Il est connu que la grosseur d'une lipoprotéine est déterminée par sa composition lipidique. Celle-ci peut être modifiée par la captation sélective d'esters de cholestérol (EC) par le scavenger receptor class B type 1 (SR-BI). Comme montré par Brodeur et al. (2005), la captation sélective permet de diminuer la taille de la lipoprotéine de faible densité (LDL). Il devenait donc important de déterminer si la perte d'esters de cholestérol, subséquente à la captation sélective par SR-BI, permettrait une modification assez importante de la LDL afin de favoriser le métabolisme de la lipoprotéine par la voie de captation globale. Les sous-classes de LDL ont une composition lipidique différente. Cette différence pourrait être produite par une activité plus ou moins grande de captation sélective par le SR-BI. Les sous-classes ont été caractérisées par dosage enzymatique, migration sur gel et essai in vitro sur la lignée cellulaire Hep G2. Par la suite, le but était de développer un modèle in vitro, chez des cellules Hep G2, et in vivo, chez des rats Sprague-Dawley, des souris CD 1 et chez des souris C57BL/6, pour permettre la production de LDL étant appauvries en EC par la captation sélective. Pour ce faire, des LDL ont été exposées à des cellules Hep G2 ou encore injectées dans l'animal puis récupérées par ponction cardiaque pour ensuite être à nouveau isolées. Les LDL modifiées in vivo et in vitro ont été caractérisées par dosage enzymatique, migration sur gel et essai in vitro sur la lignée cellulaire Hep G2. L'étude des sous-classes a démontré qu'une diminution en EC permet une augmentation de la captation globale en augmentant l'association protéique et la dégradation de la sous-classe III. Ceci est bénéfique pour l'organisme. Pour ce qui est de la portion de l'étude in vitro, celle-ci n'a pas donné de résultats concluants. Cette production de LDL a permis de diminuer la quantité d'EC composant la LDL. Par contre, cette diminution est observable tant en présence qu'en absence de cellules Hep G2. Donc cette diminution n'est pas nécessairement due à l'action de la captation sélective. La production in vivo de LDL appauvries en EC chez le rat Sprague-Dawley a démontré une diminution de la quantité d'EC composant les lipoprotéines. Par contre, cette diminution s'accompagne d'une forte diminution en triglycérides (TG) due à l'activité de la lipoprotéine lipase qui est présente dans l'animal. La diminution en TG ne voulant pas être étudiée, ceci faisait du rat un modèle moins intéressant à utiliser. La souris CD 1 a elle aussi permis la production de LDL appauvries en EC, par contre si l'on regarde au niveau de ses caractéristiques celles-ci sont plus chargées, ce qui pourrait indiquer un début d'oxydation et un métabolisme dont la captation globale serait diminuée et la captation sélective augmentée. Ainsi, en se fiant aux résultats des sous-classes, la captation sélective serait bénéfique pour le métabolisme des LDL. Par contre, les résultats obtenus par la production in vivo semblent dire que les LDL produites sont plus susceptibles à l'oxydation, ce qui serait néfaste. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : LDL, SR-BI, Captation sélective, Oxydation, Sous-classe.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les stéroïdes anabolisants androgènes peu acides ou basiques ne permettent pas d’obtenir des signaux importants lors de leur analyse par spectrométrie de masse électrospray (ESI-MS), rendant ainsi leur détection compliquée par l’utilisation de cette technique. Bien que certains stéroïdes puissent être analysés de manière adéquate avec des méthodes d’analyse antidopage classiques comme la chromatographie en phase gazeuse (GC) couplée à la MS avec une source d’ionisation électronique (EI), il reste un besoin pour le développement d’une méthode qui soit capable de détecter efficacement les composés plus difficiles, c’est-à-dire ceux qui sont moins susceptibles de s’ioniser en ESI. Pour résoudre ce problème l’approche envisagée se base sur l’addition d’anions (sous forme de sel d’ammonium) à des stéroïdes anabolisants comme principe pour le développement d’une méthode analytique de détection de ces composés. Il a été confirmé que les limites de détection instrumentales obtenues avec ces anions sont plus basses qu’en comparaison des mêmes analyses sans additif en ESI positif ou négatif. Les étapes de développement de cette méthode basée sur la chromatographie en phase liquide (LC) couplée à la MS en tandem sont également présentées. Les résultats obtenus sur des échantillons en matrice urinaire démontrent que l’attachement anionique apporte une nouvelle approche prometteuse pour la détection des stéroïdes en contrôle antidopage. De plus, des expériences sur des stéroïdes bifonctionnels comme la 5-α-pregnan-3α,20β-diol ou la d4-17,21,21,21-pregnenolone réduite ont permis de mieux appréhender les facteurs qui permettent que l’attachement préférentiel d’un anion donné puisse se faire sur une région spécifique de la molécule, i.e. que l’attachement anionique soit « régiosélectif ». La fragmentation des adduits anioniques de stéroïdes bifonctionnels en MS en tandem a montré des voies de décomposition produisant des ions produits caractéristiques de chaque anion. La détermination d’acidités en phase gazeuse obtenues par des calculs de chimie théorique a également permis d’apporter une nouvelle lumière sur le comportement des adduits anion-stéroïde. / Androgenic anabolic steroids that are neither acidic or basic do not provide strong signals for their analysis by electrospray mass spectrometry (ESI-MS), making their detection difficult with the use of this technique. Although some steroids can be adequately analysed by standard antidoping analytical methods, such as gas-phase chromatography mass spectrometry (GC-MS) with an electron ionization source (EI), there is nonetheless a need for the development of the method that could efficiently detect more difficult compounds, i.e. the least likely to ionize by ESI. In order to solve this problem, the chosen approach is based on addition of anions (found as ammonium salts) to anabolic steroids as principle for the development of an analytical method for the detection of those compounds. It was confirmed that the instrumental limits of detection obtained with the anions were lower compared to the same analyses without additive in positive or negative ESI. The steps for this method development based on liquid-phase chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS) are also presented. The results obtained on samples in urine matrice have shown that anion attachment brings a new promising approach for steroid detection in antidoping control. Furthermore, experiments on bifonctionnal steroids such as 5-α-pregnan-3α,20β-diol or reducted d4-17,21,21,21-pregnenolone have brought light on the factors that dictate preferential attachment of a given anion.

Le récepteur scavenger de classe B type 1 (SR-BI) est essentiel au transport inverse du cholestérol puisqu'il en effectue la dernière étape: la captation sélective (CS) des esters de cholestérol (EC) à partir des lipoprotéines, c'est-à-dire l'internalisation de leurs EC sans dégradation de leur portion protéique. Au niveau hépatique, ce mécanisme d'importance demeure cependant mal défini. Nous avions déjà montré qu'un mécanisme de rétroendocytose était responsable de la CS dans des cellules HepG2 et que la CS dépendait de la localisation membranaire du SR-BI. Ici, nous vérifions si des voies d'endocytose, qui sont indépendantes de la clathrine et dépendent de microdomaines membranaires comme les radeaux lipidiques, ne pourraient pas expliquer l'activité du SR-BI à l'égard des LDL et HDL). Le traitement des cellules avec des inhibiteurs «classiques» de l'endocytose (NH4 CI: choc hyperosmotique, privation d'ATP, chlorpromazine (CPZ), puis le traitement avec des inhibiteurs différentiant ces voies selon qu'elle dépendent ou non de la dynamine-2 (dynasore) ou de GTPases de la famille de Rho (sous unité B de la toxine de C. difficile (CDTxB)) révèlent que le SR-BI ne se conduit pas de façon identique à l'égard des deux ligands. Les résultats indiquent que la CS des EC-HDL), de par sa sensibilité aux NH4CI et CPZ et par son augmentation en présence de dynasore ou de CDTxB, serait effectuée par endocytose suivant une voie dépendant de la clathrine et qu'elle pourrait être régulée négativement par une voie dépendant de RhoA. La CS des EC-LDL, sensible à la CPZ et augmentée par la CDTxB, pourrait dépendre, elle, d'une voie d'endocytose régulée par Cdc42 ou la flotilline. En somme, les résultats permettent une caractérisation plus approfondie de la CS et les différences de régulation de la CS envers les deux principales classes de lipoprotéines chez l'humain s'ajoutent à celles déjà mises en évidence par nous. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : lipoprotéines, cholestérol, endocytose indépendante de la clathrine, radeaux lipidiques, cellules hépatiques

Les mitochondries du cortex surrénal contiennent un cytochrome P-450 impliqué dans la réaction de 11beta-hydroxylation des stéroides qui est semblable au cytochrome P-450 trouvé dans les microsomes. Les membranes externes et internes des mitochondries de cortex surrénal ont été séparées après centrifugation sur un gradient de densité de saccharose et différenciées sur la base de leur morphologie et de la distribution d'enzymes caractéristiques. Le système enzymatique de 11beta-hydroxylation est strictement confiné aux membranes internes. L'absence de cytochrome P-450 dans la membrane externe est une différence significative avec les microsomes du cortex surrénal. L'utilisation du ferricyanure comme accepteur d'électrons non pénétrant montre que le cytochrome P-450 impliqué dans la 11beta-hydroxylation de la désoxycorticostérone est situé du côté matriciel de la membrane interne mitochondriale.<br />La fixation de la désoxycorticostérone et du métyrapol, un inhibiteur de l'hydroxylation des stéroïdes, a été mesurée sur les mitochondries de cortex surrénal. Des sites de forte affinité (N = 0,5 nmol/mg de protéine et de Kd = 7,5 x 10-9 M) pour le métyrapol ont été trouvés seulement dans la membrane interne mitochondriale et ceci est en accord avec la localisation du cytochrome mitochondrial P-450 dans la même membrane. Le nombre de sites de fixation du métyrapol est semblable au nombre de sites de haute affinité trouvés pour les stéroïdes qui sont des substrats de la 11beta-hydroxylase. Cette valeur est voisine de la moitié de la quantité du cytochrome mitochondrial P-450 (1,1 nmol/mg de protéine) supportant la présence de deux types de cytochrome P-450 dans des mitochondries de cortex surrénal, un pour la 11beta-hydroxlation et un autre pour la coupure de la chaîne latérale du cholestérol.

Les hormones stéroïdiennes sont synthétisées à partir du cholestérol par l'action successive de plusieurs enzymes, dont les hydroxystéroïdes déshydrogénases de la superfamille des aldo-ceto réductases (AKRs). Le message véhiculé par les hormones peut ensuite être interprété par les cellules qui expriment les récepteurs capables de les reconnaître et les lier spécifiquement. Une nouvelle AKR, la 17a-HSD de souris (ml7oc- HSD), a récemment été caractérisée et est actuellement l'unique enzyme connue capable de réduire stéréospécifiquement l'androstenedione (A4) en épi-testostérone, le 17oc-épimère de la testostérone. Les autres AKRs humaines dont l'activité permet de réduire la fonction cétone en position 17 du A4, notamment les h20a-HSD, h3oc-HSD3 et hl7p-HSD5, forment de la testostérone, le 17P-épimère. La comparaison structurale de ces enzymes très homologues a permis d'identifier les déterminants moléculaires responsables de leur 17a/17P-stéréospécificité, dont le résidu alanine en position 24, chez la ml7a-HSD. Nous avons également montré que ce résidu était aussi impliqué dans le maintien du NADPH par l'enzyme. Nous avions aussi de l'intérêt pour une autre enzyme de la superfamille des AKRs, la 5P-réductase humaine, qui est la seule connue à ce jour pouvant réduire la double liaison des A4-3-céto-stéroïdes afin de les transformer en leur composé 5P-réduit correspondant. Bien que les stéroïdes 5P~réduits jouent un rôle très important dans plusieurs processus physiologiques, aucune étude n'avait encore permis la caractérisation cinétique et structurale de cette enzyme. La structure cristallographique de la h5préductase a précisé le rôle des résidus formant son site actif ainsi que son mécanisme catalytique. Un site alternatif de liaison du stéroïde responsable du phénomène d'inhibition par le substrat observé pour cette enzyme a aussi été caractérisé. Enfin, cette thèse décrit la structure cristallographique du récepteur humain des androgènes (hAR) en complexe avec le EM5744, une molécule synthétique spécifiquement dessinée pour bloquer le fonctionnement normal de ce récepteur. Nos travaux ont montré pourquoi la longue chaîne du EM5744, malgré l'encombrement structural qu'elle génère au coeur même du récepteur, ne suffit pas à altérer les fonctions du hAR. En s'appuyant sur nos résultats, la structure de cette molécule pourra être modifiée jusqu'à ce qu'elle possède les propriétés désirées.

OBJECTIF: Déterminer si un régime de Bicalutamide et de Dutasteride est d’efficacité similaire à un régime standard pour la cytoréduction prostatique avant une curiethérapie prostatique par implants permanents et comparer la toxicité de ces deux régimes. MÉTHODE Les patients avec un adénocarcinome de la prostate traités par curiethérapie prostatique ayant un volume prostatique initial de plus de 50 cc ont été randomisés soit à un régime de Bicalutamide 50 mg die, de Dutasteride 0.5 mg die et de tamoxifen 10 mg die pour prévenir la gynécomastie (Groupe expérimental = GE) versus un agoniste de la LHRH (dose de 3 mois) avec du Bicalutamide 50 mg die pour 1 mois (Groupe contrôle = GC). Le volume prostatique total (VPT) a été mesuré à la randomisation (t1) et environ 2.5 mois après le début du traitement de cytoréduction (t2). La curiethérapie par implant permanent d’I-125 à été réalisé environ 3 mois après la randomisation. Le changement de VPT relatif en % à été comparé entre les groupes. Des questionnaires EPIC (Expanded Prostate Index Composite) ont été complétés au t1, t2, ainsi qu’à 6 semaines (t3), 3 mois (t4) et 6 mois (t5) post-curiethérapie. Le profil de changement des scores sexuels et hormonaux du questionnaire EPIC a été évalué de façon qualitative. RÉSULTATS Les premiers 11 patients randomisés dans l’étude ont été analysés (GE n=5, GC ; n=6). Les caractéristiques de base entre les deux groups étaient similaires. Tous les patients présentaient des caractéristiques de cancer de prostate de bas risque (APS&lt; 10, Stade clinique ≤T2a et un score de Gleason ≤6). Le VPT médian au t1 était de 51,00 cc dans le GE et de 55,56 cc dans le GC. Les diminutions médianes entre le volume t1 et le volume t2 en absolu étaient de 18,46 cc dans le GE et de 24,61 cc dans le GC (valeur-p au test exact de Wilcoxon 0,03). Pour ce qui est de la médiane de changement relatif de volume entre t1 et le volume au t2, celles-ci étaient de 36,44 % dans le GE et de 40,83 % dans le GC (valeur-p 0,25). Tous les 11 patients ont pu subir la curiethérapie sans interférence de l’arche pubienne et avec des paramètres dosimétriques acceptables. Les médianes de scores de fonction sexuelle et de sommaire hormonal semblent qualitativement démontrer un meilleur profil au sein du GE. DISCUSSION Cette analyse exploratoire n’a pas la puissance suffisante pour permettre de rejeter ou d’affirmer une hypothèse de non-infériorité du régime expérimental du point de vue de la cytoréduction prostatique. Toutefois, ce régime a permis à tous les patients de subir la curiethérapie sans interférence de l’arche pubienne et avec des paramètres dosimétriques acceptables. Le Bicalutamide et le Dutasteride ont aussi démontré un profil de toxicité favorable. Les résultats de cette analyse précoce justifient donc de continuer à randomiser des patients au sein de cette étude mais ne permettent pas de tirer des conclusions définitives en raison de la petite taille d’échantillon. / OBJECTIVE: To determine if a regimen of Bicalutamide and Dutasteride is of similar efficacy compared to a standard regimen for prostate cytoreduction prior to permanent implant prostate brachytherapy and to compare toxicity for both of these regimens MATERIALS AND METHODS Patients with an adenocarcinoma of the prostate treated with permanent implant brachytherapy having an initial total prostate volume of 50 cc or more were randomized to either Bicalutamide 50 mg daily, Dutasteride 0.5 mg daily and Tamoxifen 10 mg daily (Experimental group = EG) or an LHRH agonist (3 month dose) and Bicalutamide 50 mg daily for one month (Control Group = CG). Total prostate volume (TPV) was evaluated at time of randomization (t1) and approximately 2.5 months after the start of cytoreductive therapy (t2). Permanent implant I-125 brachytherapy was completed 3 months after randomization. Relative TPV change in % and absolute TPV change in cc were compared between groups. Expanded Prostate Index Composite questionnaires were completed by patients at t1, t2, as well as at 6 weeks (t3), 3 months (t4), and 6 months (t5). Profile changes in EPIC sexual and hormonal domains were evaluated qualitatively. RESULTS The first 11 patients registered for the study were analyzed (EG n=5; CG n=6) Baseline parameters were similar between groups. All patients had low risk characteristics (PSA &lt; 10, Clinical stage ≤T2a and Gleason score ≤6). Median baseline TPV was 51.00 cc in EG and 55.56 in CG. Median reduction in absolute TPV was 18.46 cc in EG and 24.61 in CG (Wilcoxon exact test p=0.03). As for median relative change in TPV, this was 36.44 % in EG and 24.61 cc in CG (p=0.25). All 11 patients were able to undergo brachytherapy without pubic arch interference and with acceptable dosimetric parameters. Median EPIC of both sexual and hormonal domains of the EPIC questionnaire seemed to favor the EG over time. DISCUSSION This early exploratory analysis does not have sufficient power to reject or accept the hypothesis of non-inferiority the experimental regimen for prostate volume reduction. Nonetheless, this regimen allowed brachytherapy without pubic arch interference and with acceptable dosimetric parameters. The experimental regimen of Bicalutamide and Dutasteride also seemed to show a favorable toxicity profile. The results of this early analysis thus justify continued randomization for the study but do not allow definitive conclusions due to small sample size.

L’accident vasculaire cérébral (AVC) déclenche une cascade de changements qui conduisent à la mort cellulaire mais aussi des processus endogènes de protection en réponse à l'ischémie. La compréhension de ces processus est très importante pour le développement d’agents neuro-protecteurs potentiels qui peuvent être seulement des amplificateurs des processus endogènes. Le traitement par la progestérone est neuro-protecteur dans des modèles expérimentaux d’occlusion de l'artère cérébrale moyenne (MCAO). Cependant, des niveaux endogènes significatifs de progestérone sont mesurables dans le cerveau de souris mâles et femelles.Le but de notre travail était d'étudier: 1) les effets de l’ischémie sur les niveaux endogènes des stéroïdes et le rôle des récepteurs de la progestérone (PR) à la phase aiguë après ischémie chez les souris jeunes adultes et âgées des deux sexes; 2) la base cellulaire de la neuroprotection par la progestérone après ischémie et le rôle de PR neural. Nous avons utilisé un modèle d’ischémie expérimentale (MCAO); une lignée transgénique de souris (PRNesCre) dans laquelle l’expression de PR a été sélectivement invalidée dans les cellules neurales; la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse en tandem (GC-MS/MS); et des analyses histologiques, comportementales, et d’immunofluorescence.Dans la première partie, nous avons montré que dans le cerveau de souris mâles la progestérone est principalement convertie en 5a-dihydroprogestérone (5a-DHP), qui est un agoniste naturel de PR. Après MCAO, les niveaux de progestérone et de 5a-DHP cérébrales augment chez les mâles, mais pas chez les femelles. En revanche, les femelles peuvent utiliser l’inter-conversion de la 20a-dihydroprogestérone et de la progestérone pour réguler la disponibilité des pregnanes actifs au niveau de PR. De plus, les souris PRNesCre, mâles et femelles jeunes adultes et âgées, ont des infarctus plus grands et des déficits sensori-moteurs plus importants ainsi qu’une diminution de la densité des neurones et de la microglie activée comparativement aux souris témoins PRloxP/loxP. En outre, nos résultats ont révélé des différences liées au sexe chez les souris jeunes, mais pas chez les souris âgées. Dans la deuxième partie de l'étude, nous avons montré que, chez les souris mâles PRloxP/loxP, le traitement par la progestérone améliore la récupération fonctionnelle et réduit le volume de l'infarctus. Dans le péri-infarctus, la progestérone augmente la densité des neurones, des oligodendrocytes et de leurs précurseurs, et diminue la densité des astrocytes et de la microglie activée, et l'expression de l’aquaporine 4. Ces effets de la progestérone n’ont pas été observés chez les souris PRNesCre.Nos résultats montrent 1) l'importance des pregnanes endogènes et du PR neural pour la protection cérébrale à la phase aiguë précoce après une ischémie; 2) que le traitement par la progestérone chez les souris mâles après ischémie a des effets neuro-protecteurs, pro-myélinisants et anti-inflammatoires et que PR neural est requis pour la médiation de ces effets. Ces données suggèrent fortement que les ligands de PR ou des agents ciblant leur signalisation en aval pourraient être développés pour la neuro-protection après un AVC. / Ischemic stroke initiates a cascade of changes that lead to cell death and also coordinates endogenous processes that counteract the nocuous consequences of ischemia. Understanding these processes is very important for the development of potential neuroprotectants which can be just boosters of endogenous processes. Treatment with exogenous progesterone is neuroprotective after middle cerebral artery occlusion (MCAO). However, the male and female brains contain significant amounts of endogenous progesterone.The aim of our work was to study: 1) the effects of MCAO on the endogenous levels of steroids and the role of neural progesterone receptors (PR) at the acute phase after stoke in young and aging mice of both sexes; 2) the cellular basis of the neuroprotection by progesterone following stroke and the role of neural PR. We used an in vivo model of MCAO; a transgenic mice line (PRNesCre) selectively lacking the expression of PR in neural cells; gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS); and histological, behavioral, and immunofluorescence analyses.In the first part of the study, we showed that in the male mouse brain, progesterone is mainly converted to 5a-dihydroprogesterone (5a-DHP), which is a natural PR agonist ligand. After MCAO, brain levels of progesterone and 5a-DHP are rapidly upregulated in males but not in females. In contrast, females may use the interconversion of 20a-dihydroprogesterone and progesterone for regulating the availability of PR-active pregnanes. Moreover, young and aging male and female PRNesCre mice exhibited increased infarcts, severe sensorimotor deficits, and decreased densities of neurons and microglia comparatively to age-matched control mice PRloxP/loxP. In addition, our results revealed sex differences in stroke outcomes in young but not in aging mice. In the second part of the study, we showed that, in male PRloxP/loxP mice, progesterone improved sensorimotor outcomes and reduced infarct volumes. In the peri-infarct, progesterone increased the densities of neurons, oligodendrocytes and their precursors, decreased the densities of activated astrocytes and microglia, and the expression of the aquaporin 4. These beneficial effects of progesterone were not observed in PRNesCre mice.Our findings 1) uncover the importance of endogenous pregnanes and neural PR for the cerebroprotection at the early acute phase after stroke; 2) show that progesterone treatment in male mice has neuro-protectant, pro-myelinating and anti-inflammatory effects after MCAO and that neural PR is required for the mediation of these effects. These data strongly suggest that ligands of PR or agents targeting their downstream signaling could be developed for neuroprotection after stroke.