Doctor en Farmacología / Autorizada por el autor, pero con restricción para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas, hasta diciembre de 2014 / La insuficiencia cardiaca (IC) es una enfermedad caracterizada por alteraciones del metabolismo energético y la actividad mitocondrial del corazón, acompañada de una disminución del contenido cardiaco de ATP y alteraciones en los niveles de lípidos plasmáticos, evidenciado por un aumento de la concentración de palmitato, entre otros. Trimetazidina (TMZ) es un fármaco con eficacia antianginosa demostrada que actúa inhibiendo la β-oxidación (βox) de ácidos grasos. Evidencias previas de la literatura sugieren que TMZ es útil en pacientes con IC. Paralelamente, ha sido ampliamente descrito que palmitato ejerce efectos tóxicos a nivel celular en distintos modelos, incluyendo los cardiomiocitos, por mecanismos poco comprendidos actualmente. En vista de lo anterior, el objetivo de este trabajo consistió en evaluar los efectos de palmitato y TMZ sobre la morfología y función mitocondrial de los cardiomiocitos. De manera complementaria se estudió, además, el posible efecto protector de TMZ frente a la toxicidad por sobrecarga de palmitato. Para este fin, cardiomiocitos se aislaron de corazones de ratas neonatas, los cuales que se trataron con palmitato (2 y 25 nM libre entre 0 y 24h) y/o TMZ (0,1-100 μM por 24 h). Para evaluar los cambios morfológicos, las células se tiñeron con la sonda MitoTracker Green-FM y se visualizaron en un microscopio confocal. Para evaluar la función mitocondrial, se determinaron algunos parámetros metabólicos, entre los que se incluyó el consumo celular de oxígeno, mediante oxigrafía de Clark, los niveles intracelulares de ATP, mediante un kit comercial (CellTiter-Glo) y el potencial de membrana mitocondrial mediante citometría de flujo usando la sonda tetrametil rodamina metil éster. Además se evaluó la acumulación intracelular de lípidos con la sonda LipidTOX mediante microscopía de fluorescencia y la producción de ceramidas por medio de inmunofluorescencia indirecta. Los resultados mostraron que palmitato causó fisión mitocondrial, evidenciada como un aumento del 81% número de mitocondrias por célula (p<0,05, n=5) y una disminución del 51% del volumen mitocondrial promedio (p<0,01, n=5). Palmitato, además, causó una disminución del 18% en el consumo basal de oxígeno (p<0,05, n=3) y de un 16% en la producción intracelular de ATP (p<0,05, n=6). Paralelamente, TMZ produjo los efectos contrarios, es decir fusión mitocondrial evidenciada por una disminución del 44% en el número de mitocondrias (p<0,05, n=5) y un aumento en el 40% de su volumen promedio (p<0,05, n=5). Además, TMZ incrementó en un 15% el potencial mitocondrial (p<0,01, n=5), en un 18% el consumo basal de oxígeno (p<0,01, n=3) y el ATP intracelular en un 15% (p<0,01, n=6). De manera interesante, la preincubación con TMZ protegió a los cardiomiocitos de la fisión dependiente de palmitato. Respecto a los resultados de metabolismo, observamos la misma tendencia: palmitato disminuyó todos los parámetros metabólicos, mientras que TMZ los aumentó y la preincubación con TMZ protegió frente a los efectos de palmitato. De manera interesante, la preincubación con TMZ incrementó la acumulación de lípidos neutros al interior de las células evidenciada como un aumento 4,3 veces (p<0,05, n=6) en el número de gotas de lípido por célula de 4,7 veces el área total de lípidos (p<0,05, n=6). Ambos parámetros aumentaron más en presencia de palmitato y TMZ. Por otro lado, TMZ fue capaz de bloquear el aumento del 70% (p<0,01, n=5) en la producción intracelular de ceramidas inducida por palmitato. Del presente trabajo se concluye que palmitato indujo fisión y disfunción mitocondrial, mientras que TMZ sola causa fusión mitocondrial y potenciación metabólica, mientras que el pre tratamiento con TMZ protegió a los cardiomiocitos frente a la lipotoxicidad observada con palmitato. De estos resultados se desprende que el efecto beneficioso de TMZ en el tratamiento de IC podría depender de modificaciones de la función mitocondrial relacionadas al manejo de la sobrecarga celular de lípidos. Sin embargo, el mecanismo de acción específico requiere futuros estudios / Heart failure (HF) is a disease characterized by several alterations in cardiac metabolism and mitochondrial activity. This is accompanied by a decrease in cardiac ATP content and alterations in the levels of plasma lipids, evidenced by an increase in palmitate concentration, among others. Trimetazidine (TMZ) is an antianginal drug that inhibits fatty acid β-oxidation. Previous evidence suggests that TMZ could be helpful in the treatment of HF patients. In parallel, it has been greatly described that palmitate can exert toxic cellular effects in several models, including cardiomyocytes. However, the mechanism is poorly understood. Taking these evidences, the aim of the present study was to evaluate the effects of palmitate and TMZ on the mitochondrial morphology and function in cardiomyocytes. Additionally, we also evaluated the potential protective effect of TMZ on the toxicity induced by palmitate overload. In order to accomplish this, we isolated neonatal rat cardiomyocytes that were treated with palmitate (2 and 25 nM free, 0-24h) and/or TMZ (0.1-100 μM, 24 h). To assess changes in mitochondrial morphology, the cells were treated with MitoTracker Green FM and visualized under a confocal microscope. To analyze the changes in mitochondrial function, we determined some metabolic parameters including cellular oxygen consumption, by Clark oxygraphy, the intracellular levels of ATP, by a commercial kit (CellTiter-Glo) and the mitochondrial membrane potential by flow cytometry with the dye tetramethyl rhodamine methyl ester. Furthermore, the intracellular lipid accumulation was evaluated by fluorescence microscopy with the dye LipidTOX and the production of ceramides was evaluated by indirect immunofluorescence. Among the most relevant findings, we described that palmitate induced a significant mitochondrial fission evidenced by a 81% increase in the number of mitochondria per cell (p<0.05, n=5) and a 51% decrease in mitochondrial mean volume (p<0.01, n=5). Palmitate also induced a 18% decrease in the basal oxygen consumption rate (p<0.05, n=3), together with a 16% decrease in the intracellular ATP levels (p<0.05, n=6). On the other hand, TMZ had the opposite effects; it induced mitochondrial fusion by decreasing the number of mitochondria per cell (44%, p<0.05, n=5) and increasing their mean volume (40%, p<0.05, n=5). Additionally, TMZ increased by 15% the mitochondrial membrane potential (p<0.01, n=5), by 18% the basal oxygen consumption rate (p<0.01, n=3), and by 15% the intracellular ATP levels (p<0.01, n=6). The pretreatment with TMZ had a protective effect from the lipotoxic damage of palmitate by preventing mitochondrial fission. Relative to the metabolic findings, we report that palmitate induced a metabolic collapse evidenced by a decrease in all the parameters assessed, while TMZ had the opposite effects (increased metabolism) and protected from the palmitate-induced damage. Interestingly, the pretreatment with TMZ increased by 4.3 fold (p<0.05, n=6) the number of lipid droplets per cell and by 4.7 fold (p<0.05, n=6) the total lipid area. Both parameters further increased in the presence of palmitate and TMZ. On the other hand, TMZ was also able to blunt the 70% increase (p<0.01, n=5) in the intracellular ceramide production induced by palmitate. From the present report we conclude that palmitate induced mitochondrial fission and dysfunction, while TMZ alone causes mitochondrial fusion and metabolic potentiation. The pretreatment with TMZ protected the cardiomyocytes from palmitate-induced lipotoxicity. From these data we can speculate that the beneficial effects of TMZ on HF treatment could be related to changes in mitochondrial function and the cellular handling of lipid overload. However, the precise mechanism of such protection requires future studies / CONICYT, FONDECYT, FONDAP, MECESUP

A saúde mental dos adultos mais velhos é uma prioridade para a saúde pública devido a sua vulnerabilidade aos transtornos mentais. Pelo menos em parte, essa vulnerabilidade tem sido atribuída às diversas mudanças que ocorrem no cérebro durante o envelhecimento. Sabe-se também que algumas destas mudanças podem aumentar a vulnerabilidade do cérebro ao estresse oxidativo, um importante fator fisiopatológico em diversos transtornos mentais. Por sua vez, sabe-se que inúmeros fatores podem induzir estresse oxidativo no cérebro, incluindo o consumo de micronutrientes em quantidades inadequadas. Embora a vitamina A seja um micronutriente essencial para a manutenção da homeostase no cérebro, nesta tese demonstramos que a suplementação crônica com palmitato de retinol para ratos durante a meia-idade induz um estado emocional alterado e estresse oxidativo no encéfalo. Além disso, demonstramos que a suplementação com B-caroteno pode ser uma alternativa mais segura ao palmitato de retinol, induzindo modulações antioxidantes no plasma sem exercer efeitos pró-oxidantes no encéfalo de ratos. / The mental health of older adults is a priority for public health because of their vulnerability to mental disorders. At least in part, this vulnerability has been attributed to the various changes that occur in the brain during aging. It is also known that some of these changes may increase the vulnerability of the brain to oxidative stress, an important pathophysiological factor in many mental disorders. In turn, it is known that many factors can induce oxidative stress in the brain, including the intake of micronutrients in inadequate quantities. Although Vitamin A is an essential micronutrient for the maintenance of homeostasis in the brain, this thesis demonstrated that the chronic supplementation with retinyl palmitate to rats during middle age induces an altered emotional state and oxidative stress in the brain. Furthermore, we have demonstrated that suplementation with B-carotene may be a safer alternative to retinol palmitate, inducing antioxidant modulations in plasma without exerting prooxidant effects in the brain of rats.

A saúde mental dos adultos mais velhos é uma prioridade para a saúde pública devido a sua vulnerabilidade aos transtornos mentais. Pelo menos em parte, essa vulnerabilidade tem sido atribuída às diversas mudanças que ocorrem no cérebro durante o envelhecimento. Sabe-se também que algumas destas mudanças podem aumentar a vulnerabilidade do cérebro ao estresse oxidativo, um importante fator fisiopatológico em diversos transtornos mentais. Por sua vez, sabe-se que inúmeros fatores podem induzir estresse oxidativo no cérebro, incluindo o consumo de micronutrientes em quantidades inadequadas. Embora a vitamina A seja um micronutriente essencial para a manutenção da homeostase no cérebro, nesta tese demonstramos que a suplementação crônica com palmitato de retinol para ratos durante a meia-idade induz um estado emocional alterado e estresse oxidativo no encéfalo. Além disso, demonstramos que a suplementação com B-caroteno pode ser uma alternativa mais segura ao palmitato de retinol, induzindo modulações antioxidantes no plasma sem exercer efeitos pró-oxidantes no encéfalo de ratos. / The mental health of older adults is a priority for public health because of their vulnerability to mental disorders. At least in part, this vulnerability has been attributed to the various changes that occur in the brain during aging. It is also known that some of these changes may increase the vulnerability of the brain to oxidative stress, an important pathophysiological factor in many mental disorders. In turn, it is known that many factors can induce oxidative stress in the brain, including the intake of micronutrients in inadequate quantities. Although Vitamin A is an essential micronutrient for the maintenance of homeostasis in the brain, this thesis demonstrated that the chronic supplementation with retinyl palmitate to rats during middle age induces an altered emotional state and oxidative stress in the brain. Furthermore, we have demonstrated that suplementation with B-carotene may be a safer alternative to retinol palmitate, inducing antioxidant modulations in plasma without exerting prooxidant effects in the brain of rats.

A saúde mental dos adultos mais velhos é uma prioridade para a saúde pública devido a sua vulnerabilidade aos transtornos mentais. Pelo menos em parte, essa vulnerabilidade tem sido atribuída às diversas mudanças que ocorrem no cérebro durante o envelhecimento. Sabe-se também que algumas destas mudanças podem aumentar a vulnerabilidade do cérebro ao estresse oxidativo, um importante fator fisiopatológico em diversos transtornos mentais. Por sua vez, sabe-se que inúmeros fatores podem induzir estresse oxidativo no cérebro, incluindo o consumo de micronutrientes em quantidades inadequadas. Embora a vitamina A seja um micronutriente essencial para a manutenção da homeostase no cérebro, nesta tese demonstramos que a suplementação crônica com palmitato de retinol para ratos durante a meia-idade induz um estado emocional alterado e estresse oxidativo no encéfalo. Além disso, demonstramos que a suplementação com B-caroteno pode ser uma alternativa mais segura ao palmitato de retinol, induzindo modulações antioxidantes no plasma sem exercer efeitos pró-oxidantes no encéfalo de ratos. / The mental health of older adults is a priority for public health because of their vulnerability to mental disorders. At least in part, this vulnerability has been attributed to the various changes that occur in the brain during aging. It is also known that some of these changes may increase the vulnerability of the brain to oxidative stress, an important pathophysiological factor in many mental disorders. In turn, it is known that many factors can induce oxidative stress in the brain, including the intake of micronutrients in inadequate quantities. Although Vitamin A is an essential micronutrient for the maintenance of homeostasis in the brain, this thesis demonstrated that the chronic supplementation with retinyl palmitate to rats during middle age induces an altered emotional state and oxidative stress in the brain. Furthermore, we have demonstrated that suplementation with B-carotene may be a safer alternative to retinol palmitate, inducing antioxidant modulations in plasma without exerting prooxidant effects in the brain of rats.