Flatworms of the genus Schistosoma are wide-spread and clinically significant parasites of humans in the tropics and sub-tropics. In evolutionary terms, they are representatives of the earliest metazoans to have evolved separate sexes, and to possess anatomically distinct central and peripheral nervous systems. Schistosome infections are currently controlled by a single drug, praziquantel (PZQ), but the emergence of schistosome strains resistant to PZQ is a growing concern.A deeper understanding of the basic biology of schistosomes is the first step towards target-based drug discovery. Neuronal receptors of schistosomes are attractive targets for drug development because all major physiological activities and behaviors in these parasites are coordinated by their nervous system. Neuronal signaling in schistosomes is mediated by a variety of neurotransmitters and associated receptors, including members of the pentameric ligand-gated ion channel (pLGIC) superfamily. The S. mansoni genome encodes 4 putative non-AChR-like inhibitory pLGIC subunits and 13 putative nAChR-like pLGIC subunits.The work presented in this thesis focuses on L-glutamate (L-glu) neuronal signaling in S. mansoni. L-glu is an important neurotransmitter in essentially all vertebrate and invertebrate phyla, but its functional roles in S. mansoni are poorly understood. Here, we further contribute to knowledge in this field by providing the first molecular evidence for the contribution of an inhibitory, glutamate-gated Cl channel (GluCl)-mediated component to glutamatergic neurotransmission in S. mansoni.First, we show that the 4 non-AChR-like inhibitory pLGIC subunit candidates encode GluCl subunits (SmGluCl-1-4) that are pharmacologically and evolutionarily distinct from insect, nematode and snail GluCls. Using an electrophysiology approach in Xenopus oocytes, we demonstrate that SmGluCl-1, -2 and -3 subunits exhibited low micromolar affinity for L-glu, are permeable to Cl , but are insensitive to ivermectin and meclonazepam. Phylogenetic analyses suggest that the SmGluCl subunits belong to a previously uncharacterized clade of flatworm GluCls that includes several GluCl candidates from related trematode and cestode species.Then, we provide evidence that the SmGluCl subunits are expressed in all human stages of the parasite. An analysis of SmGluCl stage-specific expression by RT-PCR amplification reveals that transcripts from all 4 SmGluCl subunits are expressed in S. mansoni cercaria, schistosomules, adults and eggs. Confocal immunolocalization reveals that all the SmGluCl subunits are widely expressed in the nervous system of male and female worms, and exhibit partially overlapping expression patterns in the central nervous system and in the peripheral nerve cords and plexuses supplying the body, attachment organs, reproductive tract and tubercles. The lack of apparent co-localization between SmGluCl subunits and phalloidin suggests that they are not expressed in the musculature. Together, these findings offer possible clues regarding the physiological functions they mediate, including interneuronal signaling, indirect regulation of motility, attachment and feeding, oogenesis and sensory signaling.Finally, we present initial data from prospective work aimed at developing a YFP assay for HTS of compound libraries against S. mansoni GluCls heterologously expressed in mammalian cells. We confirm by confocal immunofluorescence that heterologously expressed FLAG-tagged SmGluCl-2 is localized at the membrane surface of HEK-293. Further work is underway to demonstrate the feasibility of this assay for HTS against S. mansoni GluCls as a means of exploring the potential of new compounds as either therapeutic leads or pharmacological probes targeting S. mansoni GluCls to explore their physiological functions. / Les vers plats (platyhelminthes) du genre Schistosoma sont des parasites de l'homme répandus dans plusieurs régions tropicales et sous-tropicales. Le seul médicament disponible pour traiter la schistosomiase est le praziquantel (PZQ). L'émergence de souches de schistosomes résistantes au PZQ est une préoccupation croissante. Le système nerveux des schistosome exerce un contrôle exclusif sur toutes les activités physiologiques de ces parasites, déterminant leurs particularités comportementales au sein de leur hôte. La signalisation neuronale chez les schistosomes est modulée par une variété de neurotransmetteurs et des récepteurs qui leur sont associés, incluant les membres de la superfamille des récepteurs ionotropes sensible à un ligand de type pentamérique (pLGIC). Le génome de S. mansoni encode 4 sous-unités putatives de pLGIC insensibles à l'acétylcholine (non-AChR) et 13 sous-unités putatives de pLGIC de type nAChR.Le L-glu est un neurotransmetteur important, retrouvé chez presque tous les vertébrés et les invertébrés, mais les fonctions neurologiques qu'il module chez S. mansoni sont mal comprises. Cette thèse fournit la toute première preuve que le L-glu peut générer des potentiels postsynaptiques inhibiteurs médiés par l'activation de pLGICs sensibles au L-glu (GluCl). Les 4 gènes candidats encodant des sous-unités pLGIC de type non-AChR sont des sous-unités GluCl (SmGluCl-1-4). Ces récepteurs SmGluCl diffèrent des récepteurs GluCl retrouvés chez les insectes, les nématodes et les gastropodes. Des expériences d'électrophysiologie montrent que les sous-unités SmGluCl-1, -2 et -3 forment des récepteurs perméables aux ions Cl et sensibles à des concentrations de L-glu de l'ordre du micromolaire (7-27 µM), mais sont insensibles à l'ivermectine et au meclonazepam. Les analyses phylogénétiques suggèrent que les sous-unités SmGluCl appartiennent à un nouveau groupe de sous-unités GluCl retrouvées exclusivement chez les vers plats parasitaires.Ensuite, nous démontrons par RT-PCR que les ARN messagers encodantque les sous-unités SmGluCl sont produites par tous les stades de développement du parasite interagissant avec l'humain. Des expériences d'immunolocalisation révèlent que ces sous-unités SmGluCl sont abondamment exprimées dans les vers mâles et femelles, au niveau du système nerveux central, ainsi que dans certains des cordons et plexus nerveux du système nerveux périphérique innervant l'enveloppe corporelle, les organes d'attachement, l'appareil reproducteur et les tubercules. Les récepteurs SmGluCl ne sont pas exprimés dans la musculature des schistosomes. En somme, la distribution des sous-unités SmGluCl dans le système nerveux suggère que ces récepteurs pourraient être impliqués dans la signalisation interneuronale et sensorielle et pourrait réguler de manière indirecte la mobilité, l'attachement et l'alimentation et l'ovogenèse.Enfin, nous présentons des données préliminaires obtenues dans le cadre d'un projet visant à développer une méthode analytique permettant le criblage à haut débit (high-throughput screening, HTS) de banques de composés d'intérêt pharmaceutique, afin de tester leur effet sur l'activité des récepteurs GluCl des schistosomes. Cette méthode analytique sera effectuée dans des cellules de mammifères exprimant les récepteurs SmGluCl de manière hétérologue et permettra de mesurer l'activité de ces récepteurs en fonction de la fluorescence émise par la protéine YFP. Nous avons confirmé par immunolocalisation que SmGluCl-2 exprimée de manière hétérologue dans des cellules HEK-293 est localisée au niveau de la surface membranaire. D'autres travaux sont en cours pour démontrer la faisabilité de ce test pour l'identification par HTS de molécules modulant l'activité des récepteurs GluCl de S. mansoni. Les composés identifié pourront être utilisés comme sondes pharmacologiques afin d'approfondir l'étude des fonctions physiologiques modulées par les récepteurs GluCl de S. mansoni.

A unique subcellular structure found in Leishmania donovani is the glycosome. This organelle compartmentalizes the enzymatic machinery required for multiple metabolic pathways, including glycolysis. Correct targeting of glycosomal enzymes is essential for parasite viability. Proteins targeted to the glycosome have either a C-terminal PTS1 or N-terminal PTS2 topogenic signal sequence, which is recognized by cytosolic receptors LdPEX5 or LPEX7, respectively. These cargo-loaded receptors interact with the peroxin protein LdPEX14, located on the cytosolic face of the glycosomal membrane, an event required for import of the cargo proteins into the glycosomal lumen. However, the complete glycosomal protein import pathway has not been fully elucidated. This work has been undertaken to better understand the protein-protein interactions involved in the trafficking of cargo proteins across the glycosomal membrane.The cytosolic fraction from L. donovani parasites was used to determine protein-protein interactions of receptors LdPEX5 and LPEX7. Size exclusion chromatography, isoelectric focusing, and affinity pull-downs showed that in the cytosol these receptors form large heterologous PTS1-LdPEX5-LPEX7-PTS2 complexes. Purified glycosomes were used to evaluate the effects of receptor-cargo complexes on glycosomal LdPEX14 conformation. Limited trypsin proteolysis showed that interaction of receptor-cargo complexes with native LdPEX14 protected this protein from digestion, whereas native LdPEX14 alone was highly sensitive to proteolysis. Protection was not dependent on membrane integrity as disruption of the lipid bilayer did not alter the effect of trypsin on these proteins. Native gel electrophoresis showed that native LdPEX14 forms large ~800 kDa complexes; however, when associated with receptor-cargo complexes the molecular weight of LdPEX14 complexes increased to ~1200 kDa. Alkaline carbonate extractions showed that native LdPEX14 acts like a peripheral glycosomal membrane protein; however loading with receptor-cargo complexes caused LdPEX14 to behave like an integral membrane protein. Furthermore, membrane insertion of LdPEX14 drove insertion of LdPEX5 and LPEX7 into the glycosomal membrane. Receptor-cargo complex association causes LdPEX14 to undergo a conformational change resulting in deeper membrane insertion and increase in complex size.Purification of recombinant LPEX7 was hampered by its association with bacterial chaperone protein GroEL. A refolding technique was developed to purify LPEX7 from inclusion bodies free of bacterial proteins. Far Western and protein-protein affinity assays showed that refolded LPEX7 specifically bound PTS2 proteins as both a monomer and a dimer, the co-receptor LdPEX5, and LdPEX14. Mapping of the interaction domains on LPEX7 showed that LPEX7-PTS2 interaction required the entire receptor protein, while LdPEX5 and LdPEX14 interaction motifs were situated in the N-terminal region of LPEX7.There are metabolites in glycosomes that are not imported via the peroxin based glycosomal import pathway but by glycosomal membrane transporters. L-arginine is one such metabolite; it is the substrate for the PTS1 glycosomal enzyme arginase, which catalyses the first step in the polyamine biosynthetic pathway. L-arginine is scavenged from the extracellular milieu and by the L-arginine transporter, amino acid permease 3 (LdAAP3). Subcellular fractionation showed that LdAAP3 localized to both the plasma and glycosomal membranes. Furthermore, L. donovani promastigotes were capable of sensing the L-arginine levels in the media and upregulated LdAAP3 expression on the plasma and glycosome membrane in the absence of L-arginine. These studies provide evidence that metabolite specific transporters are present on the glycosomal membrane.Together these studies contribute to the elucidation of glycosomal function in Leishmania donovani, and a better understanding of some of the mechanisms required for glycosomal import. / Le glycosome est une structure subcellulaire unique qui se trouve dans le parasite Leishmania donovani. Cette organelle compartimente la machinerie enzymatique requise pour de multiples voies métaboliques, y compris la glycolyse. Le bon ciblage des enzymes du glycosome est essentiel pour la viabilité du parasite. Les protéines ciblées pour le glycosome ont une séquence signal topogénique, un PTS1 C-terminale ou un PTS2 N-terminale, qui est reconnue par les récepteurs cytosoliques, le LdPEX5 ou le LPEX7, respectivement. Ces complexes de récepteurs chargés s'interagissent avec la protéine LdPEX14, située du côté cytosolique de la membrane glycosomale, un événement requis pour le transport des protéines à travers la membrane du glycosome. Cependant, la voie complète d'importation de protéines glycosomales n'a pas été totalement élucidée. Ce travail a été entrepris pour mieux comprendre ces interactions protéine-protéine.La fraction cytosolique des parasites L.donovani a été utilisée pour déterminer les interactions protéine-protéine des récepteurs LdPEX5 et LPEX7. La chromatographie d'exclusion de taille, la focalisation isoélectrique, et les interactions d'affinité proteine-proteine ont montré que, dans les cytosols, ces récepteurs forment des grands complexes hétérologues. Les glycosomes purifiés ont été utilisés pour évaluer l'effet des complexes récepteur sur la conformation du LdPEX14. Une protéolyse limitée a montré que l'interaction du LdPEX14 chargé avec les complexes récepteur l'à protèger de la digestion à la surface de la membrane. L'électrophorèse sur gel natif a montré que le LdPEX14 forme des grands complexes de ~ 800 kDa et que lorsqu'il est associé à des complexes récepteur, le poids moléculaire des complexes LdPEX14 passe à ~ 1200 kDa. Les extractions avec le carbonate alcalin a déterminé que le LdPEX14 seul s'agit comme une protéine périphérique; mais son chargement avec des complexes récepteur l'entrainer à s'agir comme une protéine membranaire intégrale. L'insertion de LdPEX14 dans la membrane du glycosome conduit à l'insertion du LdPEX5 et LPEX7 dans la membrane aussi. L'association des complexes récepteur à causer LdPEX14 à subir un changement de conformation causant l'insertion profonde dans la membrane et l'augmentation de la taille des complexes.La purification du récepteur LPEX7 recombinante été entravée par son association avec la protéine chaperonne bactérienne GroEL. Une technique de repliement a été développé pour purifier LPEX7 en évitant l'association de protéines bactériennes. Les techniques de Far Western et d'affinité protéine-protéine ont montré que ce LPEX7 replier est spécifiquement associé à des protéines PTS2, le co-récepteur LdPEX5, et le LdPEX14. La cartographie des domaines d'interaction de LPEX7 a montré que l'interaction LPEX7-PTS2 nécessit le LPEX7 entière, alors que les motifs d'interaction avec LdPEX5 et LdPEX14 étaient situés dans sa région N-terminale.Il y a des métabolites glycosomal qui ne sont pas importés par la voie de l'importation glycosomale, mais par des transporteurs membranaires du glycosome. L-arginine est un de ces métabolites, substrat de l'enzyme glycosomale PTS1 arginase. L-arginine est récupéré dans le milieu extracellulaire par son transporteur, LdAAP3. Un fractionnement subcellulaire a été utilisés pour séparer les membranes plasmiques des glycosomes, et LdAAP3 a été localisé sur les deux membranes. De plus, des promastigotes de L. donovani sont capable de detecter le niveau de L-arginine dans le millieu, ce qui provoque une régulation positive de l'expression de LdAAP3 à la fois dans la membrane plasmique et dans la membrane du glycosome. Ces études fournissent des preuves que des transporteurs de métabolites spécifique sont présent dans la membrane du glycosome.Ensemble, ces études contribuent à l'élucidation de la fonction glycosomale de Leishmania donovani, et une meilleure compréhension de certains mécanismes nécessaires pour l'importation glycosomale.

Ascaris lumbricoides infects at least 10% of the world's population and is a public health issue in most low-to-middle income countries. Survival of this parasite in its host is mediated at least in part by materials exported to the host in secretions. Although very little is known about the composition of these secretions, defining their contents and functions could shed light on the host-parasite interactions that lead to parasite establishment and persistence in the host. Ascaris suum, a parasite of pigs, was used as a model organism because its genome has been sequenced and it is closely related to the human parasite, A. lumbricoides. Excretory/secretory products (ESP), uterine fluid (UF) and perienteric fluid (PE) were collected from adult A. suum. Proteins isolated from these compartments were subjected to LC-MS/MS and analyzed using bioinformatic tools. The ESP fraction included many proteins also present in UF. Proteins found in ESP but not in UF had a considerably different categorical composition than PE or UF, which are similar to each other. We conclude from these data that proteins exported through the secretory apparatus have distinct patterns of biological function and that UF proteins are likely derived from PE. In addition, ESP from A. suum was compared to ESP from Brugia malayi and ESP from Heligmosomoides polygyrus in terms of protein composition. We concluded that A. suum secretome is conserved through both phylogeny and predilection site. / Ascaris lumbricoides infecte au moins 10% de la population mondiale et est une problématique de santé publique dans les pays en voie de développement. La survie de ce parasite dans son hôte est médiée d'une part par des substances exportées à son hôte par voies de secrétions. Bien que peu d'informations soient connues sur la composition de ces substances, définir leur contenu ainsi que leurs fonctions pourraient aider à clarifier la relation entre le parasite et son hôte. Ascaris suum est un parasite du porc utilisé comme organisme-modèle en raison de son génome séquencé et de sa similarité morphologique avec le parasite de l'homme, A. lumbricoides. Les produits de secrétions/excrétions (PSE), le fluide perientérique (FPE) et le fluide utérin (FU) ont été obtenus des femelles adultes d'A. suum. Les protéines contenues dans ces fluides ont été isolées et soumises à LC-MS/MS et ont ensuite été soumises à des analyses bioinformatiques. Une fraction de PSE inclut plusieurs protéines qui se trouvent aussi dans FU. Les protéines trouvées dans les PSE, mais absentes du FU, avaient une composition catégorique différente comparée aux FPE et au FU, lesquels montraient une composition similaire. Nous concluons par ces résultats que les protéines exportées par l'appareil de sécrétion ont des motifs distincts en termes de fonctions biologiques et que les protéines du FU sont dérivées du FPE. De plus, le PSE d' A. suum a été comparé au PSE de Brugia malayi et au PSE de Heligmosomoides polygyrus. Nous avons conclu que le secretome d' A. suum est conservé à la fois par phylogénie et l'emplacement de l'infection dans l'hôte.

Parasites of the genus Leishmania cause a broad array of diseases, collectively termed leishmaniasis. These diseases range in morbidity; the cutaneous form is typically self healing, while the mucocutaneous and visceral manifestations require chemotherapeutic intervention to avoid lethality. At present there is no vaccine, and current methods of chemotherapeutic intervention have severe drawbacks, together creating a dire need for new options to combat these destructive diseases. An organelle within the parasite, the glycosome, has been identified as an attractive drug target. The glycosome compartmentalizes several enzymes from important biosynthetic and metabolic pathways, which has been shown to be necessary for the viability of the parasite. Although the organelle is structurally and evolutionarily related to peroxisomes of higher eukaryotes, the import machinery of the organelles differs significantly. The majority of proteins entering the glycosome contain a C-terminal PTS1 tri-peptide sequence, which is readily recognized and bound by the soluble cytosolic receptor LPEX5. The receptor binds PTS1 cargo in the cytosol, shuttling it to the glycosomal membrane where the protein interacts with LPEX14, a peripherally membrane bound protein. The interaction with LPEX14 at the glycosomal membrane, facilitated by several other biogenesis proteins, initiates the formation of a transient import pore. In this thesis research project the role of Leishmania donovani PEX5 (LdPEX5) in formation of this crucial import pore was analyzed. Using biophysical techniques, it was found that interaction of the receptor with a PTS1 did not cause major changes in secondary structure, although did provoke a conformational change in the protein, preceding and possibly facilitating its interactions with LdPEX14 at a glycosomal membrane. Using large unilamellar vesicles mimicking the glycosomal lipid composition, the domain of LdPEX5 necessary to interact with LdPEX14 was then narrowed to 268-302. Furthermore, using serial carbonate-urea extractions, the domain identified to be necessary for interaction with LdPEX14 at a glycosomal mimetic was also found to insert into the liposomal membrane, implying that the insertion of LdPEX14 into the glycosomal membrane could be drawing LdPEX5 into the membrane as part of pore formation. In conclusion, this study has implicated LdPEX5 in having a central role in formation of the transient glycosomal import pore. / Les parasites du genre Leishmania provoquent un large éventail de maladies, appelées collectivement leishmanioses. Ces maladies varient en termes de morbidité ; la forme cutanée se conclut généralement par une auto-guérison, alors que les manifestations cutanéo-muqueuses et viscérales nécessitent une intervention chimiothérapeutique pour éviter le décès. À l'heure actuelle, il n'existe aucun vaccin, et les méthodes actuelles d'intervention chimiothérapeutique présentent de graves conséquences. Il existe aujourd'hui un besoin urgent de trouver de nouvelles options pour lutter contre ces maladies destructrices. Un organite dans le parasite, le glycosome, a été identifié comme une cible thérapeutique intéressante. Le glycosome compartimente plusieurs enzymes de biosynthèses et voies métaboliques importantes; il a été prouvé que cet organite est nécessaire pour assurer la viabilité du parasite. Bien que l'organite soit structurellement et évolutivement lié aux peroxysomes des eucaryotes supérieurs, le mécanisme d'importation des organites diffère sensiblement. La majorité des protéines entrant dans le glycosome contient une séquence tri-peptide PTS1 C-terminal, qui est facilement reconnue et liée par le récepteur cytosolique soluble LPEX5. Le récepteur se lie au cargo PTS1 dans le cytosol, le conduisant vers la membrane glycosomale où la protéine interagit avec LPEX14, une protéine liée à la membrane périphérique. L'interaction avec LPEX14 au niveau de la membrane glycosomale, facilitée par plusieurs autres protéines de biogenèse, initie la formation d'un pore d'importation transitoire. Dans ce projet de thèse, le rôle de PEX5 dans la formation de ce pore d'importations essentiel a été analysé chez Leishmania donovani. En utilisant des techniques biophysiques, il a été constaté que l'interaction du récepteur avec un PTS1 n'a pas causé de changements majeurs dans la structure secondaire, bien qu'elle ait provoqué un changement de conformation de la protéine, précédant et éventuellement facilitant ses interactions avec LdPEX14 à une membrane glycosomale. Grâce à l'utilisation de grandes vésicules unilamellaires mimant la composition lipidique glycosomale, le domaine de LdPEX5 nécessaire pour interagir avec LdPEX14 fut ramené à 268-302. En outre, en utilisant des extractions carbonate-urée en série, il a été prouvé que le domaine identifié comme étant nécessaire pour l'interaction avec LdPEX14 au mimétique glycosomal, s'insère dans la membrane liposomale. De ce fait, l'insertion de LdPEX14 dans la membrane glycosomale pourrait tirer LdPEX5 dans la membrane dans le contexte de la formation de pores. En conclusion, cette étude a démontré que LdPEX5 possède un rôle central dans la formation du pore d'importation glycosomale transitoire.

The lethal form of human malaria is caused by the most prominent human protozoan parasite, Plasmodium falciparum, responsible for an estimated ~1 million deaths annually. Malaria treatment and, prevention heavily rely on antimalarial drugs. The synthetic substitute of quinine, chloroquine, was the most effective treatment for this disease. The rise of chloroquine resistant malaria in endemic areas has suppressed control efforts. Chloroquine resistance has been associated with mutations in a transmembrane protein on the digestive vacuole of the parasite, designated PfCRT. Moreover, the normal function(s) and natural substrate(s) of PfCRT remain a matter of speculation as direct evidence for the normal functions or substrates are yet to be determined. The objectives of this thesis are to develop and characterize two antisera to the N- and C termini of PfCRT as tools for the identification of PfCRT interacting proteins in P. falciparum. Although the molecular mass of PfCRT was estimated as 48.67 kDa, immunobiochemical characterizations using different antiserums raised against the N- and C-cytosolic domains of this protein throughout the published literature yielded varying molecular masses of PfCRT on SDS PAGE. In this thesis, we report the generation and biochemical characterization of two antisera raised against the N- and C-cytosolic domains of PfCRT. Our results show PfCRT-C antiserum to detect non-phosphorylated epitopes or sequences in PfCRT. Moreover, our high-resolution epitope mapping results confirm the specificity of PfCRT-C antiserum to a non-phosphorylated form of PfCRT and show that phosphorylation at two sites in PfCRT sequence, Ser411 and Thr416, prevent its binding to the full-length and phosphorylated protein. In addition, we have identified a novel truncated form of PfCRT that is both unphosphorylated, as it is recognized by PfCRT-C antiserum, and likely to represent a differentially spliced product of PfCRT, that is expressed in vivo on the parasite digestive vacuole. Furthermore, our findings confirm the molecular mass of the full-length and phosphorylated PfCRT as a 52 kDa protein band on SDS PAGE. Using PfCRT antisera together with three different methods of protein interactions, we provide the first evidence of proteins interacting with PfCRT. Identification of these proteins which ranges from ~20 kDa to 200 kDa is under active investigation. / La forme létale du paludisme humain est causée par le plus important parasite protozoaire humain, Plasmodium falciparum, responsable d'environ ~1 million de mort annuellement. Le traitement et la prévention du paludisme dépend des médicaments antipaludiques. Le substitut synthétique de la quinine, la chloroquine, était le traitement le plus efficace pour cette maladie. La montée du paludisme résistant à la chloroquine dans les pays endémiques a supprimé les efforts de contrôle. La résistance à la chloroquine a été associée aux mutations dans la protéine transmembranaire présente sur la vacuole digestive du parasite, désigné PfCRT. De plus, la ou les fonctions normales et substrats naturels de la protéine PfCRT restent une affaire de spéculation étant donné qu'une évidence directe des fonctions normales et des substrats de cette protéine sont encore à déterminer. Les objectives de cette thèse sont de développer et de caractériser deux antisérums de l'extrémité N- et C-terminale de PfCRT comme outils d'identification des protéines interagissant avec la protéine PfCRT de P. falciparum. Bien que la masse moléculaire de la protéine PfCRT était estimée à 48.67 kDa, des caractérisations immunobiochimiques utilisant différents antisérums dirigés contre les domaines cytosoliques N- et C-terminal de cette protéine et publiés à travers la littérature ont abouti à des masses moléculaires variable de la protéine PfCRT sur le SDS PAGE. Dans cette thèse, nous reportons la génération et la caractérisation biochimique de deux antisérums dirigés contre les domaines cytosoliques N- et C de PfCRT. Nos résultats montrent que l'antisérum C de PfCRT détecte les épitopes non-phosphorylés ou des séquences dans la protéine PfCRT. En outre, nos résultats de la cartographie à haute résolution de l'épitope confirment la spécificité de l'antisérum C de PfCRT à la forme non-phosphorylé de PfCRT et montrent que la phosphorylation à deux sites au niveau de la séquence de la protéine, Ser411 et Thr416, qui empêche sa fixation à la protéine complète et phosphorylée. De plus, nous avons identifié une nouvelle forme tronquée de PfCRT qui est à la fois phosphorylée puisqu'elle est reconnue par l'antisérum C de PfCRT, et susceptible de représenter un produit différemment épissé de PfCRT, qui est exprimé in vivo sur la vacuole digestive du parasite. En outre, nos résultats confirment la masse moléculaire de la protéine complète et phosphorylée de PfCRT à 52 kDa sur un SDS PAGE. En utilisant les antisérums de PfCRT combiné à trois méthodes différentes d'interactions protéiques, nous fournissons la première preuve de protéines interagissant avec la protéine PfCRT. L'identification de ces protéines dont la masse varie entre ~20 kDa et 200 kDa est sous enquête active.

The outcome of leishmaniasis has been shown to be both host genotype and parasite strain dependent. Understanding the role of host and parasite molecules in disease outcome will provide important information for the development of new drugs, new therapies and new vaccines against this disease. In this study, we investigated the role of a host molecule, Phosphatidylinositol 3-kinases (PI3Ks) and a parasite molecule, phosphoglycans in primary and secondary immune response against Leishmania major. We hypothesized that these host and pathogen factors coordinately influence the quality and magnitude of primary and secondary (memory) immune responses (and immunity) against Leishmania major. In the first part of my study, my results show that in the absence of phosphoglycan, antigen-presenting cells (APCs) are able to present parasite antigens to T cells more efficiently and promote a Th1 type of immune responses. However, as phosphoglycan containing molecules are important for parasite survival and virulence, the initial T cell clonal burst is impaired in lpg2-infected mice. This in turn leads to significantly impaired antigen-specific recall responses (measured by proliferation, IFN-g production and delayed-type hypersensitivity response) both in vitro and in vivo. Interestingly, despite this impairment, lpg2- L. major-infected mice were protected against secondary virulent L. major challenge similar to those that healed from WT L. major infections. In the second part of my study, I demonstrate that PI3K deficient mice are highly resistant to primary L. major infection despite impaired T cells response (proliferation and effector cytokines production). Interestingly, this enhanced resistance was not due to enhanced innate immunity or humoral immunity, but was related to reduced regulatory T cell expansion and differentiation. Surprisingly, results from healed PI3Ks deficient mice suggest that an excellent primary resistance to L. major infection does not automatically translate to secondary protective responses because healed p110 KI mice failed to efficiently control secondary L. major challenge infection. We showed that the impaired memory response was due to defective proliferation of Leishmania-specific memory T cells and the inability of central memory T cells to convert to effector memory T cells, which negatively impact on the ability of memory T cells to exit peripheral lymphoid organs and home to the cutaneous site of infection to mediate effector functions. These findings have significant impacts on our knowledge in understanding of host/pathogen interaction and will shed light on future developments of vaccine, vaccination strategy and new drugs.

The protozoan parasite Entamoeba histolytica is the etiological agent of human amebiasis. Trophozoites colonize the colonic mucus layer and may invade the epithelium subsequent to overcoming the mucus barrier. MUC2 is the major gel-forming mucin secreted by goblet cells in the colon and serves to maintain epithelial barrier function as well as acting as a major host defense against invading pathogens. The polymerization of MUC2 monomers via the N- and C- terminal cysteine rich D-domains is essential for mucus gel formation and confers protection to the underlying mucosa. Amoebae secrete cysteine proteinases, glycosidases and an unidentified mucus secretagogue, which may play a role in overcoming the protective mucus barrier. We hypothesize that E. histolytica cysteine proteinases as well as glycosidases are involved in mucus degradation and weakening of the mucus barrier by disrupting mucin polymerization. Amoebae secreted cysteine proteinases were shown to degrade the cysteine rich regions of MUC2 involved in polymerization and abrogate its protective function. More importantly, the major E. histolytica surface proteinase, cysteine proteinase 5 (EhCP5) was shown to specifically degrade [35S]cysteine labeled colonic mucin as effectively as secreted components. Moreover, trophozoites genetically engineered to express low levels of CP activity were incapable of traversing a mucus barrier and destroying the underlying epithelium, indicating a strong dependence between amebic invasiveness and cysteine protease activity. In addition, we have demonstrated that EhCPs specifically target the MUC2 C-terminus resulting in destabilization of the mucin polymeric network. Parasite glycosidase activity was also shown to contribute to mucin oligosaccharide degradation. Taken together, these results indicate that E. histolytica can substantially weaken the colonic mucus barrier via proteolytic degradation and glycosidase activity to compromise the gel and

Schistosomes are among the most complex parasites affecting humans. They are dioecious parasites with an indirect life cycle that requires two hosts, a snail intermediate host and a human definitive host. The complexity of the life cycle is made possible, in part by the parasite's nervous system, which coordinates behavior and all major physiological activities of the worm. Neuronal signaling in schistosomes is mediated by a variety of neurotransmitters and associated receptors. Among these transmitters are dopamine and the neuroactive amino acid, glutamate. Both have been implicated in the control of neuromuscular function and movement but their mode of action is largely unknown. Here we provide the first molecular evidence for the existence of dopamine and glutamate receptors in Schistosoma mansoni. Two glutamate receptors were identified: One (SmGluR) is distantly related to heptahelical (metabotropic) glutamate receptors from other species and the other (SmGBP) is an unusual, truncated receptor that resembles the extracellular binding domain of glutamate receptors but lacks the remaining heptahelical transmembrane sequence. When expressed heterologously in vitro, SmGluR and SmGBP were both responsive to glutamate but did not recognize many classical (mammalian) glutamate agonists and antagonists, suggesting these are novel receptors with different pharmacological properties. Immunolocalization studies revealed that the two glutamate receptors have different tissue distributions. SmGluR is strongly expressed in neurons of the central and peripheral nervous system, including the peripheral innervation of the body wall muscles and the acetabulum, and it is also present in the female reproductive tract. In contrast, SmGBP is male-specific and was found only in the tegument, particularly the tubercles. The third receptor described in this thesis, SmD2, is structurally related to dopaminergic type 2 receptors and it is selectively activated by dopamine in vitro. SmD2 is localized entirely in the body wall musculature of both male and female worms and larvae. Together these results suggest that SmD2 and SmGluR could play important roles in the control of schistosome movement, SmD2 by targeting the musculature directly, whereas SmGluR works indirectly via the innervation of the musculature. The results also identify novel functions for glutamate receptors in the control of the acetabulum (SmGluR), egg production in females (SmGluR) and the tubercles of the male tegument (SmGBP). The widespread distribution of these receptors, combined with their unusual structures and pharmacological profiles, make them promising targets for discovery of new anti-schistosomal drugs. / Schistosoma est une des espèces les plus complexes de parasites humains. Il est dioïque et requiert un cycle de vie indirect : un hôte intermédiaire, l'escargot, et un hôte définitif, l'homme. Le système nerveux du parasite contrôle le comportement et toutes les activités physiologiques importantes et est en grande partie responsable de la complexité du cycle de vie du parasite. La signalisation neuronale des schistosomes est médiée par une variété de neurotransmetteurs et récepteurs correspondants, dont la dopamine et le glutamate. Ces transmetteurs régissent en partie les fonctions neuromusculaires et le mouvement, mais leur mode d'action demeure inconnu. Cette étude divulgue l'existence de récepteurs de la dopamine et du glutamate chez Schistosoma mansoni. Deux récepteurs de la dopamine ont été identifiés : SmGluR est indirectement associé au domaine heptahélice (métabotropique) des récepteurs du glutamate chez d'autres espèces, et SmGBP est un récepteur tronqué qui ressemble au domaine de liaison extracellulaire des récepteurs du glutamate dont la séquence transmembranaire heptahélice est absente. SmGluR et SmGBP sont tout deux sensibles au glutamate lorsqu'exprimés in vitro de façon hétérologue, mais ne reconnaissent pas plusieurs agonistes et antagonistes classiques (mammaliens) du glutamate. Cela suggère que ce sont de nouveaux récepteurs ayant des propriétés pharmacologiques différentes. Ces deux récepteurs du glutamate ont une expression tissulaire différente : SmGluR est fortement exprimé dans les neurones du système nerveux central et périphérique, et l'innervation périphérique des muscles de la paroi corporelle et de l'acétabulum, ainsi que dans le système reproductif de la femelle. Par contre, SmGBP est spécifique aux mâles et ne s'exprime que dans le tégument, particulièrement les tubercules. Le troisième récepteur identifié, SmD2, est structurellement lié aux récepteurs dopaminergiques de type 2, et sélectivement activé in vitro par la dopamine. SmD2 est uniquement retrouvé dans la musculature de la paroi corporelle chez les vers adultes et les larves des deux sexes. SmD2 et SmGluR semblerait donc important quant à la mobilité des schistosomes. SmD2 ciblerait la musculature directement, et SmGluR agirait indirectement sur l'innervation musculaire. Ces résultats définissent aussi de nouvelles fonctions des récepteurs du glutamate : le contrôle de l'acétabulum (SmGluR), la production des œufs chez les femelles (SmGluR) et des tubercules du tégument chez les mâles (SmGBP). La grande distribution de ces récepteurs combinée à leurs structures et profils pharmacologiques inhabituels en font des cibles prometteuses quant au développement de nouvelles thérapies contre la bilharziose.

The preparasitic, or free-living phase of the life-cycle ofthe Trichostongoylid nematodes parasitic in the rabbit includes theegg, the first and second stage preinfective larvae, and the ensheathedor infective larvae. The egg stage passes out in the faeces of thehost and is deposited on the grass of the pasture. The first andsecond stage larvae normally remain in the faeces^ and it is notuntil the third or infective stage is reached that migration fromfaeces to the grass blades occurs. Temperature, moisture and sunlightare generally considered to be the most important natural influencesaffecting the survival and development of the nematode eggs andlarvae.

The objective of this study was to further characterize the inhibitory serum protein crisis form factor, or CFF, and identify candidate proteins responsible for CFF activity. Four models for serum CFF induction were tested: C57BL/6 mice infected with P. chabaudi adami AS, C57BL/6 mice inoculated with BCG + LPS, and BALB/c mice infected with P. chabaudi adami DS or DK. C57BL/6 mice infected with P. chabaudi adami AS produced sera with the most pronounced level of inhibitory activity and were used for CFF analysis. Heat inactivation did not affect CFF activity, indicating the observed effect was not due to complement proteins, function was lost after heating serum to 100°C. Gel filtration determined that CFF may be in the range of 20 kDa – 80 kDa. Serum depletion by IgY retained CFF activity in the low abundance protein fraction (LAP), which was analyzed by MALDI and LC-QToF mass spectrometry and compared to the LAP from naïve mice. A total of 68 proteins were identified as either up-regulated or unique to the CFF serum, and qualitative analysis revealed one potential CFF candidate: neutrophil gelatinase-associated lipocalin. In conclusion, we have established a model for inducing serum CFF, characterized some of its physical properties, and through proteomic analysis identified a potential CFF candidate. / L'objectif de cette étude visait d'une part à approfondir la caractérisation du facteur de la forme de crise (CFF; « crisis form factor »), un facteur protéique inhibiteur présent dans le sérum, et d'autre part à identifier des protéines candidates responsable de l'activité de CFF. Quatre modèles murins d'induction sérique du CFF ont été testés: des souris C57BL/6 infectées par la souche de P. chabaudi adami AS, des souris C57BL/6 inoculées avec BCG + LPS, et des souris BALB/c infectées respectivement avec les souches de P. chabaudi adami DS ou DK. L'activité inhibitrice la plus prononcée a été observé à partir du sérum prélevé chez les souris C57BL/6 infectées par la souche de P. chabaudi adami AS. Le sérum issu de ce modèle a donc été utilisé pour la suite des analyses de CFF. Nous avons déterminé que l'activité de CFF ne provient pas des protéines du complément et que CFF est inactivé lorsque le sérum est bouilli à 100oC. Le fractionnement du sérum par chromatographie d'exclusion nous a permis de déterminer que CFF est éluée dans les fractions protéiques allant de 20 kDa à 80 kDa. Le sérum a ensuite été soumis à une colonne d'affinité IgY afin d'y dépléter les protéines majoritaires. Suite à cette déplétion, nous avons déterminé que l'activité de CFF est préservée uniquement dans la fraction contenant les protéines sériques de faible abondance (LAP; « low abundance protein »). Nous avons donc analysé la fraction LAP du sérum induit pour CFF par spectrométrie de masse de type MALDI et LC-QToF, puis comparé son profil protéique à celui de la fraction LAP de sérum issu de souris naïves. Ces profils protéiques révèlent qu'un total de 68 protéines sont soit surexprimées, soit exclusives au sérum démontrant une activité CFF. De plus, l'analyse qualitative nous a permis d'identifier une protéine candidate potentiel pour CFF : la gélatinase de neutrophile associée à la lipocaline (NGLA; « neutrophil gelatinase-associated lipocalin »). En concluant, nous avons établi un modèle d'induction sérique de CFF, avons caractérisé certaines de ses propriétés physiques et avons identifié, par l'entremise de la protéomique, NGLA en tant que candidate potentielle de CFF.