OBJETIVO: Determinar la resistencia antibiótica de las cepas de Shigella aisladas en el Hospital Daniel A. Carrión MATERIALES Y METODOS: Se resembraron las 159 cepas de Shigella aisladas del 01 de Enero 1999 al 31 de Diciembre del 2001, siendo viables 111 de ellas con las que se desarrollo el estudio. RESULTADOS: De las 111 cepas, 89 provenían de muestras de heces (80%), 73 eran flexneri (67%), la resistencia a Ampicilina fue 81%, a Cloramfenicol 72%, a Cotrimoxazol 72%, a Amikacina 13%, a Gentamicina 9%, a Ácido Nalidíxico 14%, a Norfloxacina 1%, a Ciprofloxacina 2%; la resistencia múltiple más frecuente fue a 6 antibióticos con 36 cepas (32.4%), y el patrón de resistencia más frecuente fue Ampicilina, Sultamicilina, Cloramfenicol, Doxiciclina, Cotrimoxazol, Tetraciclina con 22 cepas (19.8%). CONCLUSIONES: Shigella flexneri se constituye en la cepa más frecuentemente aislada, se evidencia una leve disminución de la resistencia a Ampicilina y Cloramfenicol, y una progresión de la resistencia a Ácido Nalidíxico y Cotrimoxazol, sin cambios significativos en la resistencia a los Aminoglucósidos y las Quinolonas.

Normally present in water, soil and waste water, Acinetobacter baumannii has become an important nosocomial pathogen, as causal agent of pneumonias, septicemias and urinary tract infections, among other complications in compromised patients from hospital’s intensive care units. One of its last acquired abilities is the resistance to colistin (polymixin E), the last therapeutic option for its infections. In this thesis, descriptive and quantitative differential expression proteomics is used in the study of acquired colistin resistance. As result of this research, 1,097 proteins belonging to the Acinetobacter genus have been identified by combined application of bidimensional gel electrophoresis (2DE), differential gel electrophoresis (DIGE), and peptide labeling with stable isobaric isotopes tags (iTRAQ). Analyses have been performed on the global expressed proteome of a reference, colistin-sensible strain (A. baumannii ATCC 19606) and, for comparative purposes, on a derived strain on which colistin resistance has been induced in vitro. The resistant phenotype shows reduced fitness, with significant differences in expression found in outer membrane proteins, membrane active transporters, diverse metabolic enzymes (fatty acids, citrate, phenylacetate, piruvate and nitrogen), proteins involved in stress response and biofilm formation, as well as in protein synthesis and folding pathways. The work has allowed to assess the strengths and weaknesses of the different techniques currently used in this type of proteomic analysis. / Acinetobacter baumannii, normalmente aislado en suelos y aguas (corrientes o residuales), se ha convertido en importante patógeno nosocomial, siendo agente causal de, entre otras complicaciones, neumonías, septicemias e infecciones del tracto urinario de pacientes comprometidos en unidades hospitalarias de cuidados intensivos. La más reciente de sus capacidades adquiridas es la resistencia a colistina (polimixina E), antibiótico peptídico considerado la última opción terapéutica en contextos clínicos. Esta tesis doctoral emplea la proteómica descriptiva y de expresión diferencial cuantitativa para investigar la resistencia adquirida por A. baumannii a dicho antibiótico. Los resultados han supuesto la identificación de 1.097 proteínas de Acinetobacter mediante el empleo combinado de electroforesis bidimensional convencional (2DE), 2DE diferencial (DIGE) y marcaje peptídico mediante isótopos isobáricos estables (iTRAQ). Los análisis se han realizado en el proteoma expresado por una cepa de referencia sensible a colistina (A. baumannii ATCC 19606), así como en una cepa derivada de ésta en la que se ha inducido, a efectos comparativos, resistencia a colistina in vitro. El fenotipo resistente manifestó reducida adaptabilidad biológica, encontrándose las principales diferencias en la estructura de la membrana externa, en la expresión de transportadores activos de membrana, en diversos enzimas metabólicos (ácidos grasos, citrato, fenilacetato, piruvato, nitrógeno) y de respuesta a condiciones de estrés, así como en la expresión de proteínas participantes en la formación de biopelículas y en el proceso de síntesis y plegamiento de proteínas. Además, el trabajo ha permitido evaluar los puntos fuertes y débiles de las técnicas empleadas actualmente en este tipo de análisis proteómicos.

Introducción: Durante los XX últimos años, Acinetobacter baumannii se ha posicionado como una de las principales infecciones intrahospitalarias resistentes a antibióticos. A. baumannii multidrogoresistente (MDR) está considerado por la OMS dentro del grupo más crítico de resistencia. Uno de los mecanismos de resistencia identificados en dicho patógeno son las bombas de eflujo, por lo que, se han desarrollado inhibidores de las mismas, generando así menos resistencia por parte de las bacterias hacia los antibióticos. Objetivos: En nuestro estudio, el objetivo fue evaluar el efecto de la adición del inhibidor de bomba de eflujo CCCP sobre la actividad bactericida de imipenem y cefepime en cepas de A. baumannii Métodos: 49 cepas aisladas como A. baumannii fueron obtenidas en el Hospital Regional de Cajamarca. Mediante técnicas moleculares en el laboratorio de Biología Molecular de la Universidad Peruana de Ciencias Aplicadas (UPC) se confirmaron 47 cepas positivas para A. baumannii. Se utilizó PCR- en tiempo real para identificar el gen blaOXA-51-like y para la determinación de la CMI el método de microdilución en caldo. Finalmente se añadió el inhibidor CCCP para poder evaluar si efecto sobre los antibióticos Resultados: Un total de 49 cepas aisladas de A. baumannii fueron obtenidas en el Hospital Regional de Cajamarca. Se determinó la susceptibilidad antimicrobiana mediante la concentración mínima inhibitoria y la actividad de la bomba de eflujo fue evaluada usando CCCP. Conclusiones: Las bombas de eflujo puede jugar un rol importante en la resistencia antibiótica de A. baumannii. El inhibidor CCCP junto a imipenem y cefepime, mejora la sensibilidad antibiótica. Asimismo, nuevas estrategias terapéuticas son requeridas para eliminar el transporte de eflujo de las cepas resistentes que causan infecciones nosocomiales / Introduction: In the last years the rapid expansion of multidrug-resistant A. baumannii strains have become a major health problem. Efflux pumps are a group of transport proteins that contribute to the development of antibiotic resistance. The aim of this study was to evaluate the effect of the efflux pump inhibitor carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) on the antimicrobial action of imipenem and cefepime on clinical strains of A. baumannii. Materials and methods: A total of 49 non-duplicate clinical samples were collected during January through December of 2018 from patients hospitalized in the Hospital Regional Docente de Cajamarca. Of the 49 samples obtained, the confirmatory identification of A. baumannii was performed on 47 samples by molecular methods. The amplification of the blaOXA-51-like gene was carried out by polymerase chain reaction (PCR). The determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) was calculated using the microdilution method in culture broth. The susceptibility to both antibiotics (cefepime and imipenem) was evaluated in the presence and absence of the inhibitor carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP). Results: A total of 47 strains of A. baumannii were isolated: 97.87% (46/47) were resistant to Imipenem, 2.13% (1/47) of them were classified as intermediate and none of these strains were susceptible. On the other hand, 51.06% (24/47) of isolates were resistant to cefepime; 19.15% (9/47) intermediate and 29.79% (14/47) susceptible. We considered a significant difference in antibiotic susceptibility if the MIC changed at least 4 dilutions, after the addition of the inhibitor. In the case of CCCP in addition to imipenem, 2.1% (1/47) had a significant change of 4 or more reductions in MIC, 59.6% (28/47) achieved a change equal or less than 3 dilutions and 17.0% (8/47) did not have any change. In the case of CCCP with cefepime the percentage of strains with the significant change of MIC was 8.5% (4/47). On the other hand, 53.2% (24/47) presented a reduction equal or less than 3 dilutions and 12.8% (6/47) did not show changes. Conclusion: In conclusion, our results demonstrate that the use of CCCP may improve the antibiotic effect of imipenem and cefepime on clinical strains of A. baumannii. The relevance of this study is that it provides evidence that this efflux pump inhibitor may be an alternative treatment against multidrug-resistant A. baumannii. / Tesis

OBJETIVO: Establecer la contribución de los integrones de clase 1 a la resistencia antibiótica en aislados clínicos de enterobacterias de dos contextos epidemiológicos: zoonosis por Salmonella enterica e infección por Klebsiella pneumoniae resistente a amoxicilina/clavulánico (ACL) adquirida en un centro sociosanitario. AISLADOS: Se estudiaron (a) 92 aislados humanos de Salmonella enterica serotipo Typhimurium (ST) recuperados entre 2004 y 2006 en el laboratorio de microbiología del Hospital Verge de la Cinta de Tortosa (35 aislados adicionales de una colección de 2000-2001 para estudios de epidemiología molecular) y 382 aislados de S. enterica de otros serotipos (SNT) recuperados en ese laboratorio en 2001 y entre 2004 y 2009 (b) 45 aislados de K. pneumoniae resistentes a ACL y sensibles a cefazolina y dos resistentes a ACL con fenotipo sugestivo de AmpC plasmídica y resistencia transferible a quinolonas recuperados entre 2006 y 2008 de muestras clínicas de pacientes de un centro sociosanitario de la región sanitaria Terres de l’Ebre. RESULTADOS: (a) Salmonella enterica: El 77,2% de los aislados de ST y el 16,5% de los de SNT fueron resistentes a más de dos familias de antibióticos (MDR). El 3,3% de los aislados de ST y el 41% de los de SNT fueron resistentes a ácido nalidíxico y sólo se constató resistencia a ciprofloxacino en tres aislados de S. Kentucky. Las β-lactamasas presentes en los aislados de ST resistentes a amoxicilina (60,9%) fueron OXA-1 (52%), TEM-1 (32%) y PSE-1 (18,7%) y en los aislados resistentes de SNT (24,3%) TEM-1 (90,3%), CTX-M-9 (1 aislado de S. Virchow y 1 aislado de S. Grumpensis qnrA1 positivo), CTX-M-15 (1 aislado de S. Kapemba) y DHA-1 (1 aislado de S. Newport qnrB4 positivo); ésta es la primera descripción de β-lactamasas de espectro extendido en S. Kapemba y S. Grumpensis. 56 aislados de ST y 35 de SNT, todos excepto uno MDR, poseían integrones de clase 1. En ST los aislados predominantes fueron los que albergaban el integrón de región variable (RV) blaOXA-1-aadA1, cuya frecuencia superaba la registrada para el conjunto de España, seguidos de los aislados con el perfil de integrones aadA2 + blaPSE-1 típico de la presencia de SGI1; la mayoría de aislados con uno u otro perfil de integrones estaban relacionados clonalmente. En SNT se identificaron 11 tipos de integrones en 15 serotipos distintos (incluidos S. Kapemba, S. Mikawasima y S. ser [9,12:Iv:i:-] en los que no se habían descrito previamente), siendo los de RV dfrA1-aadA1, dfrA17-aadA5 y dfrA12-orf-aadA2 los presentes en mayor número de serotipos; en los dos aislados blaCTX-M-9 positivos, este gen estaba ubicado en un integrón complejo cuya RV 1 fue dfrA16-aadA2 en S. Virchow y aadB-aadA2 en S. Grumpnesis. Se detectaron dos variantes de integrones atípicos asociados a sul3: dfrA12-orF-aadA2-cmlA-aad1 (5 aislados de ST y 4 de S. Enteritidis) y estX-psp (2 S. Grumpensis). Este último integrón y el de RV aadA13-sat, también identificado en S. Grumpensis, no se habían descrito anteriormente en S. enterica. (b) Klebsiella pneumoniae centro socio-sanitario: Todos los aislados resistentes a ACL y sensibles a cefazolina producían una penicilinasa resistente a inhibidores, IRT-11 (n=19) u OXA-1 (n=26). Los aislados productores de IRT-11 se agrupaban en tres clones y sólo uno portaba un integrón de clase 1 (RV dfrA12-orf-aadA2); este es el segundo caso comunicado de brote nosocomial por producción de un enzima IRT. Todos los aislados productores de OXA-1 eran MDR y 23 de ellos acarreaban un integrón de clase 1, transferible por conjugación y asociado a qnrS2, de RV [aac (6’)-1b-cr- blaOXA1-catB3-arr3], que en tres aislados era defectivo en 3’. Los aislados se agrupaban en tres clones diferentes según poseyesen integrones de clase 1 convencionales, defectivos o no presentaran integrones. Un integrón de idéntica RV y vinculado a blaDHA-1 y qnrB4 en un integrón complejo de nueva estructura (Genbank GU906294) muy semejante a In37 y del que se diferenciaba por haber sufrido la deleción, por la inserción de IS26, de la región comprendida entre la primera copia de 3’CS y qnrB4, se detectó en otros dos aislados MDR de K. pneumoniae, indistinguibles genéticamente y qnrS2 positivos. / The aim of this work was to assess the contribution of class 1 integrons to antimicrobial resistance in clinical isolates of Enterobacteriaceae of human origin from two epidemiological settings: zoonosis caused by Salmonella enterica and infection due to amoxicillin-clavulanate(ACL)-resistant Klebsiella pneumoniae acquired in a chronic care center. RESULTS: (a) S. Typhimurium: 71 of the 92 isolates recovered from 2004 to 2006 at the microbiology laboratory of Hospital Verge de la Cinta (Tortosa. Catalonia. Spain) were multidrug-resistant (MDR), of which 56 carried class 1 integrons. Isolates bearing the blaOXA-1-aadA1 variable region integron were the commonest among this serovar, showing a higher frequency than that reported in other areas of Spain, followed by isolates exhibiting the integron profile typical of SGI1 (aadA2 + blaPSE-1); most isolates displaying any of these two integron profiles shared identical genotype. Five isolates possessed a sul3-associated class 1 integron whose structure was 5’CS–dfrA12–orfF–aadA2–cmlA1–aadA1–qacH–IS440–sul3. (b) Non-Typhimurium S. enterica: 16.5% of the 382 isolates recovered in 2001 and from 2004-2009 at the same laboratory were MDR and 35 carried class 1 integrons. Overall, 11 different class 1 integrons were identified in 15 distinct serotypes (including S. Kapemba, S. Mikawasima and S. ser [9,12:Iv:i:-], where they had not been previously described), being those with dfrA1-aadA1, dfrA17-aadA5 and dfrA12-orf-aadA2 variable regions the most widely distributed. Two isolates (one qnrA1 positive S. Grumpensis and one S. Virchow) bore a complex class 1 integron linked to blaCTX-M-9 and 4 S. Enteritidis and 2 S. Rissen carried atypical sul3-type integrons (5’CS–dfrA12–orfF–aadA2–cmlA1–aadA1–qacH–IS440–sul3 and 5’CS–estX-psp-IS440–sul3, respectively). The former integron and the aadA13-sat one, detected in S. Grumpensis, had never been reported before in S. enterica. (c) Klebsiella pneumoniae: 47 ACL-resistant (45 cefazolin-susceptible and 2 broad-spectrum-cephalosporin-resistant) isolates, recovered between 2006 and 2008 from patients attending a chronic care center, were investigated. All cefazolin-susceptible isolates produced an inhibitor-resistant penicillinase, IRT 11 (n= 19) or OXA-1 (n=26); 23 OXA-1-producing isolates harboured a class 1 integron, associated with qnrS2, with the aac(6’)- Ib-cr, blaOXA-1, catB3, arr3 cassette arrangement (in 3 cases the integron was defective in 3’ end). An integron with identical structure, linked to blaDHA-1 and qnrB4 within an In37-like complex class 1 integron of novel structure (Genbank GU906294), was found in two epidemiologically closely related qnrS2 positive isolates.

[ES] Las bacterias resistentes a múltiples antibióticos, como el Enterococo resistente a vancomicina (ERV), son un problema creciente en los pacientes hospitalizados, por lo que se necesita estrategias alternativas para combatir estos patógenos. Las infecciones causadas por ERV suelen comenzar con la colonización del tracto intestinal, un paso crucial que se afectado por la presencia de la microbiota. Sin embargo, los antibióticos alteran la microbiota y esto promueve la colonización de ERV. Una vez que el patógeno ha colonizado el intestino, alcanza niveles muy altos pudiendo diseminar a otros órganos y pacientes. A pesar de su importancia, se sabe muy poco sobre los genes que codifica para colonizar el intestino y sobre el mecanismo por el cual la microbiota suprime su colonización intestinal, siendo los dos objetivos principales. En primer lugar hemos utilizado una metodología previamente descrita (Zhang et al., 2017, BMC Genomics), basada en la generación de una librería de mutantes por transposición junto a secuenciación masiva, con el fin de identificar los genes codificados por ERV necesarios para la colonización del intestino en ratones. Además, hemos realizado análisis metatranscriptómicos para identificar aquellos genes más expresados. El análisis ha identificado genes cuya interrupción reduce significativamente la colonización intestinal en el intestino grueso. Los genes que más afectaron a la colonización codifican proteínas relacionadas con la absorción o el transporte de diversos nutrientes como los carbohidratos (subunidad EIIAB del transportador PTS de manosa, el regulador transcripcional de la familia LacI, ácido N-acetilmurámico 6-fosfato eterasa) o iones (proteína transportadora dependiente de ATP (ABC) y proteínas del grupo [Fe-S]). El papel de estos genes en la colonización se ha confirmado mediante experimentos de mutagénesis directa y de competición con la cepa salvaje. Además, estos genes afectan a la colonización intestinal con diferentes antibióticos (clindamicina y vancomicina). Para identificar el mecanismo molecular por el cual cada gen afecta a la colonización, hemos realizado experimentos in vitro y ex vivo además del análisis transcriptómico. Los experimentos in vitro confirman que las proteínas del grupo [Fe-S] están involucradas en el transporte iones de hierro, principalmente Fe3+. Por otra parte, los genes de la subunidad EIIAB del transportador de manosa y del ácido N-acetilmurámico 6-fosfato eterasa son necesarios para la utilización de la manosa y el ácido N-acetilmurámico, respectivamente, azúcares que suelen estar presentes en el intestino. También confirmamos que el regulador transcripcional de la familia LacI es un represor que afecta a proteínas transportadoras ABC, probablemente implicadas en la absorción de carbohidratos. Además, algunos de estos genes están codificados principalmente por cepas clínicas de E. faecium y en menor medida por cepas comensales. En segundo lugar, estudiamos los mecanismos de protección de un consorcio de cinco bacterias comensales, que anteriormente se había demostrado que disminuían la colonización intestinal por ERV en ratones. Mediante transcriptómica, metabolómica y los ensayos in vivo observamos que el consorcio bacteriano inhibe el crecimiento de ERV mediante la reducción de nutrientes, concretamente fructosa. Por último, el análisis ARN-Seq in vivo de cada aislado en combinación con los ensayos ex vivo e in vivo demostraron que una sola bacteria (Olsenella sp.) proporciona protección. En conjunto, los resultados obtenidos han identificado la función de genes específicos requeridos por ERV para colonizar el intestino. Además, hemos identificado un mecanismo mediante el cual la microbiota confiere protección. Estos resultados podrían conducir a nuevos enfoques terapéuticos para prevenir las infecciones causadas por este patógeno multiresistente a los antibióticos. / [CA] Els bacteris resistents a múltiples antibiòtics, com el Enterococo resistent a vancomicina (ERV), són un problema creixent en els pacients hospitalitzats, que són resistents a la majoria d'antibiòtics disponibles per la qual cosa es necessita estratègies alternatives per a combatre aquests patògens. Les infeccions causades per ERV solen començar amb la colonització del tracte intestinal, un pas crucial que es veu afectat per la presència de la microbiota. No obstant això, els antibiòtics alteren la microbiota i això promou la colonització de ERV. Una vegada que el patogen ha colonitzat l'intestí, aconsegueix nivells molt alts podent disseminar a altres òrgans i pacients. Malgrat la seua importància, se sap molt poc sobre els gens que codifica ERV per a colonitzar l'intestí i sobre el mecanisme pel qual la microbiota suprimeix la seua colonització intestinal. En primer lloc hem utilitzat una metodologia prèviament descrita (Zhang et al., 2017, BMC Genomics), basada en la generació d'una llibreria de mutants per transposició junt amb seqüenciació massiva, amb la finalitat d'identificar els gens codificats per ERV necessaris per a la colonització de l'intestí en ratolins. A més a més, hem realitzat anàlisi metatranscriptòmics per a identificar aquells gens més expressats. L'anàlisi ha identificat gens quina interrupció redueix significativament la colonització intestinal en l'intestí gros. Els gens que més van afectar la colonització codifiquen proteïnes relacionades amb l'absorció o el transport de diversos nutrients com els carbohidrats (subunitat EIIAB del transportador PTS de manosa, el regulador transcripcional de la família LacI, àcid N-acetilmuràmic 6-fosfat eterasa) o ions (proteïna transportadora dependent d'ATP (ABC) i proteïnes del grup [Fe-S]). El paper d'aquests gens en la colonització s'ha confirmat mitjançant experiments de mutagènesis directa i de competició amb el cep salvatge. A més, aquests gens afecten la colonització intestinal amb diferents antibiòtics (clindamicina i vancomicina). Per a identificar el mecanisme molecular pel qual cada gen afecta a la colonització, hem realitzat experiments in vitro i ex viu a més de l'anàlisi transcriptòmic. Els experiments in vitro confirmen que les proteïnes del grup [Fe-S] estan involucrades en el transport d'ions de ferro, principalment Fe3+. D'altra banda, els gens de la subunitat EIIAB del transportador PTS de manosa i de l'àcid N-acetilmuràmic 6-fosfat eterasa són necessaris per a la utilització de la manosa i l'àcid N-acetilmuràmic, respectivament, sucres que solen estar presents en l'intestí. També confirmem que el regulador transcripcional de la família LacI és un repressor que afecta proteïnes transportadores ABC, probablement implicades en l'absorció de carbohidrats. A més a més, alguns d'aquests gens estan codificats principalment per ceps clínics de E. faecium i en menor mesura per ceps comensals. En segon lloc, estudiem els mecanismes de protecció d'un consorci de cinc bacteris comensals, que adès s'havia demostrat que disminuïen la colonització intestinal per ERV en ratolins. Amb l'ús de transcriptòmica, metabolòmica i els assajos in vivo observem que el consorci bacterià inhibeix el creixement de ERV mitjançant la reducció de nutrients, concretament fructosa. Finalment, l'anàlisi ARN-Seq in vivo de cada aïllat en combinació amb els assajos ex viu i in vivo van demostrar que un sol bacteri (Olsenella sp.) proporciona protecció. En conjunt, els resultats obtinguts han identificat la funció de gens específics requerits per ERV per a colonitzar l'intestí. A més, hem identificat un mecanisme mitjançant el qual la microbiota confereix protecció. Aquests resultats podrien conduir a nous enfocaments terapèutics per a previndre les infeccions causades per aquest patogen multiresistent als antibiòtics. / [EN] Multidrug-resistant bacteria, such as vancomycin-resistant-Enterococcus (VRE), are an increasing problem in hospitalized patients. Some VRE strains can be resistant to most available antibiotics, thus, alternative strategies to antibiotics are urgently needed to combat these challenging pathogens. Infections caused by VRE frequently start by colonization of the intestinal tract, a crucial step that is impaired by the presence of the intestinal microbiota. Administration of antibiotics disrupts the microbiota, which promotes VRE intestinal colonization. Once VRE has colonized the gut, it reaches very high levels, which promotes its dissemination to other organs and its transfer to other patients. Despite the relevance of VRE gut colonization, very little is known about the genes encoded by this pathogen to colonize the gut and about the mechanisms by which the microbiota suppresses VRE gut colonization. In this thesis, we have utilized a previously described methodology (Zhang et al., 2017, BMC Genomics), based on the generation of a transposon mutant library coupled with high-throughput sequencing, in order to identify VRE encoded genes required for colonization of the mouse intestinal tract. In addition, we have performed metatranscriptomic analysis in mice to identify VRE genes specifically expressed in the gut. Our analysis has identified genes whose disruption significantly reduces VRE gut colonization in the large intestine. The genes that most affected VRE gut colonization encoded for proteins related to the uptake or transport of diverse nutrients such as carbohydrates (PTS mannose transporter subunit EIIAB, LacI family DNA-binding transcriptional regulator, N-acetylmuramic acid 6-phosphate etherase) or ions (phosphate ABC transporter ATP-binding protein and proteins from [Fe-S] cluster). The role of these genes in gut colonization has been confirmed through targeted mutagenesis and competition experiments against a wild type strain. Moreover, these genes affect gut colonization under different antibiotic treatments (clindamycin and vancomycin). To elucidate the mechanism by which each gene influences gut colonization, we have performed in vitro and ex vivo experiments besides transcriptomic analysis. In vitro experiments confirm that proteins from [Fe-S] cluster are involved in the transport of different forms of iron ions, mostly Fe3+. On the other hand, the PTS mannose transporter subunit EIIAB and N-acetylmuramic acid 6-phosphate etherase genes are required for the utilization of mannose and N-acetyl-muramic acid, respectively, sugars that are usually present in the intestinal environment. We have also confirmed that LacI family DNA-binding transcriptional regulator is a repressor that affects the expression of genes encoding for an ABC transporter probably involved in the uptake of carbohydrates. Furthermore, we have confirmed that some of these genes are encoded mainly by E. faecium clinical strains but not or to a lower extent by commensal strains. Secondly, we studied the mechanisms of protection of a consortium of five commensals bacteria, previously shown to restrict VRE gut colonization in mice. Functional transcriptomics in combination with targeted metabolomics and in vivo assays performed in this thesis indicated that the bacterial consortium inhibits VRE growth through nutrient depletion, specifically by reducing the levels of fructose. Finally, in vivo RNA-Seq analysis of each bacterial isolate of the consortium in combination with ex vivo and in vivo assays demonstrated that a single bacterium (Olsenella sp.) could recapitulate the protective effect. Altogether, the results obtained have identified the function of specific genes required by VRE to colonize the gut. In addition, we have identified a specific mechanism by which the microbiota confers protection against VRE colonization. These results could lead to novel therapeutic approaches to prevent infections caused by this pathogen. / Flor Duro, A. (2021). Characterization of Genes and Functions Required by Multidrug-resistant Enterococci to Colonize the Intestine [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/166494 / TESIS

[ES] El mundo se enfrenta a una profunda crisis asociada al agua y la reutilización de aguas residuales urbanas (UWW), especialmente en agricultura, se presenta como una posible solución para abordar este problema. No obstante, la reutilización se debe promover dentro de unos límites mínimos de calidad del agua, los cuales pueden alcanzarse mediante la implementación de eficientes tratamientos terciaros en las actuales plantas de tratamiento de aguas residuales urbanas. En las últimas décadas, los Procesos de Oxidación Avanzada (POA), basados en la generación de especies reactivas del oxígeno altamente oxidantes y no selectivas, se han planteado como alternativa a los tratamientos convencionales para desinfección y descontaminación de agua residual. El objetivo general de este estudio es, por tanto, la evaluación de nuevos POA para desinfección y descontaminación simultánea de agua, investigando: (i) fotocatálisis heterogénea solar con ZnO modificado (Ce, Yb y Fe) y TiO2-P25 de referencia, (ii) peroximonosulfato (PMS) bajo radiación solar natural (PMS/Solar), (iii) POA basados en radical sulfato utilizando PMS y radiación UV-C (PMS/UV-C) y (iv) combinación de ZnO modificado con PMS como estrategia de tratamiento. Los objetivos biológicos y químicos analizados en este estudio fueron: tres patógenos de impacto en salud humana (dos bacterias gram-negativas Escherichia coli, Pseudomonas spp y una gram-positiva Enterococcus spp) y tres Contaminantes de Preocupación Emergente (CE) (Diclofenaco-DCF, Sulfametoxazol-SMX y Trimetoprim-TMP). La fotoactividad de ZnO modificado con Ce, Yb o Fe se evaluó a escala de laboratorio (200 mL), obteniendo buenas cinéticas de inactivación bacteriana y degradación de CE. El ZnO-Ce mostró el mejor rendimiento, no obstante, se descartó el escalado de este proceso tanto su aplicación directa, considerando su similar eficiencia en comparación con TiO2-P25 y por el alto coste del tratamiento, como en combinación con PMS, por la la liberación de Zn2+ al agua tratada. El uso directo de PMS como agente oxidante para el tratamiento de agua y UWW se ha demostrado en este estudio, aumentado su eficiencia al ser el sistema irradiado tanto con lámparas UV-C como con luz solar natural. Se han postulado diferentes mecanismos de inactivación y degradación de CE para cada tipo de irradiación: activación de PMS para generar radicales (con fotones UV-C) y la no activación o mecanismo de oxidación directo (con luz solar natural). La capacidad de los procesos PMS/Solar y PMS/UV-C se evaluó en UWW a escala de planta piloto en un Colector Parabólico Compuesto (10 L) y en una planta piloto de UV-C (80 L), respectivamente. El mejor rendimiento de tratamiento se alcanzó con una concentración de PMS de 1 mM en ambos casos, logrando una inactivación exitosa de todos los objetivos microbianos (incluyendo bacterias resistentes a antibióticos), sin observar recrecimiento bacteriano tras 48 h y eliminando de manera eficiente los CE. Por otro lado, la eliminación eficiente de genes de resistentes a antibióticos y productos de transformación se obtuvo con PMS/UV-C, mientras que éstos parámetros siguen siendo un reto a abordar en el caso del proceso PMS/Solar. En ningún caso se observó toxicidad del agua tratada para Aliivibrio fischeri, excluyendo un efecto nocivo para el medio ambiente receptor del efluente, y solo un leve efecto fitotóxico en el crecimiento de dos de las tres semillas analizadas (L. sativum y S. alba), indicando la idoneidad del efluente para su reutilización en riego. Finalmente, el análisis de costes demostró que este factor clave podría ser una barrera importante para la implementación del proceso PMS/Solar en plantas centralizadas de tratamiento de UWW. No obstante, su consideración como sistemas descentralizados asociados a pequeños volúmenes de agua en zonas con alta incidencia de radiación solar, ahorrando costes energéticos mediante el aprovechamiento de la luz solar, podría ser una opción real y asequible. / [CA] El món s'enfronta a una profunda crisi associada a l'aigua i la reutilització d'aigües residuals urbanes (UWW), especialment en agricultura, es presenta com una possible solució per a abordar aquest problema. No obstant això, la reutilització s'ha de promoure dins d'uns límits mínims de qualitat de l'aigua, els quals poden aconseguir-se mitjançant la implementació d'eficients tractaments terciaris en les actuals plantes de tractament d'aigües residuals urbanes. En les últimes dècades, els Processos Avançats d'Oxidació (PAO), basats en la generació d'espècies reactives d'oxigen altament oxidants i no selectives, s'han plantejat com a alternativa als tractaments convencionals per a desinfecció i descontaminació d'aigua residual. L'objectiu general d'aquest estudi és, per tant, l'avaluació de nous POA per a desinfecció i descontaminació simultània d'aigua, investigant: (i) fotocatàlisi heterogènia solar amb ZnO modificat (Ce, Yb i Fe) i TiO2-P25 de referència, (ii) peroximonosulfat (PMS) baix radiació solar natural (PMS/Solar), (iii) POA basats en radical sulfat utilitzant PMS i radiació UV-C (PMS/UV-C) i (iv) combinació de ZnO modificat amb PMS com a estratègia de tractament. Els objectius biològics i químics analitzats en aquest estudi van ser: tres patògens d'impacte en salut humana (dos bacteris gram-negatius Escherichia coli, Pseudomonas spp i un gram-positiu Enterococcus spp) i tres Contaminants de Preocupació Emergent (CE) (Diclofenac-DCF, Sulfametoxazol-SMX i Trimetoprim-TMP). La fotoactivitat de ZnO modificat amb Ce, Yb o Fe es va avaluar a escala de laboratori (200 mL), obtenint bones cinètiques d'inactivació bacteriana i degradació de CE. El ZnO-Ce va mostrar el millor rendiment, no obstant això, es va descartar l'escalat d'aquest procés tant mitançant la seua aplicació directa o com en combinació amb PMS, considerant la seua similar eficiència en comparació amb TiO2-P25, l'alt cost del tractament i l'alliberament de Zn2+ a l'aigua tractada. L'ús directe de PMS com a agent oxidant per al tractament d'aigua i UWW s'ha demostrat en aquest estudi, augmentat la seua eficiència quan el sistema és irradiat tant amb llums UV-C com amb llum solar natural. S'han postulat diferents mecanismes d'inactivació i degradació de CE per a cada tipus d'irradiació: activació de PMS per a generar radicals (amb fotons UV-C) i la no activació o mecanisme d'oxidació directe (amb llum solar natural). La capacitat dels processos PMS/Solar i PMS/UV-C es va avaluar en UWW a escala de planta pilot en un Col·lector Parabòlic Compost (10 L) i en una planta pilot d'UV-C (80 L), respectivament. El millor rendiment de tractament es va aconseguir amb una concentració de PMS d'1 mm en tots dos casos, aconseguint una inactivació reeixida de tots els objectius microbians (incloent bacteris resistents a antibiòtics), sense observar recreixement bacterià després de 48 h i eliminant de manera eficient els CE. D'altra banda, l'eliminació eficient de gens de resistents a antibiòtics i productes de transformació es va obtindre amb PMS/UV-C, mentre que aquests paràmetres continuen sent un repte a abordar en el cas del procés PMS/Solar. En cap cas es va observar toxicitat a l'aigua tractada per a Aliivibrio fischeri, excloent un efecte nociu per al medi ambient receptor de l'efluent, i només un lleu efecte fitotòxic en el creixement de dos de les tres llavors analitzades (L. sativum i S. alba), indicant la idoneïtat de l'efluent per a la seua reutilització en reg. Finalment, l'anàlisi de costos va demostrar que aquest factor clau podria ser una barrera important per a la implementació del procés PMS/Solar en plantes centralitzades de tractament de UWW. No obstant això, la seua consideració com a sistemes descentralitzats associats a xicotets volums d'aigua en zones amb alta incidència de radiació solar, estalviant costos energètics mitjançant l'aprofitament de la llum solar, podria ser una opció real i assequible. / [EN] It is well recognized that the world is facing a water crisis and the reuse of urban wastewater (UWW) in agriculture, has been gaining attention as a reliable solution to address this problem. It is mandatory to promote the safe water reuse and minimum water quality limits could be achieved by upgrading the Urban Wastewater Treatment Plants, through the addition of an efficient tertiary treatment. In the last decades, Advanced Oxidation Processes (AOPs), relying on the potential generation of highly oxidant, reactive and non-selective Reactive Oxygen Species (ROS), have been raised as alternative to conventional treatments for both water disinfection and decontamination. The general aim of this study is the assessment of novel AOPs for the simultaneous disinfection and decontamination of water, investigating (i) solar heterogeneous photocatalysis, involving modified ZnO with Ce, Yb and Fe and the benchmark TiO2-P25, (ii) peroxymonosulfate (PMS) under natural solar radiation (PMS/Solar), (iii) Sulfate radical-based AOPs (SR-AOPs) involving PMS and UV-C radiation (PMS/UV-C) and (iv) combination of the best-performing photocatalytic material with PMS (PMS/modified ZnO). The involved biological and chemical targets in this study were: three human health impact pathogens (two gram-negative bacteria Escherichia coli, Pseudomonas spp. and the gram-positive Enterococcus spp.) and three Contaminants of Emerging Concern (CECs, Diclofenac-DCF, Sulfamethoxazole-SMX and Trimethoprim-TMP). Photoactivity of modified ZnO with Ce, Yb or Fe was assessed in 200-mL vessel reactors, attaining good target's removal kinetic rates. Best performing material was ZnO-Ce, but its feasibility for a further up-scaling was discarded both as photocatalyst alone, considering the similar performances obtained, compared to TiO2-P25 and the high treatment cost, and in combination with PMS, due to the release of high amount of Zn2+. PMS alone has been proven to be an effective oxidant agent for water and UWW treatment, increasing its effectiveness when illuminated with photons from UV-C lamps and natural sunlight. Nevertheless, different inactivation and CECs degradation mechanisms have been postulated for each type of irradiation, and according to the activation of PMS (with UV-C photons) or non-activation (under natural sunlight). The capability of PMS/Solar and PMS/UV-C processes were evaluated in actual UWW at pilot plant scale in 10-L Compound Parabolic Collector and in 80L UV-C pilot plant, respectively. Optimal load of PMS was found to be 1 mM in both cases, achieving successful inactivation of natural occurring bacteria and their antibiotic resistant counterparts, without observing bacterial regrowth after 48h and efficiently eliminating CECs. Efficient removal of antibiotic resistant genes (ARGs) and transformation products (TPs) was obtained by PMS/UV-C, while their elimination is still a challenge to be addressed in PMS/Solar process. Reclaimed UWW obtained by both PMS/Solar and PMS/UV-C process showed no toxicity towards Aliivibrio fischeri, excluding a harmful effect towards the receiving aquatic environment after effluent discharge, and a very slightly phytotoxic effect for growth of two out of the three tested seeds (L. sativum and S. alba), indicating the suitability of this water for its subsequent reuse for agriculture. The analysis of the treatment cost revealed that this key factor could be an important barrier for implementation of PMS/Solar process in large centralized UWW treatment plants. Nevertheless, its consideration as decentralized systems associated to small volume of water in areas with a high solar radiation incidence, saving energy costs by using natural solar radiation, could be a real and affordable option. / Berruti, I. (2022). Assessment of novel Advanced Oxidation Processes for the Simultaneous Disinfection and Decontamination of Water [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/183052 / TESIS