phenotype in basal medium and both retinol and indomethacin treatment induced a phenotypic change of GRX cells to quiescent HSC. Two phenotypes of GRX cells expressed NTPDase3 and 5, NPP1, 2 and 3, ecto-5’-nucleotidase/CD73 and TNALP. However, only activated HSC expressed NTPDase6. In quiescent HSC, the hydrolysis of triphosphonucleosides was significantly higher and was related to an increase in Entpd3 and ENPP3 mRNA expression. The diphosphonucleosides were hydrolyzed at a similar rate by two phenotypes of GRX cells and this hydrolysis was associated with an up-regulation of Entpd5 mRNA expression in quiescent-like HSC, whilst Entpd6 mRNA expression was observed only in activated HSC. The AMPase activity in quiescent HSC was higher than myofibroblasts and was related to an increase in ecto-5’-nucleotidase activity and its mRNA expression. The treatment with retinol also involves transcriptional activation of TNALP. To analyze the biological significance of eNT/CD73 in HSC, the expression of eNT/CD73 mRNA and protein was reduced in GRX cell line using the technique of RNAi. ENTCD73 knockdown leads to an increase in mRNA expression of TNALP and collagen I, and a clear alteration of cell adhesion and migration by a mechanism not dependent of changes in nucleotide metabolism. We also tested the effect of adenosine on the regulation of activation markers of in HSCs. This nucleotide decreased proliferation, migration, transcription of collagen I and matrix metalloproteinases 2 e 9 and increased transcription of eNT/CD73. The differential ectonucleotidases activities and expressions in two phenotypes of GRX cells suggest that these enzymes modulate the concentration of nucleotides/nucleosides and affect purinergic signaling differently in the two phenotypes and may play a role in the regulation of HSC functions.

As células estreladas hepáticas (HSCs) são a principal fonte de componentes de matriz extracelular em doenças crônicas do fígado e, por esta razão, exercem um papel fundamental no desenvolvimento e na manutenção da fibrose hepática. Os nucleotídeos e nucleosídeos são moléculas sinalizadoras que regulam diversos processos no fígado e têm um importante papel na patogênese da fibrose hepática. As ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases), ecto-nucleotídeo pirofosfatase fosfodiesterases (E-NPPs), ecto-5’-nucleotidase (eNT/CD73) e a fosfatase alcalina tecido inespecífica (TNALP) são enzimas localizadas na superfície celular que regulam a concentração dos nucleotídeos no meio extracelular e, desse modo, modulam os efeitos biológicos mediados por eles via ativação dos receptores P1 e P2. Assim, neste estudo nós comparamos o metabolismo extracelular de nucleotídeos e o nível transcricional das ectoenzimas em HSCs quiescentes e ativadas usando uma linhagem de células estreladas hepáticas murina GRX. Estas células expressam o fenótipo miofibroblástico em meio basal e o tratamento com retinol ou indometacina induz a mudança das células GRX para o fenótipo quiescente das HSCs. Os dois fenótipos das células GRX expressam as NTPDase3 e 5, NPP1, 2 e 3, ecto-5’- nucleotidase e TNALP. Entretanto, apenas as HSCs ativadas expressam a NTPDase6. Nas HSCs quiescentes, a hidrólise de nucleosídeos trifosfatados foi significativamente mais alta e foi correlacionada com o aumento na expressão do mRNA da Entpd3 e ENPP3. Os nucleosídeos difosfatados foram hidrolisados de maneira similar pelos dois fenótipos das células GRX e esta atividade foi associada com o aumento da expressão do mRNA da Entpd5 nas células quiescentes e com a expressão da Entpd6 apenas nas HSCs ativadas. A atividade AMPásica foi maior nas células quiescentes do que nas células ativadas e foi relacionada com o aumento da atividade e da expressão do mRNA da ecto-5’-nucleotidase. O tratamento com retinol também envolve a ativação transcricional da TNALP. Para analisar o papel fisiológico da eNT/CD73 nas HSCs, o mRNA e a expressão desta proteína foram reduzidos nas células GRX utilizando a técnica de RNAi. O knockdown da eNT/CD73 aumentou a expressão do mRNA da TNALP e do colágeno I e alterou a adesão e a migração celular através de um mecanismo independente da hidrólise de nucleotídeos. Nós também avaliamos o efeito da adenosina na regulação de marcadores de ativação das HSCs. Este nucleosídeo diminuiu a proliferação, a migração, a transcrição de colágeno I e das metaloproteinases 2 e 9 e diminuiu a transcrição da eNT/CD73. As diferenças na atividade e expressão das ectonucleotidases entre os dois fenótipos das células GRX sugerem que estas enzimas modulam a concentração de nucleotídeos/nucleosídeos e geram efeitos distintos na sinalização purinérgica nos dois fenótipos e podem ser importantes alvos na regulação das funções das HSCs. / Hepatic stellate cells (HSC) are recognized as a primary cellular source of matrix components in chronic liver disease and, therefore, play a critical role in the development and maintenance of liver fibrosis. Nucleotides and nucleosides are signaling molecules that regulate a variety of activities within the liver and play a role in the pathogenesis of hepatic fibrosis. Ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases), ecto-nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterases (E-NPPs), ecto- 5’-nucleotidase (eNT/CD73) and tissue non-specific alkaline phosphatase (TNALP) are enzymes that are located at the cell surface and regulate the concentration of extracellular nucleotides, thereby modulating their biological effects by the activation of P1 and P2 receptors. Thus, in the study we compared the extracellular metabolism of nucleotides and transcriptional levels of ectoenzymes in activated and quiescent HSC of the mouse hepatic stellate cell line GRX. This cell line expresses a myofibroblast phenotype in basal medium and both retinol and indomethacin treatment induced a phenotypic change of GRX cells to quiescent HSC. Two phenotypes of GRX cells expressed NTPDase3 and 5, NPP1, 2 and 3, ecto-5’-nucleotidase/CD73 and TNALP. However, only activated HSC expressed NTPDase6. In quiescent HSC, the hydrolysis of triphosphonucleosides was significantly higher and was related to an increase in Entpd3 and ENPP3 mRNA expression. The diphosphonucleosides were hydrolyzed at a similar rate by two phenotypes of GRX cells and this hydrolysis was associated with an up-regulation of Entpd5 mRNA expression in quiescent-like HSC, whilst Entpd6 mRNA expression was observed only in activated HSC. The AMPase activity in quiescent HSC was higher than myofibroblasts and was related to an increase in ecto-5’-nucleotidase activity and its mRNA expression. The treatment with retinol also involves transcriptional activation of TNALP. To analyze the biological significance of eNT/CD73 in HSC, the expression of eNT/CD73 mRNA and protein was reduced in GRX cell line using the technique of RNAi. ENTCD73 knockdown leads to an increase in mRNA expression of TNALP and collagen I, and a clear alteration of cell adhesion and migration by a mechanism not dependent of changes in nucleotide metabolism. We also tested the effect of adenosine on the regulation of activation markers of in HSCs. This nucleotide decreased proliferation, migration, transcription of collagen I and matrix metalloproteinases 2 e 9 and increased transcription of eNT/CD73. The differential ectonucleotidases activities and expressions in two phenotypes of GRX cells suggest that these enzymes modulate the concentration of nucleotides/nucleosides and affect purinergic signaling differently in the two phenotypes and may play a role in the regulation of HSC functions.

As células estreladas hepáticas (HSCs) são a principal fonte de componentes de matriz extracelular em doenças crônicas do fígado e, por esta razão, exercem um papel fundamental no desenvolvimento e na manutenção da fibrose hepática. Os nucleotídeos e nucleosídeos são moléculas sinalizadoras que regulam diversos processos no fígado e têm um importante papel na patogênese da fibrose hepática. As ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases), ecto-nucleotídeo pirofosfatase fosfodiesterases (E-NPPs), ecto-5’-nucleotidase (eNT/CD73) e a fosfatase alcalina tecido inespecífica (TNALP) são enzimas localizadas na superfície celular que regulam a concentração dos nucleotídeos no meio extracelular e, desse modo, modulam os efeitos biológicos mediados por eles via ativação dos receptores P1 e P2. Assim, neste estudo nós comparamos o metabolismo extracelular de nucleotídeos e o nível transcricional das ectoenzimas em HSCs quiescentes e ativadas usando uma linhagem de células estreladas hepáticas murina GRX. Estas células expressam o fenótipo miofibroblástico em meio basal e o tratamento com retinol ou indometacina induz a mudança das células GRX para o fenótipo quiescente das HSCs. Os dois fenótipos das células GRX expressam as NTPDase3 e 5, NPP1, 2 e 3, ecto-5’- nucleotidase e TNALP. Entretanto, apenas as HSCs ativadas expressam a NTPDase6. Nas HSCs quiescentes, a hidrólise de nucleosídeos trifosfatados foi significativamente mais alta e foi correlacionada com o aumento na expressão do mRNA da Entpd3 e ENPP3. Os nucleosídeos difosfatados foram hidrolisados de maneira similar pelos dois fenótipos das células GRX e esta atividade foi associada com o aumento da expressão do mRNA da Entpd5 nas células quiescentes e com a expressão da Entpd6 apenas nas HSCs ativadas. A atividade AMPásica foi maior nas células quiescentes do que nas células ativadas e foi relacionada com o aumento da atividade e da expressão do mRNA da ecto-5’-nucleotidase. O tratamento com retinol também envolve a ativação transcricional da TNALP. Para analisar o papel fisiológico da eNT/CD73 nas HSCs, o mRNA e a expressão desta proteína foram reduzidos nas células GRX utilizando a técnica de RNAi. O knockdown da eNT/CD73 aumentou a expressão do mRNA da TNALP e do colágeno I e alterou a adesão e a migração celular através de um mecanismo independente da hidrólise de nucleotídeos. Nós também avaliamos o efeito da adenosina na regulação de marcadores de ativação das HSCs. Este nucleosídeo diminuiu a proliferação, a migração, a transcrição de colágeno I e das metaloproteinases 2 e 9 e diminuiu a transcrição da eNT/CD73. As diferenças na atividade e expressão das ectonucleotidases entre os dois fenótipos das células GRX sugerem que estas enzimas modulam a concentração de nucleotídeos/nucleosídeos e geram efeitos distintos na sinalização purinérgica nos dois fenótipos e podem ser importantes alvos na regulação das funções das HSCs. / Hepatic stellate cells (HSC) are recognized as a primary cellular source of matrix components in chronic liver disease and, therefore, play a critical role in the development and maintenance of liver fibrosis. Nucleotides and nucleosides are signaling molecules that regulate a variety of activities within the liver and play a role in the pathogenesis of hepatic fibrosis. Ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases), ecto-nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterases (E-NPPs), ecto- 5’-nucleotidase (eNT/CD73) and tissue non-specific alkaline phosphatase (TNALP) are enzymes that are located at the cell surface and regulate the concentration of extracellular nucleotides, thereby modulating their biological effects by the activation of P1 and P2 receptors. Thus, in the study we compared the extracellular metabolism of nucleotides and transcriptional levels of ectoenzymes in activated and quiescent HSC of the mouse hepatic stellate cell line GRX. This cell line expresses a myofibroblast phenotype in basal medium and both retinol and indomethacin treatment induced a phenotypic change of GRX cells to quiescent HSC. Two phenotypes of GRX cells expressed NTPDase3 and 5, NPP1, 2 and 3, ecto-5’-nucleotidase/CD73 and TNALP. However, only activated HSC expressed NTPDase6. In quiescent HSC, the hydrolysis of triphosphonucleosides was significantly higher and was related to an increase in Entpd3 and ENPP3 mRNA expression. The diphosphonucleosides were hydrolyzed at a similar rate by two phenotypes of GRX cells and this hydrolysis was associated with an up-regulation of Entpd5 mRNA expression in quiescent-like HSC, whilst Entpd6 mRNA expression was observed only in activated HSC. The AMPase activity in quiescent HSC was higher than myofibroblasts and was related to an increase in ecto-5’-nucleotidase activity and its mRNA expression. The treatment with retinol also involves transcriptional activation of TNALP. To analyze the biological significance of eNT/CD73 in HSC, the expression of eNT/CD73 mRNA and protein was reduced in GRX cell line using the technique of RNAi. ENTCD73 knockdown leads to an increase in mRNA expression of TNALP and collagen I, and a clear alteration of cell adhesion and migration by a mechanism not dependent of changes in nucleotide metabolism. We also tested the effect of adenosine on the regulation of activation markers of in HSCs. This nucleotide decreased proliferation, migration, transcription of collagen I and matrix metalloproteinases 2 e 9 and increased transcription of eNT/CD73. The differential ectonucleotidases activities and expressions in two phenotypes of GRX cells suggest that these enzymes modulate the concentration of nucleotides/nucleosides and affect purinergic signaling differently in the two phenotypes and may play a role in the regulation of HSC functions.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5250_1.pdf: 2079339 bytes, checksum: e9e25a54bf34a791ec9cd207a86bb39d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / Reações catalíticas promovidas por paládio(0) têm sido utilizadas nos últimos anos com sucesso para diversas reações de acoplamento entre carboidratos e bases nitrogenadas como nucleófilos para síntese de nucleosídeos e nucleotídeos com pronunciadas propriedades antivirais e anticancerígenas. Nos últimos 20 anos, paládio(0) também têm se mostrado versáteis ferramentas para a funcionalização de bases pirimidínicas de nucleosídeos, em especial através das reações de Heck, Suzuki, Stille e Sonogashira, resultando também em compostos biologicamente ativos. Essas reações, hoje, devidamente incorporadas aos procedimentos de síntese orgânica são amplamente utilizadas devido as alta regio- e estereosseletividade e amplo espectro de aplicações. O reação de acoplamento entre varios heterociclos e piranosídeos 2,3-insaturados mediado por Pd(0) como catalisador (reação de Tsuji-Trost) forneceu a formação de ligações C-N na posição alílica (C-4) da molécula do açúcar, gerando glicosídeos 2,3-insaturados acoplados a um núcelo heterocíclico nessa posição (105a-h). Os glicosídeos 105d (X = I) e 105e (X = Br) tiveram suas reatividades testados com uma variedade de compostos apresentando funções acetilênicas terminais, vinílicas e arila mediadas por Pd(0) como catalisador (reações de Heck, Stille, Suzuki e Sonogashira) com intuito de promover a funcionalização da posição C-5 do heterociclo uracila. Com esse intuito, a reação de Heck forneceu uma nova substância (106) em baixo rendimento (18%) com configuração E do grupo inserido. O acoplamento de Stille utilizando CuI como cocatalisador forneceu o composto desejado 108 em 86% de rendimento. Em contrapartida, o acoplamento de Suzuki forneceu três novos produtos (107a-c), em baixos rendimentos (∼5%). Acoplamento de Sonogashira produziu os glicoheterociclos (109a-l, 111) em rendimentos de bons a excelentes (41-98%). A reação de 105d com 1-hexino e dietino-1,4-benzeno gerou os esperados 109b e 111, e como produtos secundários 100 e 112, respectivamente. Os ensaios de atividade biológica desses novos compostos estão em andamento e deverão ter seus resultados apresentados brevemente.

Orientador: Anete Pereira de Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T21:21:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Saraiva_AntonioMarcos_D.pdf: 12032714 bytes, checksum: 1262a05ca10735e855fa138a2093d04b (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A linhagem 9a5c da bactéria Xylella fastidiosa foi o primeiro fitopatógeno a ter seu genoma completamente sequenciado, o qual gerdu diversas informações sobre seu metabolismo e patogenicidade. Das orfs codificadas por esta bactéria, destaca-se; no presente trabalho, a XF0703, cuja proteína correlata (com 28,3 kDa) possui similaridade com proteínas SurE de várias outras bactérias. Proteínas SurEs são nucleotidases que desfosforilam diversos nucleosideos monofosforilados para seus respectivos nucleosideos. Tal função é de fundamental importância para manter o pool balanceado dos quatro (deoxi)ribonucleosideos para síntese de DNA e RNA, respectivamente. Este trabalho descreve a clonagem da orfXF0703 no vetor pET29a, a expressão da proteína recombinante (XfSurE) em Escheríchia coli BL21(DE3) e a purificação da mesma por cromatografia de afinidade ao níquel. A análise da estrutura secundária foi feita por dicroísmo circular e realizou-se a determinação do estado oligomérico por cromatografia de gel filtração e espalhamento de luz a baixo ângulo (SAXS), os quais revelaram que a proteína é um tetrâmero. Dados de caracterização funcional indicam que a proteína possui maior atividade em pH neutro na presença do íon manganês como cofator, com uma maior afinidade pelo substrato 3'-AMP (K0,5=0,16 mM). Além disso, ensaios cinéticos mostram que a proteína possui um comportamento alostérico com alta cooperatividade positiva (coeficiente de Hill em torno de 2,6) com todos os quatro substratos naturais testados (3'-AMP, 5'-dAMP, 5'-AMP e 5-GMP). Experimentos com a técnica de SAXS permitiram calcular o raio de giro (32,7 ± 0.2 A), distância máxima intramolecular (100 A) e a simetria do envelope da molécula (222). A estrutura de diversas SurEs homólogas já cristalizadas foram superpostas ao envelope obtido, sendo que StSurE (SurE de Salmonella com maior idenjidade de aminoácidos) mostrou ter o melhor ajuste. No entanto, notou-se que havia espaços vazios no envelope de XfSurE e tais espaços podiam ser preenchidos a partir do afastamento das alças responsáveis pela tetramerização e pela rotação dos f dímeros. Estes movimentos (translação e rotação) podem explicar o comportamento alostérico da proteína, facilitando a entrada de substrato ao sítio catalítico da molécula. / Abstract: The 9a5c strain from bacterium Xylella fastidiosa was the first phytopathogen to have its genome completely sequenced, which revealed a lot of information about its metabolism and its pathogenicity. 'From a variety of orfs encoded by this bacterium, we highlight, in this work, the XF0703, which correlated protein (with 28.3 kDa) has similarity with SurE proteins from several other bacteria. The SurE proteins *are nucleotidases that dephosphorylate various monophosphorylated nucleosides to their respective nucleosides. This function is critical for maintaining the balanced pool of four (deoxy) ribonucleosides for DNA and RNA synthesis. In this work, we describes the cloning of the XF0703 orf into the vector pET29a, the recombinant protein overexpression (XfSurE) in Escherichia coli BL21(DE3) and the protein purification by nickel affinity chromatography. The secondary structure analysis was done by circular dichroism, while oligomeric state determination was achieved by gel filtration chromatography and small-angle X-ray light scattering (SAXS), which showed that the protein is a tetramer. Functional characterization data indicate that the protein has a highest activity at neutral pH in the presence of manganese as a cofactor, with a highest affinity for the 3-AMP substrate (K0,5 = 0,16 mM). Furthermore, kinetic tests showed that the protein has a allosteric behavior with a high positive cooperativity (Hill coefficient around 2.6) for all natural substrates screened (3-AMP, 5'-dAMP, 5'-AMP and 5'-GMP). Experiments with SAXS technique have allowed to calculate the radius of gyration (32.7 ± 0.2 A), maximum intramolecular distance (100 A) and molecule symmetry. / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular