Peu d’enzymes de synthèse de composés odorants sont connues chez le genre Rosa. Ce travail de thèse a permis l’identification de quelques-unes de ces protéines grâce à la technologie des puces à ADN, à l’analyse de l’expression des gènes par RT-PCR quantitative en temps réel (qPCR) et à l’analyse des parfums par chromatographie en phase gazeuse (CPG). Une puce confrontant les ADNc d’une rose parfumée à ceux d’une rose non parfumée a permis de corréler l’expression d’un gène, codant pour une Nudix hydrolase, très fortement exprimé dans la rose parfumée, avec la présence des monoterpènes dans le parfum de nombreux cultivars de rosiers. La caractérisation d’un rosier dont l’expression de ce gène est fortement réduite par ARN interférants, a permis de confirmer le rôle de celui-ci dans la synthèse des monoterpènes. La phénylacétaldéhyde synthase (PAAS) est une autre enzyme participant à la synthèse du parfum. Trois allèles de cette protéine ont précédemment été mis en évidence. Les résultats de qPCR et de CPG dans une population hybride ont permis de montrer que l’allèle a1 est le seul à pouvoir induire la synthèse et l’émission de 2-phényléthanol. Les activités respectives des différentes isoformes ont été testées in vitro chez la levure et in planta dans des feuilles de tabac et des cals de rosier : ces expériences montrent que les trois isoformes ont des activités comparables. L’absence de synthèse de 2-phényméthanol chez les plantes présentant les isoformes a2 et a3 réside donc dans la très faible expression de leurs allèles, induisant probablement une faible concentration de l’isoforme dans les cellules / Very few enzymes responsible for the biosynthesis of scent compounds in the genus Rosa are known so far. This PhD thesis aims to identify some of these proteins with DNA microarray technology, gene expression analysis by real-time quantitative PCR (qPCR) and scent analysis by gas chromatography (GC). An array comparing cDNA from a scented rose to those of a non-scented one, showed a correlation between expression of a yet-unknown gene, encoding a Nudix hydrolase, highly expressed in the scented rose, and the presence of monoterpenes in the scent of many rose cultivars. Characterization of a rose cultivar, in which expression of this gene has been decreased by RNA interference, confirmed its role in monoterpene synthesis. The phenylacetaldehyde synthase (PAAS) is another enzyme implicated in scent biosynthesis. Three alleles of this protein had been previously described. qPCR and GC experiments in a hybrid population showed that the a1 allele is the only one able to induce 2-phenylethanol biosynthesis. The respective activities of the different isoforms were tested in vitro in yeast, and in planta in tobacco leaves and rose calli: these experiments showed that the three isoforms have comparable activities. The lack of 2-phenylethanol production in plants having a2 and a3 isoforms is thus due to the very low expression of their respective alleles, probably inducing very low isoform concentration in cells

Le gène RhDIF1 s'exprime uniquement dans les pétales de roses parfumées et au moment où la fleur produit des monoterpènes comme le géraniol, le citronellol ou le nérol. RhDIF1est donc un gène candidat pour être impliqué dans la production de monoterpènes chez les roses parfumées. Le travail de cette thèse consiste à trouver une explication pour l'absence de l'expression de RhDIFI1 chez des roses peu parfumées et à caractériser moléculairement la protéine recombinante RhDIF1. L'absence d'expression de RhDIF1 chez les roses peu parfumées est probablement due à des perturbations importantes dans le promoteur du gène en comparaison avec le promoteur de RhDIF1 chez une rose parfumée. La séquence de la protéine RhDIF1 possède un domaine caractéristique nudix hydrolase. Les nudix hydrolases sont des pyrophosphohydrolases clivant par exemple des dNTPs oxydés mutagènes, des molécules tels que l'ADP-ribose potentiellement toxiques ou encore le NADP. Des essais d'activités enzymatiques de la protéine RhDIF1 avec du GPP n'ont pas montré la production de monoterpènes. Une potentielle activité IPP isomérase de RhDIF1 doit être testée. Aussi, des conversions entre le géraniol et d'autres monoterpènes chez les roses parfumées peuvent nécessiter du NADP comme cofacteur et une possible implication de RhDIF1 dans ces réactions via le métabolisme du NADP doit également être vérifiée. Sur la base de l’homologie de séquence de RhDIF1 avec la 8-oxo-dGTPase AtNUDX1 d’Arabidopsis thaliana, des essais d'activités enzymatiques avec le dATP, dCTP, dGTP, dTTP et le nucléotide oxydé mutagène 8-oxo-dGTP ont montré que RhDIF1 clive ces substrats sauf le dCTP. En outre, la détermination de valeurs de Km vis à vis de ces dNTPs tendent à montrer que RhDIF1 clive préférentiellement des substrats contenant une purine. Une activité spécifique de RhDIF1 sur le dATP nettement supérieure à celles des autres dNTPs nous incitent à nous poser la question si le nucléotide oxydé mutagène 2-hydroxy-dATP n'est pas aussi un potentiel substrat de RhDIF1. Dans l'hypothèse où RhDIF1 serait une nudix hydrolase dégradant des dNTPs oxydés mutagènes, RhDIF1 aurait alors comme rôle la détoxification du pool de nucléotide en éliminant les dNTPs oxydés apparus suite à un stress oxydatif pouvant avoir comme origine la production de géraniol par les pétales de rose / The expression of the RhDIF1 gene is observed only in petals of scented roses when the flower emit monoterpenes. Thus, RhDIF1 has been thought to be involved in the production of such compouds in scented roses. During this thesis, an explanation for the absence of expression of RhDIF1 in non-scented roses and a molecular characterization of the RhDIF1 recombinant protein have been investigated. The absence of expression of RhDIF1 in non-scented roses may be due to strong modifications observed in the promoter compared to the RhDIF1 homolog in a scented rose. A typical nudix domain is included in the RhDIF1 protein sequence. Nudix hydrolases are pyrophosphohydrolases cleaving mutagenic oxidated dNTPs, potentially toxic molecules like ADP-ribose or NADP for examples. Enzymatic assays of RhDIF1 with GPP showed any production of monoterpenes. A potential IPP isomerase activity of RhDIF1 must be tested. Also, conversions between geraniol and other monoterpenes in scented roses may needs NADP as cofactor and a possible involvement of RhDIF1 in these reactions via the NADP metabolism must be checked too. Based on the sequence homology between RhDIFI1and the Arabidopsis thaliana 8-oxo-dGTPase AtNUDX1, enzymatic assays with RhDIF1 and dATP, dCTP, dGTP, dTTP and the mutagenic oxidated nucleotide 8-oxo-dGTP showed a catalytic activity of RhDIF1 on these substracts excepted for dCTP. Moreover, Km values seem to show that RhDIF1 preferentially cleaves purine containing substract. A specific activity higher for dATP than the other dNTP lead us to think if the mutagenic oxidated nucleotide 2-hydroxy-dATP could be a potential substract for RhDIF1. Thus, RhDIF1 could be involved in the nucleotide pool sanitization by eliminating oxidated nucleotides appeared from an oxidative stress potentially due to the geraniol production by rose petal

Peu d'enzymes de synthèse de composés odorants sont connues chez le genre Rosa. Ce travail de thèse a permis l'identification de quelques-unes de ces protéines grâce à la technologie des puces à ADN, à l'analyse de l'expression des gènes par RT-PCR quantitative en temps réel (qPCR) et à l'analyse des parfums par chromatographie en phase gazeuse (CPG). Une puce confrontant les ADNc d'une rose parfumée à ceux d'une rose non parfumée a permis de corréler l'expression d'un gène, codant pour une Nudix hydrolase, très fortement exprimé dans la rose parfumée, avec la présence des monoterpènes dans le parfum de nombreux cultivars de rosiers. La caractérisation d'un rosier dont l'expression de ce gène est fortement réduite par ARN interférants, a permis de confirmer le rôle de celui-ci dans la synthèse des monoterpènes. La phénylacétaldéhyde synthase (PAAS) est une autre enzyme participant à la synthèse du parfum. Trois allèles de cette protéine ont précédemment été mis en évidence. Les résultats de qPCR et de CPG dans une population hybride ont permis de montrer que l'allèle a1 est le seul à pouvoir induire la synthèse et l'émission de 2-phényléthanol. Les activités respectives des différentes isoformes ont été testées in vitro chez la levure et in planta dans des feuilles de tabac et des cals de rosier : ces expériences montrent que les trois isoformes ont des activités comparables. L'absence de synthèse de 2-phényméthanol chez les plantes présentant les isoformes a2 et a3 réside donc dans la très faible expression de leurs allèles, induisant probablement une faible concentration de l'isoforme dans les cellules