Ces 20 dernières années ont été consacrées à la dissection du réseau enzymatique complexe aboutissant à l’édification de l’amidon alors que bien moins de données ont été obtenues en ce qui concerne la dégradation ou les phénomènes de régulation de cette voie métabolique. Le métabolisme de ce polysaccharide nécessite plus de 40 gènes aussi bien chez la microalgue la plus primitive que chez les plantes les plus évoluées. Ce résultat est surprenant si on considère que l’amidon n’est composé que d’un seul sucre, le glucose, et contient uniquement que deux types de liaisons chimiques. En sus de son intérêt pour les industries alimentaire et des matériaux, un intérêt grandissant pour la compréhension des phénomènes de mobilisation de l’amidon chez les microalgues est apparu du fait de l’importance de ces organismes pour la production de bioénergies. Tandis que la majorité des données disponibles à ce jour proviennent d’approches de génétique inverse chez la plante modèle Arabidopsis thaliana, nous proposons d’étudier le catabolisme de l’amidon via une stratégie de génétique formelle dans un système plus convenu pour une telle approche que les plantes modèles : l'algue verte unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii. La construction et le crible d’une banque de mutants d’insertion nous ont permis d’isoler plus de 40 souches déficientes pour la mobilisation et représente une ressource essentielle pour une compréhension complète des mécanismes de dégradation de l’amidon. Nos caractérisations biochimiques, enzymologiques et moléculaires sur ces mutants nous ont permis d’identifier un nombre appréciable de fonctions impliquées plus ou moins directement dans le processus. / During the last two decades of research, efforts have been focused on the understanding of the complex pathway of starch biosynthesis with comparatively less emphasis on the genes and regulatory networks responsible for mobilization in planta of this important source of storage polysaccharide. However the starch metabolism network includes over 40 genes highly conserved from green algae to land plants. This comes as a surprise when one considers that this storage polysaccharide is made solely of glucose residues with only two types of chemical linkages. In addition to its central importance in food and material science, a particular interest in the understanding of starch mobilization in green algae rather than crops has been generated from recent developments in the production of bioenergies. While successful reverse genetic approaches have been mostly applied to Arabidopsis, we propose to complete and reassess our vision of starch catabolism by applying a high throughput forward genetic strategy in the system which among all model plants is most suited for such an approach: the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii. We thus constructed and screened an insertional mutant bank and identified more than 40 mutant strains altered in their ability or in the kinetics of starch mobilization. The combination of biochemical, enzymological and molecular approaches allowed us to identify several of the mutations responsive of the catabolic phenotype.

Il est connu que la grosseur d'une lipoprotéine est déterminée par sa composition lipidique. Celle-ci peut être modifiée par la captation sélective d'esters de cholestérol (EC) par le scavenger receptor class B type 1 (SR-BI). Comme montré par Brodeur et al. (2005), la captation sélective permet de diminuer la taille de la lipoprotéine de faible densité (LDL). Il devenait donc important de déterminer si la perte d'esters de cholestérol, subséquente à la captation sélective par SR-BI, permettrait une modification assez importante de la LDL afin de favoriser le métabolisme de la lipoprotéine par la voie de captation globale. Les sous-classes de LDL ont une composition lipidique différente. Cette différence pourrait être produite par une activité plus ou moins grande de captation sélective par le SR-BI. Les sous-classes ont été caractérisées par dosage enzymatique, migration sur gel et essai in vitro sur la lignée cellulaire Hep G2. Par la suite, le but était de développer un modèle in vitro, chez des cellules Hep G2, et in vivo, chez des rats Sprague-Dawley, des souris CD 1 et chez des souris C57BL/6, pour permettre la production de LDL étant appauvries en EC par la captation sélective. Pour ce faire, des LDL ont été exposées à des cellules Hep G2 ou encore injectées dans l'animal puis récupérées par ponction cardiaque pour ensuite être à nouveau isolées. Les LDL modifiées in vivo et in vitro ont été caractérisées par dosage enzymatique, migration sur gel et essai in vitro sur la lignée cellulaire Hep G2. L'étude des sous-classes a démontré qu'une diminution en EC permet une augmentation de la captation globale en augmentant l'association protéique et la dégradation de la sous-classe III. Ceci est bénéfique pour l'organisme. Pour ce qui est de la portion de l'étude in vitro, celle-ci n'a pas donné de résultats concluants. Cette production de LDL a permis de diminuer la quantité d'EC composant la LDL. Par contre, cette diminution est observable tant en présence qu'en absence de cellules Hep G2. Donc cette diminution n'est pas nécessairement due à l'action de la captation sélective. La production in vivo de LDL appauvries en EC chez le rat Sprague-Dawley a démontré une diminution de la quantité d'EC composant les lipoprotéines. Par contre, cette diminution s'accompagne d'une forte diminution en triglycérides (TG) due à l'activité de la lipoprotéine lipase qui est présente dans l'animal. La diminution en TG ne voulant pas être étudiée, ceci faisait du rat un modèle moins intéressant à utiliser. La souris CD 1 a elle aussi permis la production de LDL appauvries en EC, par contre si l'on regarde au niveau de ses caractéristiques celles-ci sont plus chargées, ce qui pourrait indiquer un début d'oxydation et un métabolisme dont la captation globale serait diminuée et la captation sélective augmentée. Ainsi, en se fiant aux résultats des sous-classes, la captation sélective serait bénéfique pour le métabolisme des LDL. Par contre, les résultats obtenus par la production in vivo semblent dire que les LDL produites sont plus susceptibles à l'oxydation, ce qui serait néfaste. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : LDL, SR-BI, Captation sélective, Oxydation, Sous-classe.

Le maïs est une plante de culture vivrière commerciale très importante, cultivée partout dans le monde. Sa croissance et les rendements en champ sont affectés par de nombreuses contraintes environnementales. Dans ce travail, l'impact du polluant gazeux phytotoxique, l'ozone, a été étudié sur les feuilles de maïs en utilisant une approche moléculaire et biochimique. Les concentrations en ozone dans la troposphère ont considérablement augmenté dans un passé récent, et actuellement l'ozone affecte clairement les cultures. Un système de fumigation récemment développé à l'INRA a été utilisé pour exposer à l'ozone les maïs en champs de façon contrôlée. Soixante et onze jours après le semis, les plantes ont été soumises à une fumigation d'ozone de 98 ppb.h-1 en moyenne. Les feuilles 10 et 12 ont été récoltées après 20, 35 et 50 jours de traitement. L'expression de trois gènes codant les metacaspases (ZmMCII-1, ZmMCII-2 and ZmMCII-3) ainsi que de leur activité enzymatique globale ont été étudiées lors de la sénescence, et en réponse à l'ozone, dans les feuilles. Pour la première fois, nous avons montré une accumulation significative de l'ARNm des trois metacapases en réponse à l'ozone. Par ailleurs, l'activité enzymatique cellulaire globale des metacaspases est également fortement stimulée dans les deux cas (ozone et sénescence). La surexpression des gènes et la stimulation de l'activité des metacaspases pourraient êtres liés à un ajustement des catabolismes protéiques des feuilles lors de la sénescence et en réponse à l'ozone. Au cours d'autres expériences, les mêmes réponses ont été observées dans le cas de la papaïne-like protéase à cystéine (Mor-CP). De plus, un nouvel inhibiteur des protéases à cysteine, une cystatin a été identifiée dans des feuilles de maïs et a été nommée CC11. L'ADNc complet a été isolé et la protéine recombinante CC11 correspondante a été obtenue et purifiée, à partir d'un système bactérien hétérologue (Vecteur pET30 (EK/LIC) et E. coli BL21 (DE3) plyS). Cette nouvelle cystatine présente une activité inhibitrice optimale vis-à-vis de la papaïne (100%) et très importante (57-80%) vis à vis des protéases à cystéine de feuilles de maïs. Par conséquent, son implication dans la régulation de l'activité des protéases à cystéine en réponse à l'ozone, peut être supposée. Enfin, la production de protéines recombinantes à partir d'ADNc isolés a été réalisée, correspondant aux régions actives de la metacaspase ZmMCII-2 et de la protéase à cystéine Mor-CP. Les anticorps polyclonaux ont été obtenus pour une étude future des événements post-transcriptionels. En conclusion, les protéases à cystéine (caspase-like et papaïne-like) pourraient être utilisées comme paramètres nouveaux pour le criblage de géniteurs dans les programmes d'amélioration du maïs pour la tolérance à l'ozone / Maize is a major crop cultivated all over the world. Its yield and growth is affected by numerous environmental stresses. In the present work, the impact of the gaseous phytotoxic pollutant, ozone, on maize leaves was studied, using a molecular and biochemical approach. Concentrations of ozone in the troposphere have increased dramatically in the recent past and it now negatively affects crops growth and yield. In this work, a recently developed fumigation system was used to expose maize plants in the field. Seventy-one days after sowing, the plants were submitted to ozone fumigation at an average concentration of 98 ppb.h-1. The 10th and 12th leaves were harvested after 20, 35 and 50 days of treatment. Expression of three genes coding caspase-like cysteine proteases “metacaspases” (denoted as ZmMCII-1, ZmMCII-2 and ZmMCII-3) and their global activity was studied in senescent and ozone-exposed maize leaves. For the first time, we observed that mRNA accumulation of the three caspase-like cysteine proteases increased significantly in response to ozone exposure. Moreover, the global activity of metacaspases also increased significantly in both senescencing and ozone-exposed plants. The metacaspases activity and mRNA up-regulation could represent control points for leaf tissues to determine the degree and timing of protein catabolism during senescence and ozone treatment. Protein catabolism was indeed stimulated in response to ozone since increases in the expression of a gene coding an ozone-induced papain-like cysteine protease (Mor-CP) and in global papain-like cysteine proteases activities in leaf tissues were observed. In addition, we identified new cysteine protease inhibitor CC11 “cystatin” in maize leaves. After the recombinant CC11 protein was purified from a bacterial heterologous system (E. coli strain BL21 (DE3) plyS with a pET 30 (EK/LIC) vector), it was shown to be active in vitro against commercial papain (100% inhibition) and against total maize leaf cysteine protease extract (57-80% inhibition). Therefore its involvement in the regulation of cysteine protease activity in response to ozone exposure could be supposed. Production of the recombinant proteins corresponding to the active regions of ZmMCII-2 and Mor-CP was achieved. The corresponding polyclonal antibodies were obtained to study post-transcriptional events in maize leaves, in the future. In conclusion, we have identified the new enzymes, metacaspases and cysteine proteases involved in proteolysis which could be used as novel parameters for screening different maize varieties for improved tolerance to ozone pollution

Au courant du demi-siècle dernier, le déclin des espèces et des populations d'amphibiens est devenu un problème bien réel. Aujourd'hui, la science propose de nombreux facteurs tant environnementaux qu'anthropiques pour expliquer ce phénomène. Parmi ceux-ci, la contamination des milieux aquatiques par les pesticides et fertilisants agricoles semble corréler tout particulièrement. D'ailleurs, plusieurs cas de malformations aux membres ont été répertoriés chez des grenouilles vivant en zones agricoles. Ce phénomène pourrait compromettre, entre autres, le succès reproductif des populations et par conséquent la survie des espèces dans le milieu. Le type d'anomalie rapporté rappelle fortement celui provoqué lors d'un débalancement dans l'homéostasie de l'acide rétinoïque (AR). Les rétinoïdes sont des molécules endogènes responsables d'un grand nombre de processus physiologiques d'importance, et parmi ces molécules, l'AR joue un rôle crucial au moment de la morphogenèse. Ses effets sont assurés par sa liaison à des récepteurs nucléaires spécifiques. La synthèse et le catabolisme de l'AR sont finement régulés étant donné la forte activité nucléaire de la molécule. Un léger déséquilibre dans le métabolisme de l'AR peut donner lieu à de graves conséquences sur le développement embryonnaire d'un organisme. Certains pesticides sont connus pour interférer dans le métabolisme et les voies de signalisation de l'AR. L'hypothèse de départ du projet postule que le mélange de pesticides et de fertilisants auquel les amphibiens sont exposés dans les plans d'eau avoisinant les terres agricoles provoque une perturbation du métabolisme des rétinoïdes en altérant le travail d'enzymes-clefs. C'est ainsi que des concentrations anormales d'AR seraient à la base des effets tératogènes observés sur le terrain. Pour vérifier cette hypothèse, des essais enzymatiques ont été effectués pour juger l'efficacité enzymatique des cytochromes P450 à cataboliser l'AR en un métabolite secondaire majeur, l'acide tout-trans-4-oxo-rétinoïque (tt-4-oxo-AR), sur des animaux provenant d'habitats contaminés selon un gradient d'activité agricole. Le choix du modèle amphibien s'est arrêté sur le ouaouaron (Rana catesbeiana). En effet, la présente étude s'inscrit dans le « Projet Amphibien », une grande étude toxicologique portant sur la santé du ouaouaron vivant en milieu agricole, dans le bassin versant de la rivière Yamaska, au Québec. La caractérisation partielle de l'activité catabolique des microsomes hépatiques de ouaouaron sur l'AR a permis, pour la première fois, la mise en évidence d'un substrat préférentiel, la détermination de valeurs de Km et Vmax et la démonstration de l'implication des enzymes du CYP450 dans cette réaction. De façon générale, l'activité d'oxydation chez les mâles était plus importante que chez les femelles, malgré un poids du foie et des concentrations en protéines microsomales plus faibles et ce, pour les deux années d'échantillonnage. Les résultats suggèrent aussi une stimulation du catabolisme hépatique de l'AR par les microsomes hépatiques des ouaouarons provenant des sites les plus contaminés. Aussi, ayant une taille significativement plus faible, les grenouilles des sites fortement contaminés semblaient connaître certains problèmes de croissance. L'étude comparative de l'efficacité d'oxydation de l'AR chez le ouaouaron de la rivière Yamaska aura donc permis de cerner davantage l'un des mécanismes impliqués dans la tératogénie associée à un débalancement dans les concentrations effectives d'AR. Dans la seconde partie du projet, le catabolisme de l'AR a été tenté sur un modèle cellulaire choisi, les cellules P19. Cette exploration avait pour objectif de reproduire et maximiser un protocole d'oxydation de l'AR sur des cellules répondant à cette molécule, de façon à l'utiliser ultérieurement pour étudier les bases moléculaires derrière le métabolisme de l'AR. La culture des cellules P19, l'extraction de microsomes à partir de ces cellules et l'activité catabolique de l'AR en essais enzymatiques ont été investigués selon un protocole déjà établi. Les premières expériences n'ayant pas fonctionné, un prétraitement des cultures à l'AR a été expérimenté. Le taux de mortalité dans les cultures suite à cette pré-exposition s'est vu augmenter. De plus, bien que quantifiable, les concentrations de produits formés (tt-4-oco-AR) étaient très faibles et les résultats rarement reproductibles. Suite à ces constatations, une mise au point de la méthode d'extraction des microsomes dans le but d'augmenter le rendement des protéines microsomales à partir des cellules a été suggérée pour de futures tentatives. Aussi, des essais sur les homogénats cellulaires seraient à prévoir pour tenter de maximiser la réponse enzymatique. Malgré tout, l'utilisation des cellules P19 pour l'étude des mécanismes sous-jacents à l'émergence des malformations associées à l'AR observées chez les amphibiens en milieu agricole s'avère une avenue prometteuse. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Acide rétinoïque, CYP450, acide 4-oxo-rétinoïque, microsomes hépatiques, Rana catesbeiana, contaminants agricoles, cellules P19.

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La morphine constitue l'un des analgésiques les plus utilisés en milieu hospitalier pour soulager les douleurs aiguës et chroniques. Elle exerce ses effets analgésiques en se liant aux récepteurs opioïdes μ (MOR) présents au niveau central et périphérique et possède des effets secondaires, incluant la tolérance, qui limitent son usage à long terme. La première partie de mes travaux avait pour objectif d'étudier le phénomène de tolérance à la morphine et d'en déterminer les mécanismes sous-jacents. A l'heure actuelle, ce phénomène est décrit comme résultant d'une désensibilisation des MOR conduisant à leur endocytose. Nos résultats montrent qu'en cas de tolérance, le catabolisme de la morphine est exacerbé au niveau du système nerveux central. Mes travaux ont également porté sur la caractérisation de la Créatine Kinase (CK) comme étant une protéine liant la morphine à très haute affinité. Nos résultats montrent que la CK possède 2 sites de liaison pour la morphine avec des affinités similaires. En étudiant l'effet potentiel de la CK sur l'analgésie induite par la morphine in vivo, nous avons mis en évidence, que les peptides correspondant aux 2 sites de liaison à la morphine étaient par eux-mêmes analgésiques et que cette analgésie semblait dépendre des récepteurs opioïdes. / Morphine is one of the most used analgesics in hospitals to relieve acute and chronic pain. Morphine exerts its analgesic effects by binding central and peripheral μ opioid receptors (MORs) and has many side effects that limit its long-term use including tolerance. The first part of my thesis was aimed to study the phenomenon of morphine tolerance and to determine the underlying mechanisms. Previously, this phenomenon was explained as resulting !rom MORs desensitization by endocytosis. However, our results show that in case of tolerance, the catabolism of morphine is exacerbated in the central nervous system in particular in astocytes. The second part of my work has focused on the characterization of the Creatine Kinase (CK) as a novel protein that binds morphine with a high affinity. Our results showed that CK has two binding sites with a similar affinity for morphine. Surprisingly, by studying the potential effect of CK on morphine-induced analgesia in vivo, we noticed that the two peptides corresponding to morphine binding sites are analgesics and such analgesia seems to be mediated by opioid receptors.

L’arthrose (OA) est une maladie articulaire dégénérative à l’étiologie complexe et diverse. Les travaux de ces dernières années ont démontré que l’OA est une pathologie affectant tous les tissus de l’articulation incluant le cartilage, la membrane synoviale et l’os sous-chondral. L’OA se traduit par une déstructuration et une perte de fonctionnalité de l’articulation, et est principalement caractérisée par une perte de cartilage articulaire. L’inflammation de la membrane synoviale joue un rôle déterminant dans la progression de l’OA, toutefois elle serait secondaire à la dégradation du cartilage. De plus, l’os sous-chondral est également le siège de nombreuses transformations lors de l’OA. Il est fortement suggéré que ces changements ne correspondent pas seulement à une conséquence, mais pourraient être une cause du développement de l’OA impliquant une communication entre ce tissu et le cartilage. Il est maintenant bien établi que les voies inflammatoires et cataboliques jouent un rôle crucial dans l’OA. C’est pourquoi, nous avons étudié l’implication d’une nouvelle famille de récepteurs membranaires, les PARs, et plus particulièrement le PAR-2 dans les voies physiopathologiques de l’OA. Notre hypothèse est que l’activation de PAR-2 au cours de l’OA est un phénomène majeur du développement/progression de la maladie faisant du récepteur PAR-2 un candidat privilégié pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblant non seulement le cartilage mais aussi l’os sous-chondral. Pour cette étude, nous avons travaillé in vitro avec des chondrocytes (Cr) et des ostéoblastes (Ob) OA respectivement du cartilage et de l’os sous-chondral du condyle fémoral humain. Nos résultats ont démontré que PAR-2 était plus exprimé dans les Cr et les Ob OA que dans les cellules normales. Par ailleurs, PAR-2 est régulé positivement par certains facteurs retrouvés au cours de l’OA comme l’IL-1β, le TNF-α et le TGF-β dans les Cr OA, et par l’IL-1β, le TNF-α et la PGE2 dans les Ob OA. De plus, les principaux facteurs cataboliques et inflammatoires, soit la MMP-1, la MMP-13 et la COX-2 sont produits en quantité plus élevée suite à l’activation du récepteur dans le cartilage OA. De même, l’activation de PAR-2 dans les Ob OA conduit à une production accrue de facteurs pro-résorptifs tels que RANKL, l’IL-6, la MMP-1 et la MMP-9, et à l’augmentation de l’activité pro-résorptive de ces cellules. En outre, dans les deux types tissulaires étudiés, l’activation de PAR-2 augmente l’activité de certaines protéines de la famille des MAPKinases comme Erk1/2, p38 et JNK. Finalement, nous avons conclu notre étude en employant un modèle in vivo d’OA induite chez la souris sauvage et déficiente pour le gène PAR-2. Nos résultats ont démontré que l’absence d’expression et de production de PAR-2 influençait le processus inflammatoire et les changements structuraux affectant à la fois le cartilage et l’os sous-chondral, conduisant à un ralentissement du développement de l’OA. Nos travaux de recherche ont donc permis de montrer que le récepteur PAR-2 est un élément majeur du processus OA en agissant sur les voies cataboliques et inflammatoires du cartilage, et sur le remodelage tissulaire de l’os sous-chondral. Mots-clés : Arthrose, chondrocyte, cartilage, ostéoblaste, os sous-chondral, PAR-2, MMPs, COX, ILs, RANKL, résorption osseuse, MAPKinase, catabolisme, inflammation / Osteoarthritis (OA) is a complex degenerative articular disease. Recent studies have shown that OA is a pathology affecting all the tissues of the joint including the cartilage, the synovial membrane and the subchondral bone. OA is regarded as destruction and a loss of functionality of joint, and is mainly characterized by a loss of articular cartilage. The synovial inflammation also plays a key role in the progression of OA; however, it is believed to be secondary to cartilage degradation. In addition, there are also in the subchondral bone numerous changes which occur during the course of the disease. It is strongly suggested that these changes in subchondral bone are not just a consequence but could be a cause of the development of OA, thus involving a cross-talk between this tissue and the cartilage. It is now well established that inflammatory and catabolic pathways play a crucial role during OA. This is why we have engaged the study of the involvement of a new family of membranous receptors, the PARs, and more particularly PAR-2 during the pathophysiological process of OA. Our hypothesis is that PAR-2 activation during OA course is a major phenomenon for the development/progression of the disease, and that PAR-2 seems a suitable candidate for the development of new therapeutic approaches targeting not only the cartilage but also the subchondral bone. Thus, we have performed in vitro studies on OA chondrocyte (Cr) and osteoblasts (Ob) cells issued respectively from human femoral condyle cartilage and subchondral bone. Our results showed that PAR-2 was expressed at a higher level in the OA Cr and Ob compared to normal cells. Moreover, PAR-2 is found to be positively regulated by some factors present during the course of OA, such as IL-1β, TNF-α and TGF-β in the OA Cr, and IL-1β, TNF-α and PGE2 in the OA Ob. In addition, the main catabolic and inflammatory factors including MMP-1, MMP-13 and COX-2 are enhanced following PAR-2 receptor activation in the OA cartilage. Similarly, the activation of PAR-2 in OA Ob lead to an increased production of pro-resorptive factors such as RANKL, IL-6, MMP-1 and MMP-9, and an increased pro-resorptive activity of these cells. In addition, in both tissue types, PAR-2 activation increases the activity of certain protein MAPKinases family such as Erk1/2, p38 and JNK. Finally, we have performed an in vivo study using an OA induced model in wild-type and PAR-2 gene knock-out mice. Our results demonstrated that the absence of PAR-2 expression and production influenced the inflammatory process and structural changes affecting the cartilage and the subchondral bone, leading to a slowing down of OA development. Our research investigation have bring to light that PAR-2 receptor is a key element during OA process by acting on the cartilage catabolic and inflammatory pathways as well as the tissue remodelling of the subchondral bone. Keywords : Osteoarthritis, chondrocyte, cartilage, osteoblast, subchondral bone, PAR-2, MMPs, COX, ILs, RANKL, bone resorption, MAPKinase , catabolism, inflammation

L'arthrose est une maladie articulaire dégénérative, avec une pathogenèse inconnue. Des études récentes suggèrent que l'activation du facteur de transcription du récepteur activateur de la prolifération des peroxysomes (PPAR) gamma est une cible thérapeutique pour ce maladie. Les agonistes du PPARγ inhibent l'inflammation et réduisent la synthèse des produits de dégradation du cartilage in vitro et in vivo. Cependant, des études utilisant des agonistes du PPARγ n’élucident pas les effets exacts médiés par ce gène complexe. En effet, certains de ces agonistes ont la capacité de régulariser d'autres voies de signalisation indépendantes de PPARγ, ainsi entraînant des effets secondaires graves. Afin d'obtenir une efficacité thérapeutique avec potentiellement moins de problèmes de sécurité, il est donc essentiel d'élucider, in vivo, le rôle exact de PPARγ dans la physiopathologie OA. Mon projet de thèse permettra de déterminer, pour la première fois, le rôle spécifique de PPARγ in vivo dans la physiopathologie OA. Les souris utilisées pour l’étude avaient une délétion conditionnelle du gène PPARγ dans le cartilage. Ces dernières ont été générées en employant le système LoxP/Cre. Pour tester cette hypothèse, j'ai généré deux types de souris avec une délétion au PPARγ, (a) une suppression du gène PPARγ spécifiquement dans le cartilage germinale pour l'étude de l'arthrose liée au développement et à l'âge et (b) la suppression inductible du gène PPARγ spécifiquement dans le cartilage chez la souris adulte pour les études OA. L’étude précédente dans notre laboratoire, utilisant ces souris ayant une délétion au gène PPARγ germinales, montre que ces souris présentent des anomalies du développement du cartilage. J'ai également exploré si ces souris qui présentent des défauts précoces du développement ont toutes les modifications phénotypiques dans le cartilage au cours du vieillissement. Mes résultats ont montré que les souris adultes, ayant une délétion au gène PPARγ, ont présenter un phénotype de l'arthrose spontanée associée à une dégradation du cartilage, l’hypocellularité, la fibrose synoviale. Cette étude a montré que PPARγ est un régulateur essentiel pour le cartilage, et c’est le manque (l’absence) de ce dernier qui conduit à un phénotype de l'arthrose spontanée accélérée (American Journal of Pathologie). A partir de ce but de l'étude, on n’a pas pu vérifier si ces souris présentaient l’OA spontanée en raison des défauts de développement ou à la suite de la délétion du gène PPARγ. Pour contourner les défauts de développement, j'ai généré des souris ayant une délétion du gène PPARγ spécifiquement dans le cartilage inductible avec le système Col2rTACre. Ces souris ont été soumises à modèle de la chirurgie OA (DMM: déstabilisation du ménisque médial) et les résultats révèlent que les souris PPARγ KO ont une dégradation accélérée du cartilage, une hypocellularité, une fibrose synoviale et une augmentation de l'expression des marqueurs cataboliques et des marqueurs inflammatoire. La perte de PPAR dans le cartilage articulaire est un évènement critique qui initie la dégradation de cartilage dans OA. Les études récentes suggèrent que le procès d’autophagie, une forme de survie cellulaire programmée, est altéré pendant l’OA et peut contribuer vers une protection diminuée des cellules, résultant la dégradation du cartilage. J’ai donc exploré le rôle de PPARγ dans la protection des cellules en déterminant l’effet de manque de PPARγ dans le cartilage par l’expression de mTOR (régulateur négatif principal d’autophagie) et les gènes d’autophagie durant OA. Mes résultats ont montré que les souris KO PPARγ présentent également une augmentation sur l'expression de mTOR et une diminution sur l’expression des marqueurs autophagiques en comparaison avec les chondrocytes articulaires isolés des souris contrôles OA. J'ai suggéré l'hypothèse que PPARγ contrôle la régulation de la signalisation de mTOR/autophagie, et finalement la mort des chondrocytes et l’expression des facteurs cataboliques et les facteurs inflammatoire. Pour tester cette hypothèse, j’ai fait la transfection des chondrocytes arthrosiques PPARγ-KO avec le vecteur d’expression de PPARγ pour déterminer si la restauration de l'expression de PPARγ peut sauver le phénotype des cellules PPARγ-KO OA. J'ai observé que la restauration de l'expression de PPARγ dans les cellules PPARγ-KO en présence du vecteur d'expression PPARγ, a pu considérablement régulariser négativement l'expression de mTOR et mettre en règle positivement l'expression des gènes autophagiques ainsi que le sauvetage significative de l'expression du collagène de type II et l’aggrecan et de baisser de manière significative l'expression de marqueurs cataboliques critiques et des marqueurs inflammatoires. Pour prouver que l’augmentation de la signalisation de mTOR et la diminution de l'autophagie est responsable du phénotype OA accélérée observée dans les souris PPARγ KO in vivo, j'ai généré les souris doubles KO PPARγ- mTOR inductible spécifique du cartilage en utilisant le système Col2 - rtTA -Cre et soumis ces souris à DMM modèle de l'arthrose. Mes résultants démontrent que les souris avec PPARγ- mTOR doubles KO ont été significativement protégés contre les OA DMM induites associées à une protection significative contre la destruction du cartilage, la perte de protéoglycanes et la perte de chondro-cellularité par rapport aux souris témoins. Considérant que mTOR est un répresseur majeur de l'autophagie, j'ai trouvé que l'expression de deux marqueurs de l'autophagie critiques (ULK1 et LC3B) a été significativement plus élevée dans les chondrocytes extraits les souris doubles KO PPARγ-mTOR par rapport aux souris témoins. En plus, les études de sauvetage in vitro en utilisant le vecteur d'expression PPAR et les études in vivo utilisant les souris doubles KO PPARγ- mTOR montrent que PPARγ est impliqué dans la régulation de la protéine signalant de mTOR/autophagie dans le cartilage articulaire. Ces résultats contournent PPARγ et sa signalisation en aval de mTOR/autophagie en tant que cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement de l'arthrose. / Osteoarthritis (OA) is an age related degenerative joint disease with unknown pathogenesis. Recent studies suggest that the activation of the transcription factor Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma (PPARγ) is a therapeutic target for OA. Agonists of PPARγ inhibit inflammation and reduce the synthesis of cartilage degradation products both in vitro and in vivo. However, studies using agonists of PPARγ do not elucidate the exact effects mediated by this complex gene. Indeed, some of these agonists have the ability to regulate, in vivo, various other signaling pathways independent of PPARγ, resulting in serious side effects. It is therefore vital, in order to achieve therapeutic efficacy with potentially less safety concerns, to elucidate the exact in vivo role of PPARγ in OA pathophysiology. Thus, the aim of my PhD project was to determine the specific in vivo role of PPARγ in OA pathophysiology using cartilage-specific PPARγ knockout (KO) mice and subjecting these mice to surgical model of OA. I generated two separate PPARγ KO mice harboring a (a) constitutive cartilage-specific germ-line deletion of PPARγ gene for developmental and age-related OA study and (b) inducible cartilage-specific deletion of PPARγ in adult mouse specifically for OA studies using LoxP Cre system. Previous study in my laboratory using germ-line PPARγ KO mice shows that these mice exhibit cartilage developmental defects. I further explored if these mice which exhibit early developmental defects have any phenotypic changes in the articular cartilage during ageing. My results showed that adult PPARγ KO mice exhibited a spontaneous OA phenotype associated with enhanced cartilage degradation, hypocellularity, synovial fibrosis, and increased expression of catabolic and inflammatory factors. This study showed that PPARγ is a critical regulator of cartilage health, the lack of which leads to an accelerated spontaneous OA phenotype (Vasheghani et al, 2013; American Journal of Pathology). From this aim of the study, I could not ascertain if cartilage-specific germline PPARγ KO mice exhibited spontaneous OA because of developmental defects or as a result of PPARγ deficiency. To bypass the developmental defects, I then generated inducible cartilage-specific PPARγ KO mice using Col2rTACre system and subjected these mice to destabilization of medial meniscus (DMM) model of OA surgery. My results revealed that PPARγ KO mice showed accelerated cartilage degradation, hypo-cellularity, synovial fibrosis and increased expression of catabolic and inflammatory factors during OA. Loss of chondrocyte cellularity within the articular cartilage is one of the critical events that initiate the degradation of the cartilage during OA. Recent studies suggest that the process of autophagy, a form of programmed cell survival, is impaired during OA and may contribute towards decreased chondro-protection resulting in cartilage degradation. Thus, I further explored the role of PPARγ in chondro-protection by determining the effect of PPARγ deficiency in the cartilage on the expression of mTOR (master negative regulator of autophagy) and autophagy genes during OA. My results revealed that PPARγ-deficient chondrocytes exhibit significantly enhanced expression of mTOR and decreased expression of genes that initiate autophagy process compared to chondrocytes extracted from control OA mice. I then hypothesized that PPARγ controls mTOR/autophagy signaling and ultimately the fate of chondrocytes and the expression of catabolic and inflammatory factors in the articular cartilage. To test this, I transfected PPARγ KO OA chondrocytes with PPARγ expression vector to determine if restoration of PPARγ expression can rescue the phenotype of PPARγ KO OA cells. I observed that restoration of PPARγ expression in PPARγ KO cells significantly down-regulated the expression of mTOR and up-regulate the expression of autophagy genes along with significant rescue in the expression of collagen type II and aggrecan and significant down-regulation in the expression of critical catabolic and inflammatory markers. To validate our in vitro finding that enhanced mTOR signalling and resultant decrease in autophagy is responsible for accelerated OA phenotype observed in PPARγ KO mice, I generated inducible cartilage-specific PPARγ-mTOR double KO mice and subjected these mice to DMM model of OA. My results clearly demonstrate that PPARγ-mTOR double KO mice exhibit significant protection against DMM-induced OA associated with significant protection from cartilage destruction, proteoglycan loss and loss of chondro-cellularity compared with control mice. Since mTOR is a major repressor of autophagy, I found that the expression of two critical autophagy markers (ULK1 and LC3B) was significantly elevated in PPARγ-mTOR double KO mice compared to control mice. My in vitro rescue studies using PPARγ expression vector and in vivo studies using PPARγ- mTOR double KO mice clearly show that PPARγ is involved in the regulation of mTOR/autophagy signalling in the articular cartilage. Therefore, deficiency of PPARγ upregulates mTOR signalling resulting in the suppression of autophagy and decreased chondroprotection and increased catabolic activity leading to accelerated severe OA. This study for the first time provides direct evidence on the role of PPARγ in chondroprotection by modulation of mTOR/autophagy signalling in the articular cartilage. These findings outline PPARγ and its downstream signalling by mTOR/autophagy as potential therapeutic targets for the treatment of OA.

Le traitement au froid en post-récolte (TPR) des ananas (Ananas comosus. (L). M) destiné à ralentir la sénescence des fruits, induit « le brunissement interne de l'ananas » (BI). Afin d'étudier des gènes susceptibles de discriminer les variétés tolérantes, une comparaison entre des fruits frais ou soumis au TPR a été réalisée pour 4 variétés d'ananas différant par leur tolérance au BI. D'après les résultats, en réponse au TPR l'absence de symptômes de BI est associée à une « tolérance membranaire » et à une faible activité de la polyphenol oxydase. L'étude de l'activité de la phenylalanine ammonia-lyase et de l'ascorbate peroxidase a révélé que le froid induit une stimulation de l'activité de ces enzymes chez une variété sensible au BI. L'étude du catabolisme protéique a montré que la tolérance des fruits au BI était liée : à la sous-expression du gène d'une protéase à cystéine, et à une sur-expression de gènes codant une cystatine et une protéase à acide aspartique, dont l'ADNc a été caractérisé et cloné pour la première fois chez l'ananas. L'expression différentielle de ces gènes indique qu'ils pourraient être utilisés pour le criblage par PCR de variétés dans les programmes d'améliorations de l'ananas pour la résistance au BI / Pineapple fruits (Ananas comosus. (L). M) require postharvest chilling treatment (PCT) in order to extend the postharvest fruit quality during shipping exportation. However PCT induces an injury known as blackheart (BH), or fruit browning, which is characterized by the appearance of brown spots in the flesh. This work has focused on the study of the development of BH physiopathy in the context of postharvest treatment in 4 pineapple varieties differing in their resistance to BH. Results showed that BH was associated with high membrane tolerance, low activity of polyphenol oxidase and absence of the related isoforms. Under chilling stress, the activities of both phenylalanine ammonia-lyase and ascorbate peroxidase were enhanced in the BH susceptible variety. Various genes involved in protein catabolism under abiotic stress were also studied. BH resistance was shown to be linked to the down-regulation of a major cystein protease and to the up-regulation of cystatin, the natural inhibitor of cystein protease. An aspartic acid protease, isolated and sequenced for the first time in pineapple, was also studied. Opposed to cystein protease, the expression and activity of the aspartic acid protease was directly related to BH resistance. Taken together, the results gathered by this work suggest that these genes could provide useful molecular markers for PCR variety screening in breeding programs aimed at improving pineapple BH resistance

L’arthrose (OA) est une maladie articulaire dégénérative à l’étiologie complexe et diverse. Les travaux de ces dernières années ont démontré que l’OA est une pathologie affectant tous les tissus de l’articulation incluant le cartilage, la membrane synoviale et l’os sous-chondral. L’OA se traduit par une déstructuration et une perte de fonctionnalité de l’articulation, et est principalement caractérisée par une perte de cartilage articulaire. L’inflammation de la membrane synoviale joue un rôle déterminant dans la progression de l’OA, toutefois elle serait secondaire à la dégradation du cartilage. De plus, l’os sous-chondral est également le siège de nombreuses transformations lors de l’OA. Il est fortement suggéré que ces changements ne correspondent pas seulement à une conséquence, mais pourraient être une cause du développement de l’OA impliquant une communication entre ce tissu et le cartilage. Il est maintenant bien établi que les voies inflammatoires et cataboliques jouent un rôle crucial dans l’OA. C’est pourquoi, nous avons étudié l’implication d’une nouvelle famille de récepteurs membranaires, les PARs, et plus particulièrement le PAR-2 dans les voies physiopathologiques de l’OA. Notre hypothèse est que l’activation de PAR-2 au cours de l’OA est un phénomène majeur du développement/progression de la maladie faisant du récepteur PAR-2 un candidat privilégié pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblant non seulement le cartilage mais aussi l’os sous-chondral. Pour cette étude, nous avons travaillé in vitro avec des chondrocytes (Cr) et des ostéoblastes (Ob) OA respectivement du cartilage et de l’os sous-chondral du condyle fémoral humain. Nos résultats ont démontré que PAR-2 était plus exprimé dans les Cr et les Ob OA que dans les cellules normales. Par ailleurs, PAR-2 est régulé positivement par certains facteurs retrouvés au cours de l’OA comme l’IL-1β, le TNF-α et le TGF-β dans les Cr OA, et par l’IL-1β, le TNF-α et la PGE2 dans les Ob OA. De plus, les principaux facteurs cataboliques et inflammatoires, soit la MMP-1, la MMP-13 et la COX-2 sont produits en quantité plus élevée suite à l’activation du récepteur dans le cartilage OA. De même, l’activation de PAR-2 dans les Ob OA conduit à une production accrue de facteurs pro-résorptifs tels que RANKL, l’IL-6, la MMP-1 et la MMP-9, et à l’augmentation de l’activité pro-résorptive de ces cellules. En outre, dans les deux types tissulaires étudiés, l’activation de PAR-2 augmente l’activité de certaines protéines de la famille des MAPKinases comme Erk1/2, p38 et JNK. Finalement, nous avons conclu notre étude en employant un modèle in vivo d’OA induite chez la souris sauvage et déficiente pour le gène PAR-2. Nos résultats ont démontré que l’absence d’expression et de production de PAR-2 influençait le processus inflammatoire et les changements structuraux affectant à la fois le cartilage et l’os sous-chondral, conduisant à un ralentissement du développement de l’OA. Nos travaux de recherche ont donc permis de montrer que le récepteur PAR-2 est un élément majeur du processus OA en agissant sur les voies cataboliques et inflammatoires du cartilage, et sur le remodelage tissulaire de l’os sous-chondral. Mots-clés : Arthrose, chondrocyte, cartilage, ostéoblaste, os sous-chondral, PAR-2, MMPs, COX, ILs, RANKL, résorption osseuse, MAPKinase, catabolisme, inflammation / Osteoarthritis (OA) is a complex degenerative articular disease. Recent studies have shown that OA is a pathology affecting all the tissues of the joint including the cartilage, the synovial membrane and the subchondral bone. OA is regarded as destruction and a loss of functionality of joint, and is mainly characterized by a loss of articular cartilage. The synovial inflammation also plays a key role in the progression of OA; however, it is believed to be secondary to cartilage degradation. In addition, there are also in the subchondral bone numerous changes which occur during the course of the disease. It is strongly suggested that these changes in subchondral bone are not just a consequence but could be a cause of the development of OA, thus involving a cross-talk between this tissue and the cartilage. It is now well established that inflammatory and catabolic pathways play a crucial role during OA. This is why we have engaged the study of the involvement of a new family of membranous receptors, the PARs, and more particularly PAR-2 during the pathophysiological process of OA. Our hypothesis is that PAR-2 activation during OA course is a major phenomenon for the development/progression of the disease, and that PAR-2 seems a suitable candidate for the development of new therapeutic approaches targeting not only the cartilage but also the subchondral bone. Thus, we have performed in vitro studies on OA chondrocyte (Cr) and osteoblasts (Ob) cells issued respectively from human femoral condyle cartilage and subchondral bone. Our results showed that PAR-2 was expressed at a higher level in the OA Cr and Ob compared to normal cells. Moreover, PAR-2 is found to be positively regulated by some factors present during the course of OA, such as IL-1β, TNF-α and TGF-β in the OA Cr, and IL-1β, TNF-α and PGE2 in the OA Ob. In addition, the main catabolic and inflammatory factors including MMP-1, MMP-13 and COX-2 are enhanced following PAR-2 receptor activation in the OA cartilage. Similarly, the activation of PAR-2 in OA Ob lead to an increased production of pro-resorptive factors such as RANKL, IL-6, MMP-1 and MMP-9, and an increased pro-resorptive activity of these cells. In addition, in both tissue types, PAR-2 activation increases the activity of certain protein MAPKinases family such as Erk1/2, p38 and JNK. Finally, we have performed an in vivo study using an OA induced model in wild-type and PAR-2 gene knock-out mice. Our results demonstrated that the absence of PAR-2 expression and production influenced the inflammatory process and structural changes affecting the cartilage and the subchondral bone, leading to a slowing down of OA development. Our research investigation have bring to light that PAR-2 receptor is a key element during OA process by acting on the cartilage catabolic and inflammatory pathways as well as the tissue remodelling of the subchondral bone. Keywords : Osteoarthritis, chondrocyte, cartilage, osteoblast, subchondral bone, PAR-2, MMPs, COX, ILs, RANKL, bone resorption, MAPKinase , catabolism, inflammation