Os tumores da cérvice-uterina, que representam uma das principais doenças ginecológicas em mulheres na idade reprodutiva em todo o mundo, estão etiologicamente associados com a infecção pelo papilomavírus humano (HPV). A progressão de uma lesão intraepitelial escamosa de baixo-grau (LSIL) a um carcinoma invasivo de cérvix uterina está acompanhada da degradação da matriz extracelular (MEC) devido à ação progressiva das metaloproteinases de matriz (MMP-2, MMP-9 e MMP-14) no processo de invasão e metástase. Entretanto, o balanço entre as MMPs e seus reguladores como RECK e TIMPs é necessário para controlar esta invasão. O objetivo deste projeto consiste em avaliar a atividade e a expressão das metaloproteinases 2, 9, e 14, e caracterizar a expressão do gene supressor de metástase RECK e do inibidor tecidual de metaloproteinases (TIMP-2), em modelo de queratinócitos humanos infectados com retrovírus recombinantes que expressam os oncogenes E6 e/ou E7 de HPV 16, em culturas cultivadas em monocamada e organotípicas. Para isso, utilizamos ensaios de real-time PCR, zimografia, western blot, imunocitoquímica, ensaio de ELISA e imunohistoquímica. Em culturas em monocamada observamos que as células que expressam as oncoproteínas E6E7 de HPV16 apresentaram menores níveis protéicos de RECK e TIMP-2 em relação ao controle pXLSN. Quando analisamos as culturas organotípicas, também observamos esta diminuição dos níveis de RNAm e protéicos de RECK em rafts que expressam E6E7, acompanhado pelo aumento da atividade de MMP-9, em relação ao controle. Também observamos que o tratamento das culturas com a citocina TNF aumenta a expressão gênica, protéica e atividade de MMP-9 em todas as linhagens analisadas. Além disso, os oncogenes E6 e/ou E7 não afetam a expressão e/ou atividade de MMP-2, MT1-MMP. Nossos dados demonstraram que a expressão das oncoproteínas E6E7 de HPV16 estão relacionadas com o desequilíbrio entre MMPS e seus inibidores, sugerindo que em uma fase pré-invasiva do carcinoma cervical, não somente as MMPs, mas, principalmente seus inibidores são críticos para início da progressão tumoral. / Cervical cancer is etiologically associated with to high-risk human papillomavirus (HPV) infection. It has been observed that matrix metalloproteinases (MMPs) -2, -9, and MT1-MMP are required for basement membrane degradation during cervical carcinoma progression. Moreover, a counterbalancing among MMPs and their regulators, such as TIMPs and RECK, is necessary to modulate invasion. In order to study the effect of HPV oncogenes on MMPs expression, primary human keratinocytes (PHKs) were infected with recombinant retroviruses expressing wild-type HPV16 E6 and/or E7 oncogenes and were used to seed monolayers and organotypic cultures. Quantitative real-time PCR (Q-PCR), western blot, zimography, immunocitochemistry, ELISA assay and immunohistochemistry were used to determine the expression level and activity of MMP-2, MMP-9, MT1-MMP and their inhibitors RECK and TIMP-2. We observed that cultures expressing E6E7 presented lower RECK and TIMP-2 protein levels than control keratinocytes. In addition, rafts cultures presented the same lower RECK levels additionally presenting higher MMP-9 activity than control. Furthermore, we observed that expression of E6 and/or E7 proteins do not affect MMP-2 and MT1-MMP protein levels and/or activity. We also observed that TNF treatment enhance the MMP-9 gene and protein expression and activity in all studied cell lines. Taken together, our results demonstrate that HPV16E6E7 expression is related with the unbalance between MMPs and their inhibitors, suggesting that in the initial steps of HPV-related cervical disease, not only MMPs but also RECK and TIMP-2 are critical for tumor progression.

A infecção por HPV de alto risco é considerada um dos principais fatores de risco para o desenvolvimento do carcinoma do colo uterino, um das neoplasias mais freqüentes em mulheres de todo o mundo. As oncoproteínas E6 e E7 de HPV-16 são capazes de induzir a degradação dos genes supressores de tumor p53 e pRb, respectivamente. Mais do que isso, a expressão dessas oncoproteínas está relacionada a alterações na via de PI3K/AKT/mTOR. A proteína quinase mTOR apresenta importante papel no controle da tradução de proteínas e é considerada o principal mediador entre crescimento celular e proliferação. A ativação de mTOR é correlacionada à fosforilação das proteínas eIF4G1 e 4EBP1, aumentando assim a taxa de síntese de proteínas. A Rapamicina é um inibidor específico de mTOR e seus análogos apresentam potente atividade antiproliferativa em um grande número de células tumorais e tumores gerados em animais. Uma vez que as proteínas E6 e E7 são capazes de interagir com diversas proteínas da via que controla a atividade de mTOR optamos por investigar o efeito da rapamicina na proliferação de culturas organotípicas de queratinócitos expressando esses genes. Também avaliamos o efeito dos genes E6 e E7 na atividade de mTOR após o tratamento com essa droga. Para geração de culturas organotípicas de queratinócitos infectamos essas células com vetores retrovirais recombinantes contendo os genes E6 e E7 de HPV-16 em conjunto ou separadamente. Nós também avaliamos o papel da degradação de p53 e pRb na resposta à rapamicina através da utilização de mutantes de E6 e E7 incapazes de induzir a degradação dessas proteínas celulares. Após a infecção dos queratinócitos, os mesmos foram semeados em uma matriz de colágeno. Após 6 dias as culturas foram tratadas com 100ng/ml de rapamicina e permaneceram 60h em contato com a droga. Para análise por imunohistoquímica os tecidos foram fixados em formalina tamponada e emblocados em parafina. A reação de imunohistoquímica foi realizada utilizando os anticorpos contra BrdU, p-4EBP1 (ser 65), p-eIF4G1 (ser 1188) e pAKT (ser 473). Os resultados obtidos ilustram que a rapamicina apresenta efeito antiproliferativo em culturas de queratinócitos contendo o vetor vazio. Por outro lado, culturas contendo o gene E7 são resistentes ao efeito antiproliferativo dessa droga. Essa resistência parece estar relacionada à capacidade de E7 induzir a degradação da proteína pRb, uma vez que em queratinócitos expressando o mutante de E7, incapaz de induzir a degradação dessa proteína, não foi observada resistência. Além disso, a fosforilação de eIF4G e 4EBP1 indica que a expressão de E7 impede que a rapamicina seja capaz de inibir a atividade de mTOR. Esses resultados mostram, pela primeira vez, que o efeito antiproliferativo da rapamicina pode ser superado pela expressão de uma proteína viral, no caso a proteína E7 de HPV-16. / High-risk HPV infection has a major etiologic role in development and progression of cervical cancer, one of the most frequent forms of cancer among women worldwide. HPV-16 E6 and E7 oncoproteins are able to induce degradation of p53 and pRb tumor suppressor proteins respectively. Moreover, the expression of these oncoproteins is related to alterations in the PI3K/AKT/mTOR pathway. The cellular kinase mammalian target of Rapamycin (mTOR) is an important regulator of the cellular protein synthesis machinery and has emerged as a principal mediator of cell growth and proliferation. mTOR activation has been shown to stimulates eIF4G1 and 4EBP1 phosphorylation, thus increasing the rate of protein synthesis. Rapamycin is a specific inhibitor of mTOR signaling pathway and its analogues have demonstrated impressive activity against a broad range of human cancer derived cell lines in culture and in human tumor xenograft models. Since E6 and E7 target several proteins controlling the mTOR pathway we aimed to investigate the effect of Rapamycin in the proliferation of organotypic raft cultures expressing these genes. We also evaluated the effect of E6 and E7 genes in mTOR activity after rapamycin treatment. To generate organotypic culture of keratinocytes we infect these cells with recombinant retroviruses containing HPV-16 E6 and E7 together or separately. We also analyzed the role of p53 and pRb degradation in rapamycin responsiveness by using E6 and E7 mutants lacking the hability to inactivate these cellular proteins. After infection, keratinocytes were seeded on to a collagen matrix. After 6 days, these cultures were treated with 100ng/ml of Rapamycin for 60 hours. BrdU was added in the last 12 hours to evaluate proliferation. For immunohistochemistry analysis tissues were fixed in buffered formalin and embedded in paraffin. Immunohistochemistry reactions against BrdU, p-4EBP1 (ser 65), p-eIF4G1 (ser 1188) and p-AKT (ser 473) were performed The results show that proliferation of organotypic cultures of keratinocytes transduced with empty vector is inhibited by Rapamycin. On the other hand, cultures generated with keratinocytes transduced with E7 gene were completely resistance to the antiproliferative effect of Rapamycin. Moreover, we found that this antiproliferative effect was dependent of Rb degradation since the cells transduced with E7 mutant unable do induce Rb degradation were sensitive. In addition, eIF4G and 4EBP1 phosphorylation indicates that E7 expression impairs mTOR inhibition by rapamycin. AKT phosphorilation indicates that rapamycin resistance could be dependent of Rb inactivation induced by E7 expression. These results show for the first time that the Rapamycin antiproliferative effect is bypassed by the expression of a viral oncogene, in this case the HPV-16 E7. Moreover, E7 expression impairs rapamycin to inactivate mTOR.

Os tumores da cérvice-uterina, que representam uma das principais doenças ginecológicas em mulheres na idade reprodutiva em todo o mundo, estão etiologicamente associados com a infecção pelo papilomavírus humano (HPV). A progressão de uma lesão intraepitelial escamosa de baixo-grau (LSIL) a um carcinoma invasivo de cérvix uterina está acompanhada da degradação da matriz extracelular (MEC) devido à ação progressiva das metaloproteinases de matriz (MMP-2, MMP-9 e MMP-14) no processo de invasão e metástase. Entretanto, o balanço entre as MMPs e seus reguladores como RECK e TIMPs é necessário para controlar esta invasão. O objetivo deste projeto consiste em avaliar a atividade e a expressão das metaloproteinases 2, 9, e 14, e caracterizar a expressão do gene supressor de metástase RECK e do inibidor tecidual de metaloproteinases (TIMP-2), em modelo de queratinócitos humanos infectados com retrovírus recombinantes que expressam os oncogenes E6 e/ou E7 de HPV 16, em culturas cultivadas em monocamada e organotípicas. Para isso, utilizamos ensaios de real-time PCR, zimografia, western blot, imunocitoquímica, ensaio de ELISA e imunohistoquímica. Em culturas em monocamada observamos que as células que expressam as oncoproteínas E6E7 de HPV16 apresentaram menores níveis protéicos de RECK e TIMP-2 em relação ao controle pXLSN. Quando analisamos as culturas organotípicas, também observamos esta diminuição dos níveis de RNAm e protéicos de RECK em rafts que expressam E6E7, acompanhado pelo aumento da atividade de MMP-9, em relação ao controle. Também observamos que o tratamento das culturas com a citocina TNF aumenta a expressão gênica, protéica e atividade de MMP-9 em todas as linhagens analisadas. Além disso, os oncogenes E6 e/ou E7 não afetam a expressão e/ou atividade de MMP-2, MT1-MMP. Nossos dados demonstraram que a expressão das oncoproteínas E6E7 de HPV16 estão relacionadas com o desequilíbrio entre MMPS e seus inibidores, sugerindo que em uma fase pré-invasiva do carcinoma cervical, não somente as MMPs, mas, principalmente seus inibidores são críticos para início da progressão tumoral. / Cervical cancer is etiologically associated with to high-risk human papillomavirus (HPV) infection. It has been observed that matrix metalloproteinases (MMPs) -2, -9, and MT1-MMP are required for basement membrane degradation during cervical carcinoma progression. Moreover, a counterbalancing among MMPs and their regulators, such as TIMPs and RECK, is necessary to modulate invasion. In order to study the effect of HPV oncogenes on MMPs expression, primary human keratinocytes (PHKs) were infected with recombinant retroviruses expressing wild-type HPV16 E6 and/or E7 oncogenes and were used to seed monolayers and organotypic cultures. Quantitative real-time PCR (Q-PCR), western blot, zimography, immunocitochemistry, ELISA assay and immunohistochemistry were used to determine the expression level and activity of MMP-2, MMP-9, MT1-MMP and their inhibitors RECK and TIMP-2. We observed that cultures expressing E6E7 presented lower RECK and TIMP-2 protein levels than control keratinocytes. In addition, rafts cultures presented the same lower RECK levels additionally presenting higher MMP-9 activity than control. Furthermore, we observed that expression of E6 and/or E7 proteins do not affect MMP-2 and MT1-MMP protein levels and/or activity. We also observed that TNF treatment enhance the MMP-9 gene and protein expression and activity in all studied cell lines. Taken together, our results demonstrate that HPV16E6E7 expression is related with the unbalance between MMPs and their inhibitors, suggesting that in the initial steps of HPV-related cervical disease, not only MMPs but also RECK and TIMP-2 are critical for tumor progression.

A infecção por HPV de alto risco é considerada um dos principais fatores de risco para o desenvolvimento do carcinoma do colo uterino, um das neoplasias mais freqüentes em mulheres de todo o mundo. As oncoproteínas E6 e E7 de HPV-16 são capazes de induzir a degradação dos genes supressores de tumor p53 e pRb, respectivamente. Mais do que isso, a expressão dessas oncoproteínas está relacionada a alterações na via de PI3K/AKT/mTOR. A proteína quinase mTOR apresenta importante papel no controle da tradução de proteínas e é considerada o principal mediador entre crescimento celular e proliferação. A ativação de mTOR é correlacionada à fosforilação das proteínas eIF4G1 e 4EBP1, aumentando assim a taxa de síntese de proteínas. A Rapamicina é um inibidor específico de mTOR e seus análogos apresentam potente atividade antiproliferativa em um grande número de células tumorais e tumores gerados em animais. Uma vez que as proteínas E6 e E7 são capazes de interagir com diversas proteínas da via que controla a atividade de mTOR optamos por investigar o efeito da rapamicina na proliferação de culturas organotípicas de queratinócitos expressando esses genes. Também avaliamos o efeito dos genes E6 e E7 na atividade de mTOR após o tratamento com essa droga. Para geração de culturas organotípicas de queratinócitos infectamos essas células com vetores retrovirais recombinantes contendo os genes E6 e E7 de HPV-16 em conjunto ou separadamente. Nós também avaliamos o papel da degradação de p53 e pRb na resposta à rapamicina através da utilização de mutantes de E6 e E7 incapazes de induzir a degradação dessas proteínas celulares. Após a infecção dos queratinócitos, os mesmos foram semeados em uma matriz de colágeno. Após 6 dias as culturas foram tratadas com 100ng/ml de rapamicina e permaneceram 60h em contato com a droga. Para análise por imunohistoquímica os tecidos foram fixados em formalina tamponada e emblocados em parafina. A reação de imunohistoquímica foi realizada utilizando os anticorpos contra BrdU, p-4EBP1 (ser 65), p-eIF4G1 (ser 1188) e pAKT (ser 473). Os resultados obtidos ilustram que a rapamicina apresenta efeito antiproliferativo em culturas de queratinócitos contendo o vetor vazio. Por outro lado, culturas contendo o gene E7 são resistentes ao efeito antiproliferativo dessa droga. Essa resistência parece estar relacionada à capacidade de E7 induzir a degradação da proteína pRb, uma vez que em queratinócitos expressando o mutante de E7, incapaz de induzir a degradação dessa proteína, não foi observada resistência. Além disso, a fosforilação de eIF4G e 4EBP1 indica que a expressão de E7 impede que a rapamicina seja capaz de inibir a atividade de mTOR. Esses resultados mostram, pela primeira vez, que o efeito antiproliferativo da rapamicina pode ser superado pela expressão de uma proteína viral, no caso a proteína E7 de HPV-16. / High-risk HPV infection has a major etiologic role in development and progression of cervical cancer, one of the most frequent forms of cancer among women worldwide. HPV-16 E6 and E7 oncoproteins are able to induce degradation of p53 and pRb tumor suppressor proteins respectively. Moreover, the expression of these oncoproteins is related to alterations in the PI3K/AKT/mTOR pathway. The cellular kinase mammalian target of Rapamycin (mTOR) is an important regulator of the cellular protein synthesis machinery and has emerged as a principal mediator of cell growth and proliferation. mTOR activation has been shown to stimulates eIF4G1 and 4EBP1 phosphorylation, thus increasing the rate of protein synthesis. Rapamycin is a specific inhibitor of mTOR signaling pathway and its analogues have demonstrated impressive activity against a broad range of human cancer derived cell lines in culture and in human tumor xenograft models. Since E6 and E7 target several proteins controlling the mTOR pathway we aimed to investigate the effect of Rapamycin in the proliferation of organotypic raft cultures expressing these genes. We also evaluated the effect of E6 and E7 genes in mTOR activity after rapamycin treatment. To generate organotypic culture of keratinocytes we infect these cells with recombinant retroviruses containing HPV-16 E6 and E7 together or separately. We also analyzed the role of p53 and pRb degradation in rapamycin responsiveness by using E6 and E7 mutants lacking the hability to inactivate these cellular proteins. After infection, keratinocytes were seeded on to a collagen matrix. After 6 days, these cultures were treated with 100ng/ml of Rapamycin for 60 hours. BrdU was added in the last 12 hours to evaluate proliferation. For immunohistochemistry analysis tissues were fixed in buffered formalin and embedded in paraffin. Immunohistochemistry reactions against BrdU, p-4EBP1 (ser 65), p-eIF4G1 (ser 1188) and p-AKT (ser 473) were performed The results show that proliferation of organotypic cultures of keratinocytes transduced with empty vector is inhibited by Rapamycin. On the other hand, cultures generated with keratinocytes transduced with E7 gene were completely resistance to the antiproliferative effect of Rapamycin. Moreover, we found that this antiproliferative effect was dependent of Rb degradation since the cells transduced with E7 mutant unable do induce Rb degradation were sensitive. In addition, eIF4G and 4EBP1 phosphorylation indicates that E7 expression impairs mTOR inhibition by rapamycin. AKT phosphorilation indicates that rapamycin resistance could be dependent of Rb inactivation induced by E7 expression. These results show for the first time that the Rapamycin antiproliferative effect is bypassed by the expression of a viral oncogene, in this case the HPV-16 E7. Moreover, E7 expression impairs rapamycin to inactivate mTOR.