Lagent de lutte biologique Aureobasidium pullulans souche Ach1-1 a présenté une grande potentialité dans le contrôle de Penicillium expansum, lagent causal de la pourriture bleue des pommes en conservation. Les mécanismes daction qui sont les plus impliqués dans son activité antagoniste ont été analysés, au cours de ce travail. Daprès des essais de protection réalisés sur pommes blessées, il apparaît que lefficacité de cette souche nest pas liée essentiellement à la sécrétion des métabolites toxiques dans le milieu ou à linduction de la résistance de fruit. Par contre, le mécanisme de la compétition pour la nutrition semble jouer un rôle important. Dans les essais in vitro, la souche antagoniste Ach1-1 a eu un important effet inhibiteur de la germination des conidies de P. expansum dans des milieux de jus de pomme à des faibles concentrations. Mais cet effet était réversible et les conidies inhibées étaient capables de germer une fois remises dans des conditions favorables en éléments nutritifs. Sur pommes blessées, leffet protecteur de la souche Ach1-1 vis-à-vis de P. expansum a été significativement affaibli par lajout dans les blessures de concentrations élevées des principaux composants des pommes en sucres, en vitamines et particulièrement en acides aminés. Il apparaît que lantagoniste exerce une activité fongistatique plus que fongicide vis-à-vis de P. expansum et agit par une compétition efficace pour les éléments nutritifs des blessures des pommes sans affecter la viabilité des conidies du pathogène. Une application exogène des acides aminés des pommes avec des concentrations croissantes dans les blessures a progressivement réduit lactivité antagoniste de la souche Ach1-1 sans altérer son développement dans les blessures, montrant que la compétition pour les acides aminés joue un rôle important dans la suppression de P. expansum. Ce résultat a été appuyé par lanalyse biochimique de la cinétique de lépuisement des acides aminés dans les blessures des pommes qui a montré que ces composés et particulièrement la sérine, la glycine et lacide glutamique sont mieux métabolisés par la souche antagoniste que par le pathogène. Lajout en excès de ces trois acides aminés en groupe ou individuellement dans les blessures des pommes a fortement réduit lefficacité de la souche Ach1-1 vis-à-vis de P. expansum. De plus, la présence de la sérine et la glycine avec des concentrations élevées dans des milieux synthétiques ne présentant aucune source azotée, a réduit leffet inhibiteur de la germination des conidies de P. expansum par la souche Ach1-1. Ainsi, ces acides aminés semble être parmi les éléments les plus limitants dans le mécanisme de la compétition./The biocontrol agent Aureobasidium pullulans strain Ach1-1 was very effective against Penicillium expansum, the causal agent of blue mold on stored apple. Modes of action that could be involved in its biocontrol activity were analysed in this work. According to some biocontrol trials on wounded apples, it appears that neither the production of metabolites nor the induction of fruit resistance were the principal modes of action of this strain. However the mechanism of nutrient competition appears to play an important role. In in vitro assays, the strain Ach1-1 had an important inhibitory effect of conidial germination of P. expansum in apple juice at low concentrations. However this inhibitory effect was suppressed when inhibited conidia were placed in favourable nutrients conditions. On wounded apples the protective activity of strain Ach1-1 against P. expansum was significantly reduced by adding, in the wounds, high concentrations of major apple compounds of sugar, vitamins and most particularly amino acids. It appears that the antagonist exerts a fungistatic rather than fungicidal activi ty on P. expansum as it can deplete limiting nutrient available at the infection site and inhibit conidia germination without affecting their viability. Moreover, an exogenous application of increasing apple amino acids concentrations in wounds had progressively reduced the antagonist activity of strain Ach1-1 without altering its development in wounds, suggesting that competition for apple amino acids by strain Ach1-1 plays an important role in suppressing P. expansum. This finding was strengthened by a time-course analysis of wounds amino acids during apple incubation in witch the strain Ach1-1 was able to assimilate apple amino acids better than P. expansum, most particularly Serine, Glycin and Glutamic acid. Exogenous additions of these three amino acids at high concentrations on apple wounds as a mixture or individually, strongly lowered the Biocontrol activity of strain Ach1-1. Moreover, the existence of amino acids serine and glycin at high concentration in synthetic media, without any nitrogen source, was able to reduce the inhibitory effect of conidial germination of P. expansum by the strain Ach1-1.Therefore these amino acids could be among the most limited nutrients in the mechanism of competition.

O objetivo desta Tese foi avaliar o papel da macrófitas submersas em relação à qualidade da água, interações com o fitoplâncton e ciclagem biogeoquímica na Lagoa Mangueira, um grande lago raso subtropical, no sul do Brasil. Para alcançar estes objetivos, este trabalho conta com uma série de abordagens, como: levantamentos de campo, etapas experimentais e uso de modelos ecológicos para avaliar a influência de macrófitas sobre a dinâmica do ecossistema de estudo, cujas águas são intensamente exploradas para suprir a cultura de arroz em sua área de entorno. Ao longo de seus 200km de perímetro litorâneo, a Lagoa apresenta maciços estandes submersos de vegetação. A análise de qualidade da água e estrutura da comunidade fitoplanctônica ao longo de um gradiente de vegetação submersa, partindo da zona litorânea para a zona pelágica (sem vegetação), revelou menor disponilibidade de nutrientes como orto-fosfato (PO4) e menor concentração de clorofila-a (Clo-a), na área com vegetação submersa. Na zona pelágica, os maiores valores de Clo-a foram corroborados pela maior biomassa fitoplanctônica, sendo representada principalmente por espécies de cianobactérias. Tais evidências sugerem o efeito antagônico entre macrófitas e fitoplâncton, como a competição por nutrientes e alelopatia. Em laboratório, estes mecanismos puderam ser comprovados em experimentos de coexistência realizados em microcosmos com 4 espécies de macrófitas nativas e uma cepa da cianobactéria Microcystis aeruginosa. Os testes envolveram níveis distintos de intensidade luminosa e concentração de PO4 visando determinar limiares para a ocorrência de alelopatia. As espécies Cabomba caroliniana e Myriophyllum spicatum se demonstraram potencialmente alelopáticas enquanto que as espécies Ceratophyllum demersum e Egeria densa apresentaram elevada capacidade de absorção de PO4 (±0,35 mg.g-1d-1) reduzindo rapidamente a concentração deste nutriente a valores abaixo de 0,05 mg.L-1. Outra abordadem experimental foi conduzida para parametrizar a cinética da liberação de nutrientes e carbono de 5 espécies de macrófitas durante o processo de decomposição. Com o auxílio de modelos ecológicos, foi simulado o crescimento de macrófitas submersas em lagos subtropicais e temperados. Isto foi realizado visando avaliar a possibilidade de aumento da resilência do estado de dominância por macrófitas em lagos de baixa latidude devido ao crescimento contínuo da vegetação, ao contrário de lagos temperados, onde as plantas morrem sazonalmente em função do inverno rigoroso. Além disso, foram simulados cenários considerando a possibilidade de colapso da vegetação submersa na Lagoa Mangueira em função de intensa tomada da água da Lagoa para irrigação. Com base na modelagem, foi possível estimar limiares de eutrofização para a proliferação do fitoplâncton. Em suma, os resultados comprovaram os mecanismos de retroalimentação positiva de macrófitas submersas sobre a qualidade da água e importância de suas funções ecológicas para o estado trófico e gestão da Lagoa Mangueira. Além disso, este conjunto de informações constitui uma base teórico-prática para o manejo, restauração e conservação de lagos rasos subtropicais e tropicais. / The aim of this Thesis was to evaluate the role of the submerged macrophytes with respect to water quality and, interactions with phytoplankton and nutrient cycling in the large shallow subtropical Lake Mangueira, southern Brazil. To achieve these goals, this work counts with approaches in situ, in laboratory and aplication of ecological modelling to verifify the influence of the submerged vegetation over the dynamics of the ecosystem, whose water is intensively explored to irrigate rice crops around its surrounding area. Over the 200km of the lake littoral perimeter, several submerged macrophyte beds are established. The analysis of water quality and phytoplankton structure along a macrophyte-pelagic gradient revealed lower concentration of orto-phosphate (PO4) and chlorophyll-a (Chlo-a) in the vegetated area. At the pelagic zone, the higher Chlo-a values were corroborated by the higher biomass of phytoplankton, which was mostly composed by cyanobacteria species. Such evidences suggest the antagonistic relantionship between macrophytes and phytoplankton as nutrient competition and allelopathy. Experiments of coexistance, in microcosms, with 4 native submerged macrophytes and a toxic strain of the cyanobacteria Microcystis aeruginosa proved the occurrence of these mechanisms. The experiments included different levels of light intensity and orto-phosphate concentration (PO4) in the medium aiming to identify thresholds in which allelopathy is likely to occur. The macrophytes Cabomba caroliniana and Myriophyllum spicatum showed allelopathic potential while the species Ceratophyllum demersum and Egeria densa showed a high capacity for PO4 absorption (±0.35 mg.g-1d-1), being able to reduce this nutrient to lower levels than 0.05 mg.L-1. Another experimental approach was carried out to parameterize the leaching of nutrients and carbon from 5 macrophytes under decaying process. Moreover, ecological modelling was utilized to simulate the growth of submerged macrophytes in subtropical and temperate lakes. This was done aiming to evaluate the possibility of resilience enhancement of the clear water state in lakes of low latitude because the plants can grow continuously, in contrast with temperate lakes, where they die seasonally due to rigorous winter. In addition, simulation of scenarios considering the collapse of the vegetation in Lake Mangueira because of water uptake for rice crops were carried out in oder to provide elements for the ecosystem management. Through this approach, it was possible to forecast possible eutrophication thresholds for phytoplankton blomming. In conclusion, the results proved the the postive feed-back mechanisms exerted by the submerged macrophytes on the water quality and the importance of their ecological functions to the trophic state of Lake Mangueira. In addition, such information serve as theoretical and practical basis for the management, restoration and conservation of subtropical and tropical shallow lakes.

O objetivo desta Tese foi avaliar o papel da macrófitas submersas em relação à qualidade da água, interações com o fitoplâncton e ciclagem biogeoquímica na Lagoa Mangueira, um grande lago raso subtropical, no sul do Brasil. Para alcançar estes objetivos, este trabalho conta com uma série de abordagens, como: levantamentos de campo, etapas experimentais e uso de modelos ecológicos para avaliar a influência de macrófitas sobre a dinâmica do ecossistema de estudo, cujas águas são intensamente exploradas para suprir a cultura de arroz em sua área de entorno. Ao longo de seus 200km de perímetro litorâneo, a Lagoa apresenta maciços estandes submersos de vegetação. A análise de qualidade da água e estrutura da comunidade fitoplanctônica ao longo de um gradiente de vegetação submersa, partindo da zona litorânea para a zona pelágica (sem vegetação), revelou menor disponilibidade de nutrientes como orto-fosfato (PO4) e menor concentração de clorofila-a (Clo-a), na área com vegetação submersa. Na zona pelágica, os maiores valores de Clo-a foram corroborados pela maior biomassa fitoplanctônica, sendo representada principalmente por espécies de cianobactérias. Tais evidências sugerem o efeito antagônico entre macrófitas e fitoplâncton, como a competição por nutrientes e alelopatia. Em laboratório, estes mecanismos puderam ser comprovados em experimentos de coexistência realizados em microcosmos com 4 espécies de macrófitas nativas e uma cepa da cianobactéria Microcystis aeruginosa. Os testes envolveram níveis distintos de intensidade luminosa e concentração de PO4 visando determinar limiares para a ocorrência de alelopatia. As espécies Cabomba caroliniana e Myriophyllum spicatum se demonstraram potencialmente alelopáticas enquanto que as espécies Ceratophyllum demersum e Egeria densa apresentaram elevada capacidade de absorção de PO4 (±0,35 mg.g-1d-1) reduzindo rapidamente a concentração deste nutriente a valores abaixo de 0,05 mg.L-1. Outra abordadem experimental foi conduzida para parametrizar a cinética da liberação de nutrientes e carbono de 5 espécies de macrófitas durante o processo de decomposição. Com o auxílio de modelos ecológicos, foi simulado o crescimento de macrófitas submersas em lagos subtropicais e temperados. Isto foi realizado visando avaliar a possibilidade de aumento da resilência do estado de dominância por macrófitas em lagos de baixa latidude devido ao crescimento contínuo da vegetação, ao contrário de lagos temperados, onde as plantas morrem sazonalmente em função do inverno rigoroso. Além disso, foram simulados cenários considerando a possibilidade de colapso da vegetação submersa na Lagoa Mangueira em função de intensa tomada da água da Lagoa para irrigação. Com base na modelagem, foi possível estimar limiares de eutrofização para a proliferação do fitoplâncton. Em suma, os resultados comprovaram os mecanismos de retroalimentação positiva de macrófitas submersas sobre a qualidade da água e importância de suas funções ecológicas para o estado trófico e gestão da Lagoa Mangueira. Além disso, este conjunto de informações constitui uma base teórico-prática para o manejo, restauração e conservação de lagos rasos subtropicais e tropicais. / The aim of this Thesis was to evaluate the role of the submerged macrophytes with respect to water quality and, interactions with phytoplankton and nutrient cycling in the large shallow subtropical Lake Mangueira, southern Brazil. To achieve these goals, this work counts with approaches in situ, in laboratory and aplication of ecological modelling to verifify the influence of the submerged vegetation over the dynamics of the ecosystem, whose water is intensively explored to irrigate rice crops around its surrounding area. Over the 200km of the lake littoral perimeter, several submerged macrophyte beds are established. The analysis of water quality and phytoplankton structure along a macrophyte-pelagic gradient revealed lower concentration of orto-phosphate (PO4) and chlorophyll-a (Chlo-a) in the vegetated area. At the pelagic zone, the higher Chlo-a values were corroborated by the higher biomass of phytoplankton, which was mostly composed by cyanobacteria species. Such evidences suggest the antagonistic relantionship between macrophytes and phytoplankton as nutrient competition and allelopathy. Experiments of coexistance, in microcosms, with 4 native submerged macrophytes and a toxic strain of the cyanobacteria Microcystis aeruginosa proved the occurrence of these mechanisms. The experiments included different levels of light intensity and orto-phosphate concentration (PO4) in the medium aiming to identify thresholds in which allelopathy is likely to occur. The macrophytes Cabomba caroliniana and Myriophyllum spicatum showed allelopathic potential while the species Ceratophyllum demersum and Egeria densa showed a high capacity for PO4 absorption (±0.35 mg.g-1d-1), being able to reduce this nutrient to lower levels than 0.05 mg.L-1. Another experimental approach was carried out to parameterize the leaching of nutrients and carbon from 5 macrophytes under decaying process. Moreover, ecological modelling was utilized to simulate the growth of submerged macrophytes in subtropical and temperate lakes. This was done aiming to evaluate the possibility of resilience enhancement of the clear water state in lakes of low latitude because the plants can grow continuously, in contrast with temperate lakes, where they die seasonally due to rigorous winter. In addition, simulation of scenarios considering the collapse of the vegetation in Lake Mangueira because of water uptake for rice crops were carried out in oder to provide elements for the ecosystem management. Through this approach, it was possible to forecast possible eutrophication thresholds for phytoplankton blomming. In conclusion, the results proved the the postive feed-back mechanisms exerted by the submerged macrophytes on the water quality and the importance of their ecological functions to the trophic state of Lake Mangueira. In addition, such information serve as theoretical and practical basis for the management, restoration and conservation of subtropical and tropical shallow lakes.

O objetivo desta Tese foi avaliar o papel da macrófitas submersas em relação à qualidade da água, interações com o fitoplâncton e ciclagem biogeoquímica na Lagoa Mangueira, um grande lago raso subtropical, no sul do Brasil. Para alcançar estes objetivos, este trabalho conta com uma série de abordagens, como: levantamentos de campo, etapas experimentais e uso de modelos ecológicos para avaliar a influência de macrófitas sobre a dinâmica do ecossistema de estudo, cujas águas são intensamente exploradas para suprir a cultura de arroz em sua área de entorno. Ao longo de seus 200km de perímetro litorâneo, a Lagoa apresenta maciços estandes submersos de vegetação. A análise de qualidade da água e estrutura da comunidade fitoplanctônica ao longo de um gradiente de vegetação submersa, partindo da zona litorânea para a zona pelágica (sem vegetação), revelou menor disponilibidade de nutrientes como orto-fosfato (PO4) e menor concentração de clorofila-a (Clo-a), na área com vegetação submersa. Na zona pelágica, os maiores valores de Clo-a foram corroborados pela maior biomassa fitoplanctônica, sendo representada principalmente por espécies de cianobactérias. Tais evidências sugerem o efeito antagônico entre macrófitas e fitoplâncton, como a competição por nutrientes e alelopatia. Em laboratório, estes mecanismos puderam ser comprovados em experimentos de coexistência realizados em microcosmos com 4 espécies de macrófitas nativas e uma cepa da cianobactéria Microcystis aeruginosa. Os testes envolveram níveis distintos de intensidade luminosa e concentração de PO4 visando determinar limiares para a ocorrência de alelopatia. As espécies Cabomba caroliniana e Myriophyllum spicatum se demonstraram potencialmente alelopáticas enquanto que as espécies Ceratophyllum demersum e Egeria densa apresentaram elevada capacidade de absorção de PO4 (±0,35 mg.g-1d-1) reduzindo rapidamente a concentração deste nutriente a valores abaixo de 0,05 mg.L-1. Outra abordadem experimental foi conduzida para parametrizar a cinética da liberação de nutrientes e carbono de 5 espécies de macrófitas durante o processo de decomposição. Com o auxílio de modelos ecológicos, foi simulado o crescimento de macrófitas submersas em lagos subtropicais e temperados. Isto foi realizado visando avaliar a possibilidade de aumento da resilência do estado de dominância por macrófitas em lagos de baixa latidude devido ao crescimento contínuo da vegetação, ao contrário de lagos temperados, onde as plantas morrem sazonalmente em função do inverno rigoroso. Além disso, foram simulados cenários considerando a possibilidade de colapso da vegetação submersa na Lagoa Mangueira em função de intensa tomada da água da Lagoa para irrigação. Com base na modelagem, foi possível estimar limiares de eutrofização para a proliferação do fitoplâncton. Em suma, os resultados comprovaram os mecanismos de retroalimentação positiva de macrófitas submersas sobre a qualidade da água e importância de suas funções ecológicas para o estado trófico e gestão da Lagoa Mangueira. Além disso, este conjunto de informações constitui uma base teórico-prática para o manejo, restauração e conservação de lagos rasos subtropicais e tropicais. / The aim of this Thesis was to evaluate the role of the submerged macrophytes with respect to water quality and, interactions with phytoplankton and nutrient cycling in the large shallow subtropical Lake Mangueira, southern Brazil. To achieve these goals, this work counts with approaches in situ, in laboratory and aplication of ecological modelling to verifify the influence of the submerged vegetation over the dynamics of the ecosystem, whose water is intensively explored to irrigate rice crops around its surrounding area. Over the 200km of the lake littoral perimeter, several submerged macrophyte beds are established. The analysis of water quality and phytoplankton structure along a macrophyte-pelagic gradient revealed lower concentration of orto-phosphate (PO4) and chlorophyll-a (Chlo-a) in the vegetated area. At the pelagic zone, the higher Chlo-a values were corroborated by the higher biomass of phytoplankton, which was mostly composed by cyanobacteria species. Such evidences suggest the antagonistic relantionship between macrophytes and phytoplankton as nutrient competition and allelopathy. Experiments of coexistance, in microcosms, with 4 native submerged macrophytes and a toxic strain of the cyanobacteria Microcystis aeruginosa proved the occurrence of these mechanisms. The experiments included different levels of light intensity and orto-phosphate concentration (PO4) in the medium aiming to identify thresholds in which allelopathy is likely to occur. The macrophytes Cabomba caroliniana and Myriophyllum spicatum showed allelopathic potential while the species Ceratophyllum demersum and Egeria densa showed a high capacity for PO4 absorption (±0.35 mg.g-1d-1), being able to reduce this nutrient to lower levels than 0.05 mg.L-1. Another experimental approach was carried out to parameterize the leaching of nutrients and carbon from 5 macrophytes under decaying process. Moreover, ecological modelling was utilized to simulate the growth of submerged macrophytes in subtropical and temperate lakes. This was done aiming to evaluate the possibility of resilience enhancement of the clear water state in lakes of low latitude because the plants can grow continuously, in contrast with temperate lakes, where they die seasonally due to rigorous winter. In addition, simulation of scenarios considering the collapse of the vegetation in Lake Mangueira because of water uptake for rice crops were carried out in oder to provide elements for the ecosystem management. Through this approach, it was possible to forecast possible eutrophication thresholds for phytoplankton blomming. In conclusion, the results proved the the postive feed-back mechanisms exerted by the submerged macrophytes on the water quality and the importance of their ecological functions to the trophic state of Lake Mangueira. In addition, such information serve as theoretical and practical basis for the management, restoration and conservation of subtropical and tropical shallow lakes.

[ES] Las bacterias resistentes a múltiples antibióticos, como el Enterococo resistente a vancomicina (ERV), son un problema creciente en los pacientes hospitalizados, por lo que se necesita estrategias alternativas para combatir estos patógenos. Las infecciones causadas por ERV suelen comenzar con la colonización del tracto intestinal, un paso crucial que se afectado por la presencia de la microbiota. Sin embargo, los antibióticos alteran la microbiota y esto promueve la colonización de ERV. Una vez que el patógeno ha colonizado el intestino, alcanza niveles muy altos pudiendo diseminar a otros órganos y pacientes. A pesar de su importancia, se sabe muy poco sobre los genes que codifica para colonizar el intestino y sobre el mecanismo por el cual la microbiota suprime su colonización intestinal, siendo los dos objetivos principales. En primer lugar hemos utilizado una metodología previamente descrita (Zhang et al., 2017, BMC Genomics), basada en la generación de una librería de mutantes por transposición junto a secuenciación masiva, con el fin de identificar los genes codificados por ERV necesarios para la colonización del intestino en ratones. Además, hemos realizado análisis metatranscriptómicos para identificar aquellos genes más expresados. El análisis ha identificado genes cuya interrupción reduce significativamente la colonización intestinal en el intestino grueso. Los genes que más afectaron a la colonización codifican proteínas relacionadas con la absorción o el transporte de diversos nutrientes como los carbohidratos (subunidad EIIAB del transportador PTS de manosa, el regulador transcripcional de la familia LacI, ácido N-acetilmurámico 6-fosfato eterasa) o iones (proteína transportadora dependiente de ATP (ABC) y proteínas del grupo [Fe-S]). El papel de estos genes en la colonización se ha confirmado mediante experimentos de mutagénesis directa y de competición con la cepa salvaje. Además, estos genes afectan a la colonización intestinal con diferentes antibióticos (clindamicina y vancomicina). Para identificar el mecanismo molecular por el cual cada gen afecta a la colonización, hemos realizado experimentos in vitro y ex vivo además del análisis transcriptómico. Los experimentos in vitro confirman que las proteínas del grupo [Fe-S] están involucradas en el transporte iones de hierro, principalmente Fe3+. Por otra parte, los genes de la subunidad EIIAB del transportador de manosa y del ácido N-acetilmurámico 6-fosfato eterasa son necesarios para la utilización de la manosa y el ácido N-acetilmurámico, respectivamente, azúcares que suelen estar presentes en el intestino. También confirmamos que el regulador transcripcional de la familia LacI es un represor que afecta a proteínas transportadoras ABC, probablemente implicadas en la absorción de carbohidratos. Además, algunos de estos genes están codificados principalmente por cepas clínicas de E. faecium y en menor medida por cepas comensales. En segundo lugar, estudiamos los mecanismos de protección de un consorcio de cinco bacterias comensales, que anteriormente se había demostrado que disminuían la colonización intestinal por ERV en ratones. Mediante transcriptómica, metabolómica y los ensayos in vivo observamos que el consorcio bacteriano inhibe el crecimiento de ERV mediante la reducción de nutrientes, concretamente fructosa. Por último, el análisis ARN-Seq in vivo de cada aislado en combinación con los ensayos ex vivo e in vivo demostraron que una sola bacteria (Olsenella sp.) proporciona protección. En conjunto, los resultados obtenidos han identificado la función de genes específicos requeridos por ERV para colonizar el intestino. Además, hemos identificado un mecanismo mediante el cual la microbiota confiere protección. Estos resultados podrían conducir a nuevos enfoques terapéuticos para prevenir las infecciones causadas por este patógeno multiresistente a los antibióticos. / [CA] Els bacteris resistents a múltiples antibiòtics, com el Enterococo resistent a vancomicina (ERV), són un problema creixent en els pacients hospitalitzats, que són resistents a la majoria d'antibiòtics disponibles per la qual cosa es necessita estratègies alternatives per a combatre aquests patògens. Les infeccions causades per ERV solen començar amb la colonització del tracte intestinal, un pas crucial que es veu afectat per la presència de la microbiota. No obstant això, els antibiòtics alteren la microbiota i això promou la colonització de ERV. Una vegada que el patogen ha colonitzat l'intestí, aconsegueix nivells molt alts podent disseminar a altres òrgans i pacients. Malgrat la seua importància, se sap molt poc sobre els gens que codifica ERV per a colonitzar l'intestí i sobre el mecanisme pel qual la microbiota suprimeix la seua colonització intestinal. En primer lloc hem utilitzat una metodologia prèviament descrita (Zhang et al., 2017, BMC Genomics), basada en la generació d'una llibreria de mutants per transposició junt amb seqüenciació massiva, amb la finalitat d'identificar els gens codificats per ERV necessaris per a la colonització de l'intestí en ratolins. A més a més, hem realitzat anàlisi metatranscriptòmics per a identificar aquells gens més expressats. L'anàlisi ha identificat gens quina interrupció redueix significativament la colonització intestinal en l'intestí gros. Els gens que més van afectar la colonització codifiquen proteïnes relacionades amb l'absorció o el transport de diversos nutrients com els carbohidrats (subunitat EIIAB del transportador PTS de manosa, el regulador transcripcional de la família LacI, àcid N-acetilmuràmic 6-fosfat eterasa) o ions (proteïna transportadora dependent d'ATP (ABC) i proteïnes del grup [Fe-S]). El paper d'aquests gens en la colonització s'ha confirmat mitjançant experiments de mutagènesis directa i de competició amb el cep salvatge. A més, aquests gens afecten la colonització intestinal amb diferents antibiòtics (clindamicina i vancomicina). Per a identificar el mecanisme molecular pel qual cada gen afecta a la colonització, hem realitzat experiments in vitro i ex viu a més de l'anàlisi transcriptòmic. Els experiments in vitro confirmen que les proteïnes del grup [Fe-S] estan involucrades en el transport d'ions de ferro, principalment Fe3+. D'altra banda, els gens de la subunitat EIIAB del transportador PTS de manosa i de l'àcid N-acetilmuràmic 6-fosfat eterasa són necessaris per a la utilització de la manosa i l'àcid N-acetilmuràmic, respectivament, sucres que solen estar presents en l'intestí. També confirmem que el regulador transcripcional de la família LacI és un repressor que afecta proteïnes transportadores ABC, probablement implicades en l'absorció de carbohidrats. A més a més, alguns d'aquests gens estan codificats principalment per ceps clínics de E. faecium i en menor mesura per ceps comensals. En segon lloc, estudiem els mecanismes de protecció d'un consorci de cinc bacteris comensals, que adès s'havia demostrat que disminuïen la colonització intestinal per ERV en ratolins. Amb l'ús de transcriptòmica, metabolòmica i els assajos in vivo observem que el consorci bacterià inhibeix el creixement de ERV mitjançant la reducció de nutrients, concretament fructosa. Finalment, l'anàlisi ARN-Seq in vivo de cada aïllat en combinació amb els assajos ex viu i in vivo van demostrar que un sol bacteri (Olsenella sp.) proporciona protecció. En conjunt, els resultats obtinguts han identificat la funció de gens específics requerits per ERV per a colonitzar l'intestí. A més, hem identificat un mecanisme mitjançant el qual la microbiota confereix protecció. Aquests resultats podrien conduir a nous enfocaments terapèutics per a previndre les infeccions causades per aquest patogen multiresistent als antibiòtics. / [EN] Multidrug-resistant bacteria, such as vancomycin-resistant-Enterococcus (VRE), are an increasing problem in hospitalized patients. Some VRE strains can be resistant to most available antibiotics, thus, alternative strategies to antibiotics are urgently needed to combat these challenging pathogens. Infections caused by VRE frequently start by colonization of the intestinal tract, a crucial step that is impaired by the presence of the intestinal microbiota. Administration of antibiotics disrupts the microbiota, which promotes VRE intestinal colonization. Once VRE has colonized the gut, it reaches very high levels, which promotes its dissemination to other organs and its transfer to other patients. Despite the relevance of VRE gut colonization, very little is known about the genes encoded by this pathogen to colonize the gut and about the mechanisms by which the microbiota suppresses VRE gut colonization. In this thesis, we have utilized a previously described methodology (Zhang et al., 2017, BMC Genomics), based on the generation of a transposon mutant library coupled with high-throughput sequencing, in order to identify VRE encoded genes required for colonization of the mouse intestinal tract. In addition, we have performed metatranscriptomic analysis in mice to identify VRE genes specifically expressed in the gut. Our analysis has identified genes whose disruption significantly reduces VRE gut colonization in the large intestine. The genes that most affected VRE gut colonization encoded for proteins related to the uptake or transport of diverse nutrients such as carbohydrates (PTS mannose transporter subunit EIIAB, LacI family DNA-binding transcriptional regulator, N-acetylmuramic acid 6-phosphate etherase) or ions (phosphate ABC transporter ATP-binding protein and proteins from [Fe-S] cluster). The role of these genes in gut colonization has been confirmed through targeted mutagenesis and competition experiments against a wild type strain. Moreover, these genes affect gut colonization under different antibiotic treatments (clindamycin and vancomycin). To elucidate the mechanism by which each gene influences gut colonization, we have performed in vitro and ex vivo experiments besides transcriptomic analysis. In vitro experiments confirm that proteins from [Fe-S] cluster are involved in the transport of different forms of iron ions, mostly Fe3+. On the other hand, the PTS mannose transporter subunit EIIAB and N-acetylmuramic acid 6-phosphate etherase genes are required for the utilization of mannose and N-acetyl-muramic acid, respectively, sugars that are usually present in the intestinal environment. We have also confirmed that LacI family DNA-binding transcriptional regulator is a repressor that affects the expression of genes encoding for an ABC transporter probably involved in the uptake of carbohydrates. Furthermore, we have confirmed that some of these genes are encoded mainly by E. faecium clinical strains but not or to a lower extent by commensal strains. Secondly, we studied the mechanisms of protection of a consortium of five commensals bacteria, previously shown to restrict VRE gut colonization in mice. Functional transcriptomics in combination with targeted metabolomics and in vivo assays performed in this thesis indicated that the bacterial consortium inhibits VRE growth through nutrient depletion, specifically by reducing the levels of fructose. Finally, in vivo RNA-Seq analysis of each bacterial isolate of the consortium in combination with ex vivo and in vivo assays demonstrated that a single bacterium (Olsenella sp.) could recapitulate the protective effect. Altogether, the results obtained have identified the function of specific genes required by VRE to colonize the gut. In addition, we have identified a specific mechanism by which the microbiota confers protection against VRE colonization. These results could lead to novel therapeutic approaches to prevent infections caused by this pathogen. / Flor Duro, A. (2021). Characterization of Genes and Functions Required by Multidrug-resistant Enterococci to Colonize the Intestine [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/166494