Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2003. / Bibliogr.: f. 77-86. Publié aussi en version électronique.

L’émergence de la respiration aérienne au cours du développement de l’amphibien demande d’importants changements au niveau du circuit cérébral qui génère et régule le rythme respiratoire. La métamorphose étant influencée par différentes hormones métamorphiques, nous avons testé l’hypothèse proposant qu’exposer le cerveau à ces hormones augmenterait le rythme respiratoire aérien fictif chez les têtards de Lithobates catesbeianus. Nous utilisons une technique d’isolation du tronc cérébrale qui est ensuite exposé à différentes hormones, soit l’aldostérone, la corticostérone et l’hormone T3. En comparant les préparations exposées aux hormones sur 24h avec les contrôles, nous démontrons que l’exposition aux hormones augmente de manière générale la respiration aérienne. La ventilation fictive des préparations exposées aux hormones présentait des similarités avec celles provenant d’adultes. Nous concluons que, grâce à leurs effets à long terme, les hormones régulant la métamorphose peuvent déclencher la maturation des circuits neuronaux qui génèrent et régulent la respiration de cette espèce. / The emergence of air breathing during amphibian development requires significant changes to the brainstem circuits that generate and regulate breathing. Because this metamorphosis is regulated by metamorphic hormones, we tested the hypothesis that exposing the brainstem to these hormones augments the fictive air breathing frequency in Lithobates catesbeianus tadpoles. Brainstems were isolated from pre-metamorphic tadpoles and a hormone exposure was made with the following hormones: aldosterone, corticosterone, T3. By comparison with preparations subjected to sham treatment, hormone exposure generally increased fictive air breathing frequency. Brainstem preparations showed a response to a change in the aCSF pH only before the 24h incubation, suggesting a chemosensitivity lost following the incubation. However, the patterns of the exposed brainstem presented an activity that is reminiscent of those observed in adult frogs. We conclude that hormones play an important role in the maturation of the neural circuits that generate and regulate breathing in this species.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. [105]-118. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Depuis plusieurs années maintenant, les populations d'amphibiens sont en déclin, et ce, partout sur la planète. Le problème semble engendré par de multiples facteurs agissant de concert tels que le réchauffement climatique, l'augmentation des rayons ultraviolets, l'introduction d'espèces exotiques, l'augmentation des infections parasitaires et, probablement les deux plus importants, l'altération et la contamination de l'habitat. En ce qui concerne la pollution de l'habitat, la contamination d'origine agricole peut affecter grandement les amphibiens vivant à proximité de régions rurales. Avec l'avènement de l'agriculture intensive, sont en effet arrivés les nombreux pesticides que l'on retrouve maintenant dans plusieurs cours d'eau. Les contaminants d'origine agricole peuvent être la cause de nombreux problèmes de santé chez les amphibiens. Chez les grenouilles vivant à proximité de zones agricoles, des malformations sont souvent remarquées. Dès lors, une perturbation de l'homéostasie des rétinoïdes, des molécules notamment impliquées dans le développement embryonnaire, a été soupçonnée. Certaines études démontrent d'ailleurs une altération des concentrations hépatique et plasmatique de ces molécules chez des grenouilles provenant de régions fortement agricoles. Ainsi, l'objectif de la présente étude était de vérifier si les concentrations plasmatique et hépatique des rétinoïdes étaient affectés par l'agriculture chez les ouaouarons, Rana catesbeiana. Pour ce faire, des ouaouarons ont été échantillonnés au cours des étés 2007 et 2008 à différents sites du bassin versant de la rivière Yamaska sélectionnés selon un gradient d'intensité agricole. Les analyses des niveaux de rétinol hépatique, de rétinol plasmatique et d'esters de rétinol hépatiques ont toutes été réalisées en chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Les résultats démontrent une baisse du rétinol plasmatique au site de forte intensité agricole de la rivière Noire par rapport aux sites témoins pour les mâles échantillonnés en 2007 (p = 0,0006) et en 2008 (p = 0,01). Cependant, les concentrations des rétinoïdes hépatiques chez les mâles provenant de ce site ne sont pas différentes du site témoin de Deborah Stairs. Les différences ne sont cependant pas significatives chez les femelles qui présentent de plus grandes concentrations de rétinol plasmatique que les mâles (p = 0,001 pour les deux années regroupées). Chez les mâles, la baisse du rétinol plasmatique jumelée à une concentration normale de rétinoïdes hépatiques suggère une altération du transport du rétinol pour les ouaouarons provenant du site de la rivière Noire. Le transport du rétinol étant assuré par deux protéines, la RBP (protéine de liaison au rétinol) et la TTR (transthyrétine), nous avons tenté de mesurer les niveaux de ces deux protéines dans le sang avec une méthode de HPLC par exclusion de taille. Nous avons également essayé de mesurer les taux de synthèse hépatique de ces molécules en RT-PCR. Bien que ces deux tentatives se soient avérées non concluantes, cette étude a permis de réaliser d'importants progrès en ce qui concerne la mise au point de ces deux techniques. La RBP et la TTR sont deux molécules importantes pour de nombreuses fonctions physiologiques, c'est pourquoi il apparaît essentiel de poursuivre ces travaux qui pourraient amener des avancées importantes dans le domaine de l'écotoxicologie aquatique et qui pourraient contribuer à expliquer un débalancement des rétinoïdes et un déclin des amphibiens. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Amphibiens, Rana catesbeiana, Contaminants agricoles, Rétinoïdes, Rétinol, Esters de rétinol, RBP, TTR, pesticides, écotoxicologie aquatique.

L'exploitation des terres à des fins agricoles entraîne la présence de nombreux contaminants dans les milieux naturels, ce qui peut nuire à la faune qu'on y retrouve. Nous avons émis l'hypothèse que la présence de contaminants agricoles aurait un impact sur le métabolisme osseux du ouaouaron (Rana catesbeiana), puisque des difformités au niveau des pattes avaient auparavant été observées chez certains individus. Les grenouilles ont été capturées à l'été 2008 en six sites situés aux abords de la rivière Yamaska et choisis selon un gradient d'activité agricole. Elles ont par la suite été disséquées et leurs fémurs et phalanges ont été analysés à l'aide d'une technique d'imagerie numérique, grâce à l'appareil Skyscan 1172. Les phalanges des individus ont été analysées en histologie afin d'estimer leur âge par squelettochronologie. Une analyse sérique des principaux marqueurs du métabolisme osseux a aussi été effectuée. Nos résultats ont démontré que l'activité de la phosphatase alcaline augmentait en fonction du gradient d'exploitation agricole, supposant une atteinte hépatique. Aussi, les ouaouarons provenant du site de plus forte activité agricole présentaient un volume osseux réduit au niveau de la portion trabéculaire de la phalange, ainsi que de la portion corticale du fémur. De plus, les grenouilles capturées à ce site étaient significativement plus jeunes. Nous avons aussi voulu vérifier l'impact de certains pesticides au niveau cellulaire, en utilisant la lignée ostéoblastique murine MC3T3-E1 et la lignée ostéoblastique humaine MG-63. Il s'est avéré que l'atrazine et le métolachlore n'étaient pas cytotoxiques pour les cellules aux concentrations utilisées. Par contre, l'endosulfan, un pesticide organochloré, a été démontré cytotoxique, sa CL50 ayant été mesurée à 42,4µM. Nous avons par la suite tenté de documenter son mécanisme de toxicité par des mesures au cytofluoromètre. Nous avons pu démontrer par un marquage aux sondes PI et Annexine V que l'endosulfan induisait l'apoptose et la nécrose. De plus, le potentiel mitochondrial subit une dépolarisation forte et rapide après traitement à l'endosulfan, ce qui a été mesuré grâce à la sonde JC-1. Bien que l'apoptose soit induite par l'endosulfan et que le potentiel mitochondrial chute, nous n'avons pas été en mesure de mettre en évidence la production de ROS par marquage à la sonde H2DCFDA. Par contre, l'ajout de trois antioxydants différents, soit la vitamine C, la vitamine E et la N-acétyl-cystéine au milieu de culture a significativement réduit la mortalité, ce qui laisse présumer que la production de ROS serait à la base du mécanisme de toxicité de ce pesticide, mais que le marquage au H2DCFDA n' aurait pu le révéler. Le métabolisme osseux est souvent ignoré lors d'études toxicologiques. Ce projet ayant permis de révéler l'impact de contaminants agricoles sur le métabolisme osseux du ouaouaron ainsi que sur des cellules ostéoblastiques indique que cet aspect ne devrait pas être négligé lors de futures études. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : ostéoblaste, apoptose, endosulfan, ouaouaron, pesticides.

Au courant du demi-siècle dernier, le déclin des espèces et des populations d'amphibiens est devenu un problème bien réel. Aujourd'hui, la science propose de nombreux facteurs tant environnementaux qu'anthropiques pour expliquer ce phénomène. Parmi ceux-ci, la contamination des milieux aquatiques par les pesticides et fertilisants agricoles semble corréler tout particulièrement. D'ailleurs, plusieurs cas de malformations aux membres ont été répertoriés chez des grenouilles vivant en zones agricoles. Ce phénomène pourrait compromettre, entre autres, le succès reproductif des populations et par conséquent la survie des espèces dans le milieu. Le type d'anomalie rapporté rappelle fortement celui provoqué lors d'un débalancement dans l'homéostasie de l'acide rétinoïque (AR). Les rétinoïdes sont des molécules endogènes responsables d'un grand nombre de processus physiologiques d'importance, et parmi ces molécules, l'AR joue un rôle crucial au moment de la morphogenèse. Ses effets sont assurés par sa liaison à des récepteurs nucléaires spécifiques. La synthèse et le catabolisme de l'AR sont finement régulés étant donné la forte activité nucléaire de la molécule. Un léger déséquilibre dans le métabolisme de l'AR peut donner lieu à de graves conséquences sur le développement embryonnaire d'un organisme. Certains pesticides sont connus pour interférer dans le métabolisme et les voies de signalisation de l'AR. L'hypothèse de départ du projet postule que le mélange de pesticides et de fertilisants auquel les amphibiens sont exposés dans les plans d'eau avoisinant les terres agricoles provoque une perturbation du métabolisme des rétinoïdes en altérant le travail d'enzymes-clefs. C'est ainsi que des concentrations anormales d'AR seraient à la base des effets tératogènes observés sur le terrain. Pour vérifier cette hypothèse, des essais enzymatiques ont été effectués pour juger l'efficacité enzymatique des cytochromes P450 à cataboliser l'AR en un métabolite secondaire majeur, l'acide tout-trans-4-oxo-rétinoïque (tt-4-oxo-AR), sur des animaux provenant d'habitats contaminés selon un gradient d'activité agricole. Le choix du modèle amphibien s'est arrêté sur le ouaouaron (Rana catesbeiana). En effet, la présente étude s'inscrit dans le « Projet Amphibien », une grande étude toxicologique portant sur la santé du ouaouaron vivant en milieu agricole, dans le bassin versant de la rivière Yamaska, au Québec. La caractérisation partielle de l'activité catabolique des microsomes hépatiques de ouaouaron sur l'AR a permis, pour la première fois, la mise en évidence d'un substrat préférentiel, la détermination de valeurs de Km et Vmax et la démonstration de l'implication des enzymes du CYP450 dans cette réaction. De façon générale, l'activité d'oxydation chez les mâles était plus importante que chez les femelles, malgré un poids du foie et des concentrations en protéines microsomales plus faibles et ce, pour les deux années d'échantillonnage. Les résultats suggèrent aussi une stimulation du catabolisme hépatique de l'AR par les microsomes hépatiques des ouaouarons provenant des sites les plus contaminés. Aussi, ayant une taille significativement plus faible, les grenouilles des sites fortement contaminés semblaient connaître certains problèmes de croissance. L'étude comparative de l'efficacité d'oxydation de l'AR chez le ouaouaron de la rivière Yamaska aura donc permis de cerner davantage l'un des mécanismes impliqués dans la tératogénie associée à un débalancement dans les concentrations effectives d'AR. Dans la seconde partie du projet, le catabolisme de l'AR a été tenté sur un modèle cellulaire choisi, les cellules P19. Cette exploration avait pour objectif de reproduire et maximiser un protocole d'oxydation de l'AR sur des cellules répondant à cette molécule, de façon à l'utiliser ultérieurement pour étudier les bases moléculaires derrière le métabolisme de l'AR. La culture des cellules P19, l'extraction de microsomes à partir de ces cellules et l'activité catabolique de l'AR en essais enzymatiques ont été investigués selon un protocole déjà établi. Les premières expériences n'ayant pas fonctionné, un prétraitement des cultures à l'AR a été expérimenté. Le taux de mortalité dans les cultures suite à cette pré-exposition s'est vu augmenter. De plus, bien que quantifiable, les concentrations de produits formés (tt-4-oco-AR) étaient très faibles et les résultats rarement reproductibles. Suite à ces constatations, une mise au point de la méthode d'extraction des microsomes dans le but d'augmenter le rendement des protéines microsomales à partir des cellules a été suggérée pour de futures tentatives. Aussi, des essais sur les homogénats cellulaires seraient à prévoir pour tenter de maximiser la réponse enzymatique. Malgré tout, l'utilisation des cellules P19 pour l'étude des mécanismes sous-jacents à l'émergence des malformations associées à l'AR observées chez les amphibiens en milieu agricole s'avère une avenue prometteuse. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Acide rétinoïque, CYP450, acide 4-oxo-rétinoïque, microsomes hépatiques, Rana catesbeiana, contaminants agricoles, cellules P19.

L'apparition progressive de la respiration pulmonaire chez le têtard indique que les circuits nerveux responsables du contrôle de la respiration subissent une réorganisation importante au cours du développement. Puisque les mécanismes neuronaux contribuant à l'émergence de la respiratoire aérienne chez cette espèce sont peu connus, nous avons étudié l'effet de la modulation noradrénergique sur des préparations de tronc cérébral isolé chez différents stades de développement de Rana catesbeiana. Les résultats démontrent que l'application de noradrenaline sur les préparations augmente la fréquence pulmonaire chez le têtard prémétamorphique et la diminue chez les animaux plus matures via une activation des récepteurs a-adrénergiques. Cet effet stade-dépendant de l'activité pulmonaire provient d'un changement développemental des voies GABAergique/glycinergique lors de l'établissement du gradient chlorure. Dans un contexte plus physiologique, la modulation noradrénergique contribue au chémoréflexe central à l'hypoxie chez l'amphibien. / Lung ventilation appears progressively during tadpole development, showing that neural circuits responsible for the control of breathing undergo an important reorganization during development. Since neuronal mechanisms contributing to the emergence of air breathing in this species are little known, we studied the effect of the noradrenergic modulation on in vitro brainstem preparations at different developmental stages from Rana catesbeiana. The results show that noradrenaline bath application increases the pulmonary frequency in pre-metamorphic tadpole and decreases it in more mature animals via a a-adrenergic receptors activation. This stage-dependent effect on fictive lung ventilation originates from a developmental change of the GABAergic/glycinergic pathways during the establishment of the chloride gradient. In a more physiological context, noradrenergic modulation contributes to the hypoxia central chemoreflex in amphibian.