Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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L'émergence de pathogènes multi-résistants ne cesse d'augmenter et présente un problème majeur dans le secteur alimentaire et de santé. La recherche d'une nouvelle classe d'agents antimicrobiens considérée comme solutions de rechange aux antibiotiques conventionnels est rendue quasi-obligatoire et d'une importance cruciale. Une des alternatives prometteuses est l'utilisation des peptides antimicrobiens (PAM). L'utilisation des PAM d'origine bactérienne, appelés bactériocines, comme une option prometteuse dans la lutte contre ce phénomène de résistance est d'un intérêt potentiel à l'heure actuelle. Des études ont mis en évidence la relation structure-fonction de ces molécules anti-pathogènes. Cependant, les modèles utilisés dans les études d'activités antimicrobiennes contre des souches bactériennes à Gram négatif et à Gram positif, s'avèrent insuffisants. La présente étude vise à développer des modèles in silico simulant les caractéristiques physicochimiques et structurales des membranes bactériennes d'Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus et Listeria monocytogenes. Pour ce faire, les données relatives à la composition de la membrane de chaque bactérie ont été rassemblées, ensuite les composantes sélectionnées ont été construites grâce au logiciel «Chemdoodle» et regroupées dans une bibliothèque tridimensionnelle constituée des différentes unités nécessaires au développement des modèles. Une étape d'assemblage a été effectuée à l'aide du logiciel «Molsoft icm-pro». Ces modèles permettront d'étudier les interactions bactériocines-membranes ainsi que de prédire et sélectionner les séquences peptidiques ayant une activité antimicrobienne optimale.

Yarrowia lipolytica a la particularité de pousser sur de nombreux substrats hydrophobes et de les métaboliser via la β-oxydation ou de les stocker dans des corps lipidiques. Le premier contact entre la cellule et les substrats hydrophobes se déroule sur la surface cellulaire. A cette étape, la composition de la paroi cellulaire en protéines, en β-glucane et en chitine pourrait jouer un rôle important sur l'adhésion et la prise en charge des substrats hydrophobes. Dans le cadre de cette thèse, nous avons étudié l'effet d'une source de carbone hydrophobe (par rapport au glucose) et de la composition du milieu de culture sur la structure pariétale et la production de mélanine chez Y. lipolytica. Les résultats de nos analyses biochimiques et moléculaires ont montré que l'oléate de méthyle (un composé utilisé comme modèle de source de carbone hydrophobe) a induit des modifications au niveau de la paroi cellulaire et que ces modifications ont conduit ou non à l'adhésion de gouttelettes lipidiques à la surface cellulaire ; à une modification du contenu des composés pariétaux ; à la résistance des cellules à des composés toxiques ayant pour cible la paroi cellulaire ; et à la modification des profils d'expression de 27 gènes analysés codant des protéines de paroi cellulaire. L'identité des gènes surexprimés suggère la participation de leurs protéines dans l'intégrité de la paroi cellulaire, dans l'adhésion des gouttelettes lipidiques et dans la réponse au stress par l'oléate de méthyle et/ou le manque d'azote. Nos résultats ont aussi montré que la présence d'oléate de méthyle, huile de ricin et ricinoléate de méthyle a induit la production de DHN-mélanine chez une souche génétiquement modifiée de Y. lipolytica (MTLY40-2p) dont la β-oxydation est affectée

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les β-1,2 oligomannosides (β-Mans), dont la présence est relativement rare dans le monde vivant, font partie des facteurs de C. albicans contribuant à sa virulence. Ils sont retrouvés dans la paroi de la levure associés aux N-glycannes d’un haut polymère de mannoses lié à un peptide, le phosphopeptidomannane (PPM) et des mannoprotéines (MPs) ainsi qu’à la copule glycannique d’un glycolipide de la famille des mannose-inositol-phosphocéramides, le phospholipomannane (PLM). Les mécanismes de reconnaissance des β-Mans par l’hôte dépendent du degré de polymérisation des oligomannosides et des molécules qui les portent. Une famille de 9 enzymes, les β-1,2 mannosyltransférases (Bmts), permettent la biosynthèse des β-Mans de C. albicans. Ces enzymes ont des fonctions distinctes car leur activité a une spécificité assez stricte qui dépend du glycoconjugué et de l’étape de β-mannosylation. Le travail présenté dans cette thèse s’est appuyé sur la spécificité des Bmts, principalement celles initiant la biosynthèse des β-Mans (Bmt1: N-mannanes acido stables – Bmt2: N-mannanes acido labiles – Bmt5: PLM) pour définir i) le rôle respectif des β-Mans dans la virulence de C. albicans et ii) la contribution des différents glycoconjugués dans l’expression de surface des β-Mans. Une grande partie de l’étude a reposé sur la génération de doubles mutants (bmt1bmt2δ) et (bmt2bmt5δ) exprimant des β-Mans uniquement sur une fraction ou un type de glycoconjugué et d'un triple mutant (bmt1bmt2bmt5δ) n’exprimant plus de β-Mans. Nous avons tout d’abord réévalué la β-mannosylation des MPs qui était jusqu’à présent déduite de celle du PPM. En analysant les O-mannosides des mutants bmtsδ, nous avons pu mettre en évidence l’implication de Bmt1 et Bmt3, qui ajoutent respectivement le 1er et le 2ème β-mannose, dans la O-mannosylation des MPs. L’analyse de la β-mannosylation des MPs et d’une protéine recombinante chez le mutant bmt1δ a mis en évidence le rôle essentiel de Bmt1 dans ce processus. L’analyse en immunofluorescence des différents mutants a montré que seul le PPM et les MPs sont responsables de l’expression de surface des β-Mans. Cette expression a un impact inattendu sur la virulence dans des modèles murins de candidoses disséminées. Les souches exprimant des β-Mans en surface sont en effet moins virulentes que les mutants présentant des défauts de β-Mannosylation. Les mutants, principalement bmt1bmt2bmt5δ sont néanmoins moins virulents chez des souris n’exprimant plus la galectine 3, lectine reconnaissant les β-Mans. Ces résultats montrent le double rôle des β-Mans selon leur localisation et le conjugué qui les porte: d’une part ils permettent à l’hôte d’éliminer la levure via la galectine 3 et d’autre part ils peuvent contribuer à sa virulence via certainement le PLM. La β-mannosylation du PLM est indispensable pour l’activité inflammatoire du PLM sur les macrophages et sa modulation peut entraîner la résistance de la levure à certains antifongiques. La régulation de la β-mannosylation de ses glycoconjugués est un moyen pour C. albicans de s’adapter à différentes conditions. La β-mannosylation du PPM et des MPs est réduite à 37°C et lorsque le pH diminue, pouvant ainsi permettre à la levure d’être moins reconnue in vivo et d’échapper aux mécanismes de défense de l’hôte. Nous avons pu également mettre en évidence un mécanisme permettant à C. albicans de changer de sérotype en inactivant Bmt1. Ce mécanisme qui n’est pas encore parfaitement décrit, permet à la levure de mieux coloniser le tube digestif de souris. Nos résultats mettent ainsi en évidence d’une part l’expression complexe des β-Mans dans la paroi de C. albicans et leur rôle dans la virulence en fonction de leur localisation et d’autre part l’adaptation de la levure à différents environnements. / Β-1,2 oligomannosides (β-Mans) are rare in the living world and are considered as factors contributing to C. albicans virulence. They are present in the cell wall associated to N-glycans of a high mannose polymer linked to a peptide, the phosphopeptidomannan (PPM) and to mannoproteins (MPs) and they are part of the glycan moiety of a glycolipid from the mannose-inositol-phosphoceramid family, the phospholipomannan (PLM). Recognition of β-Mans by the host depends on their polymerization degree and molecules they are associated to. A family of nine enzymes, β-1,2 mannosyltransferases (Bmts), is involved in β-Mans biosynthesis of C. albicans. These enzymes have distinct functions with specificities of substrate and step of β-mannosylation. According to these specificities, especially for initiation of β-Mans biosynthesis (Bmt1: acid stable N-mannan- Bmt2: acid labile N-mannan- Bmt5: PLM), the thesis project was designed to define i) the respective role of β-Mans in C. albicans virulence and ii) the contribution of the different cell wall glycoconjugates in β-Mans surface expression. Double mutants (bmt1bmt2δ and bmt2bmt5δ) expressing β-Mans only on a fraction or a type of glycoconjugate and a triple mutant (bmt1bmt2bmt5δ) expressing no more β-Mans have been generated. We have first reassessed MPs β-mannosylation which was originally deduced from the PPM one. After analysis of O-mannosides from bmtsδ mutants, we have evidenced that Bmt1 and Bmt3 are involved in MPs O-mannosylation by adding the first and the second β-mannose, respectively. β-mannosylation of both MPs and a recombinant protein in bmt1δ mutant was checked and we evidenced an essential role of Bmt1 in this process. Immunofluorescence assays using the different mutants revealed that PPM and MPs are responsible for β-Mans surface expression. Expression of β-Mans at the cell surface had an unexpected impact on virulence in two murine models of disseminated candidiasis. Strains expressing superficial β-Mans were less virulent than mutants with β-mannosylation defects. These mutants, mainly bmt1bmt2bmt5δ, were nevertheless less virulent in mice which do not express galectin-3, lectin that binds β-Mans. These results show different biologic properties of β-Mans depending on their localization and the conjugate they are associated to: they can enable yeast clearance via galectin 3 but they can also contribute to virulence certainly via PLM. PLM β-mannosylation is essential for the glycolipid inflammatory activities in macrophages and its modulation can lead to yeast resistance to some antifungals. Regulation of glycoconjugates β-mannosylation enables C. albicans to adapt to different conditions. PPM and MPs β-mannosylation is reduced at 37°C and at lower pH, which can help C. albicans to counteract host defense in vivo as it is then less recognized by galectin 3. We have also evidenced a mechanism by which C. albicans can switch serotype after Bmt1 inactivation. This mechanism, not completely described, allows the yeast to better colonize the murine digestive tract. Our results highlight both the complex expression of β-Mans in C. albicans cell wall and their role in virulence according to their localization and the adaptation of the yeast to different environments.

L'objectif de ma thèse était de réaliser une étude de la synthèse de la paroi de Streptococcus pneumoniae, paroi qui participe à la croissance et la division bactérienne et fait intervenir les « Penicillin-Binding Proteins » (PBPs). J'ai étudié la localisation du répertoire complet des six PBPs au cours du cycle cellulaire de S. pneumoniae, ce qui a révélé des similitudes inattendues entre les mécanismes de division des bactéries de type bacille et coque. J'ai déterminé le rôle spécifique de chaque PBP dans la synthèse de la paroi et mis en valeur la contribution de PBP3, une D,D-carboxypeptidase, dans la régulation de la division bactérienne. J'ai par ailleurs déterminé la structure tridimensionnelle de PBP3 à 2.8 Å de résolution, ce qui m'a permis de contraindre les modèles de synthèse de la paroi chez le pneumocoque.

La paroi cellulaire des végétaux supérieurs est une structure complexe jouant de nombreux rôles au cours du développement ainsi qu'en réponse aux stress. Les protéines pariétales sont notamment importantes au cours de l'élongation cellulaire. Des hypocotyles étiolés d'Arabidopsis thaliana ont été choisi comme modèle d'élongation cellulaire parce qu'ils subissent une élongation polarisée et rapide en l'absence de division cellulaire. Deux stades de développement ont été comparés grâce à des analyses protéomique et transcriptomique : pendant leur élongation vs après la fin de leur croissance. Pour rendre l'analyse protéomique efficace, une nouvelle méthode de purification de parois et une stratégie de séparation des protéines pariétales ont été établies. Les protéines ont été identifiées par cartographie peptidique massique en utilisant la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF. Cette étude a permis d'identifier 137 protéines parmi lesquelles 51 n'avaient pas été identifiées auparavant. Plusieurs familles de protéines connues pour être impliquées dans l'elongation cellulaire ou son arrêt ont été trouvées par l'une ou l'autre approche (XTH, PG, expansines, peroxydases, laccases). De nouvelles protéines candidates pour jouer des rôles dans l'élongation cellulaire ont été identifiées, telles des protéases, des protéines liées au métabolisme des lipides ou des protéines de fonction inconnue. La comparaison des résultats de protéomique et de transcriptomique ne montre pas de cohérence systématique, suggérant l'existence de mécanismes de régulation post-transcriptionnels des gènes codant les protéines pariétales.

L'auxine est une hormone végétale impliquée dans le développement du gynécée. La réponse à l'auxine dépend majoritairement de deux familles protéiques : les ARF (Auxin Response Factors) et les Aux/IAA. Les ARF sont des facteurs de transcription qui régulent la transcription des gènes de réponse à l'auxine, tandis que les Aux/IAA inhibent l'activité transcriptionnelle des ARF par dimérisation. En présence d'auxine, les Aux/IAA sont dégradés et libèrent les ARF. Au cours de ma thèse, je me suis focalisée sur deux proches paralogues ETTIN/ARF3 et ARF4 impliqués dans le développement du gynécée chez Arabidopsis thaliana. Parmi les cibles directes d'ETT identifiées dans l'équipe, 2 catégories ont retenu notre attention : des gènes impliqués dans la voie de signalisation de l'auxine et des gènes codant des enzymes de remodelage de la paroi. Mon projet a consisté à essayer de comprendre l'implication de ces régulations transcriptionnelles dans le développement du gynécée. Dans une première partie, j'ai étudié la signalisation de l'auxine dans le développement du gynécée, puis l'implication d'ETT dans cette signalisation. Dans une deuxième partie, j'ai confirmé la répression par ETT, des cibles identifiées. Nous avons montré qu'ETT induit la déméthylation des pectines en inhibant les inhibiteurs de pectine méthylestérase. De plus, j'ai montré qu'ETT et ARF4 agiraient de façon redondante pour contrôler positivement la croissance du gynécée. Dans une troisième partie, j'ai abordé l'analyse des domaines fonctionnels du facteur de transcription CRABS CLAW, également impliqué dans le développement du gynécée. En conclusion, mes travaux de thèse apportent une nouvelle vision sur le rôle de la signalisation de l'auxine au cours du développement du gynécée et montrent l'importance du remodelage de la paroi dans la morphogénèse des organes.