Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der unspezifischen Peroxygenase (UPO), einer ausschließlich von Pilzen produzierten Oxidoreduktase. Die Dissertation besteht aus drei wesentlichen Teilen: 1.) Untersuchungen zum Substratspektrum zweier ausgewählter UPOs, 2.) Untersuchungen zur Inaktivierung von UPOs, und 3.) die Etablierung einer Kaskadenreaktion von UPOs und pilzlichen Oxidasen zur Oxidation von Hydroxymethylfurfural (HMF) zu 2,5-Furandicarbonsäure (FDCA). 1) Oxidation ausgewählter organischer Schadstoffe Die Mehrheit der getesteten organischen Schadstoffe (35 von 44 chemischen Verbindungen, vgl. Tabelle 6), inklusive verschiedener Xenobiotika wie chlorierte Benzole und deren Derivate, halogenierte Biphenylether, Nitroaromaten, PAK und Phthalate, wurden durch lediglich zwei UPOs (AaeUPO und MroUPO) oxidativ umgewandelt und damit aktiviert. Die von den UPOs katalysierten Reaktionen waren durch drei Substrat-Eigenschaften limitiert: 1.) sterische Hemmung, u.a. infolge einer hohen Zahl an Substituenten (z.B. Hexachlorbenzol) oder aufgrund der grundsätzliche Sperrigkeit (Größe) des Substrat-Moleküls (z.B. 6-Ring-PAK wie Benzo[g,h,i]perylen), 2.) Inaktivierung des aromatischen Ringes durch elektronenziehende Gruppen (z.B. im Nitrobenzol) und 3.) geringe Bioverfügbarkeit und Wasserlöslichkeit. Während die Verhinderung der Oxidation durch geringe Löslichkeit und sterische Hemmung bereits von Peter (2013) und Poraj-Kobielska (2013) beschrieben wurden, stellt die Limitation durch Substrat-Deaktivierung, wie im Fall des Nitrobenzols, einen neuen Befund. 2) Inaktivierung von UPOs Für alle getesteten UPOs konnte eine intrinsische Katalase-Aktivität nachgewiesen werden, wobei deren Ausmaß unter den getesteten Enzymen stark variierte. So unterschieden sich die katalytischen Effizienzen der Katalase-Aktivität von AaeUPO und rCciUPO um eine Größenordnung, während die der MroUPO sich dazwischen einordnete. Im Rahmen der Untersuchungen konnte für die AaeUPO die Bildung eines reaktionsträgen Intermediats, der UPO-Compound III (cpd-3), nach Exposition gegenüber hohen H2O2-Konzentrationen, gezeigt werden. Außerdem wurde Biliverdin als Abbauprodukt der H2O2-katalysierten Oxidation des UPO-Häms detektiert (inaktivierende Spontan-Oxidation). Diese Verbindung entstand höchstwahrscheinlich durch die Reaktion des Häms mit Hydroxyl-Radikalen (•OH), die wiederum ein Ergebnis der Reaktion der UPO-cpd-3 und H2O2 waren. Als Quintessenz dieser Untersuchungen kann zusammenfassend festgestellt werden, dass es für den schonenden Einsatz und die optimale Performance der UPOs notwendig ist, ein „optimales Verhältnis“ bezüglich der Konzentrationen des Zielsubstrates, des UPO-Proteins und des Peroxids einzustellen. Dieses Verhältnis muss für jede UPO-Substrat-Kombination experimentell empirisch ermittelt werden, wobei als Faustregel gilt: Je niedriger die lokale/stationäre Cosubstrat-Konzentration (H2O2) im Reaktionsmedium ist, desto geringer wird die schädigende Wirkung auf die UPO ausfallen. 3) HMF-Oxidation durch UPOs und pilzliche Oxidasen in einer Kaskaden-Reaktion Obwohl die AaeUPO prinzipiell in der Lage ist, HMF und nahezu jedes seiner primären und sekundären Derivate (mit Ausnahme von 5-Hydroxymethyl-2-furosäure) zu oxidieren, verläuft die vollständige Oxidation nur wenig effizient; insbesondere der letzte Schritt von der 5-formyl-2-furosäure (FFCA) zur FDCA ist reaktionslimitierend. Unter einfachen Reaktionsbedingungen (einmalige Zugabe von H2O2) würde das Peroxid von der AaeUPO unproduktiv verbraucht und das Enzym größtenteils inaktiviert, ohne dass dabei substanzielle Mengen an FDCA gebildet würden. Erst durch die Kombination einer UPO mit geeigneten Oxidasen (Arylalkoholoxidase - AAO und/oder Galactoseoxidase - GAO) konnte die FDCA-Ausbeute substantiell erhöht werden (7,9 mM in 10 mL). Hierbei sind zusammenfassend folgende positive Effekte hervorzuheben: 1.) Oxidasen stellen geeignetes H2O2 für die UPOs bereit, 2.) nur die GAO kann auch intermediär gebildetes HMFCA oxidieren und 3.) durch die schonende Bereitstellung von H2O2 für die UPO verringert sich die lokale Konzentration des Oxidationsmittels soweit, dass eine Schädigung des Enzyms vermieden wird (bei gleichzeitiger substantieller FFCA-Oxidation). Auf dieser Grundlage konnte eine dreistufige enzymatische Synthese von FDCA aus HMF realisiert werden.

Unspecific peroxygenases (UPO, EC 1.11.2.1) secreted by fungi open an efficient way to selectively oxyfunctionalize diverse organic substrates, including less-activated hydrocarbons, by transferring peroxide-borne oxygen. We investigated a cell-free approach to incorporate epoxy and hydroxyl functionalities directly into the bulky molecule testosterone by a novel unspecific peroxygenase (UPO) that is produced by the ascomycetous fungus Chaetomium globosum in a complex medium rich in carbon and nitrogen. Purification by fast protein liquid chromatography revealed two enzyme fractions with the same molecular mass (36 kDa) and with specific activity of 4.4 to 12 U mg−1. Although the well-known UPOs of Agrocybe aegerita (AaeUPO) and Marasmius rotula (MroUPO) failed to convert testosterone in a comparative study, the UPO of C. globosum (CglUPO) accepted testosterone as substrate and converted it with total turnover number (TTN) of up to 7000 into two oxygenated products: the 4,5-epoxide of testosterone in β-configuration and 16α-hydroxytestosterone. The reaction performed on a 100 mg scale resulted in the formation of about 90 % of the epoxide and 10 % of the hydroxylation product, both of which could be isolated with purities above 96 %. Thus, CglUPO is a promising biocatalyst for the oxyfunctionalization of bulky steroids and it will be a useful tool for the synthesis of pharmaceutically relevant steroidal molecules.

Unspecific peroxygenases (UPO, EC 1.11.2.1) secreted by fungi open an efficient way to selectively oxyfunctionalize diverse organic substrates, including less-activated hydrocarbons, by transferring peroxide-borne oxygen. We investigated a cell-free approach to incorporate epoxy and hydroxyl functionalities directly into the bulky molecule testosterone by a novel unspecific peroxygenase (UPO) that is produced by the ascomycetous fungus Chaetomium globosum in a complex medium rich in carbon and nitrogen. Purification by fast protein liquid chromatography revealed two enzyme fractions with the same molecular mass (36 kDa) and with specific activity of 4.4 to 12 U mg−1. Although the well-known UPOs of Agrocybe aegerita (AaeUPO) and Marasmius rotula (MroUPO) failed to convert testosterone in a comparative study, the UPO of C. globosum (CglUPO) accepted testosterone as substrate and converted it with total turnover number (TTN) of up to 7000 into two oxygenated products: the 4,5-epoxide of testosterone in β-configuration and 16α-hydroxytestosterone. The reaction performed on a 100 mg scale resulted in the formation of about 90 % of the epoxide and 10 % of the hydroxylation product, both of which could be isolated with purities above 96 %. Thus, CglUPO is a promising biocatalyst for the oxyfunctionalization of bulky steroids and it will be a useful tool for the synthesis of pharmaceutically relevant steroidal molecules.