The objective of this work is to find the determination of achenes wild and cultivated forms of carrot plant (Daucus carota) and cultural forms of wild parsnips (Pastinaca sativa) out. Collection of achenes was performed at the habitat Sedlec near Mikulov, collection of cultivars was carried out on experimental fields in Lednice in the years 2013 and 2015. Analytical germination tests were made in germinating cupboards in the laboratory of a seed company. It has been found that achenes cultural types of carrots and parsnips are due to growing conditions significantly higher germination. Furthermore, the comparing the years 2013 and 2015 revealed a high probability of adaptability landraces parsnips and carrots to abiotic stress (drought and high temperatures).

Les plantes sont soumises durant leur vie à de nombreux stress environnementaux. Face à ces contraintes, les végétaux ont développé au cours de l'évolution différentes stratégies. La plus emblématique est la mise en place du métabolisme spécialisé, représenté par une grande diversité chimique et fonctionnelle. Bien que ce métabolisme soit de plus en plus étudié ces dernières années, de nombreuses lacunes persistes à son propos, liées notamment (i) à la complexité des modifications métabolomiques engendrées par la perception de stress, (ii) aux coûts et avantages que ces métabolites imputent à la plante les accumulant, et (iii) aux voies métaboliques menant à cette diversité de composés. Pour appréhender ces différentes problématiques, nous avons adopté une stratégie combinant des approches de phytochimie, de biologie moléculaire et de génétique. Dans un premier temps, nous avons étudié les changements métaboliques globaux engendrés par l’application de deux stress environnementaux, l’ozone et la blessure mécanique, sur une plante modèle au laboratoire, le panais, en fonction du temps. Les résultats de ces travaux nous ont permis d’identifier 40 métabolites différentiellement accumulés dans ces conditions, dont certaines furocoumarines. Par la suite, nous avons focalisé notre étude sur ces molécules en évaluant leurs profils d’accumulation, en condition de stress par blessures mécaniques, par la biais d’analyses différentielles. A partir de ces données, nous avons initié la recherche et l'identification de gènes candidats potentiellement impliqués dans cette voie à partir de plusieurs banques transcriptomiques et génomiques de panais. La fonction des gènes sélectionnés a été évalué par des approches d'expression hétérologue dans la levure. En parallèle de ces travaux, nous avons développé une stratégie destinée à mieux comprendre le coût métabolique de la synthèse de métabolites spécialisés. Pour ce faire, nous avons adapté aux furocoumarines une technique de clonage multigénique permettant de transférer dans une plante, et en une seule opération, plusieurs gènes impliqués dans la même voie de biosynthèse. Cette méthode nous a permis d'initier la génération de lignées stables ayant intégré les deux premiers gènes de la voie. Ces plantes seront comparées à des plantes sauvages et permettront ainsi d’étudier les coûts métaboliques et physiologiques de l’introduction de cette nouvelle voie de biosynthèse ainsi que ses bénéfices en termes de défense de la plante. / Plants are subjected to many environmental stresses during their life. Faced with these constraints, plants have developed different strategies during their evolution. The most emblematic is the establishment of a specialized metabolism, represented by a great chemical and functional diversity. Although this metabolism has been studied more and more in recent years, many gaps remain, related in particular (i) to the complexity of the metabolomic changes generated by the perception of stress, (ii) to the costs and benefits that these metabolites impute to the producing plant, and (iii) to the metabolic pathways leading to the diversity of compounds. To cope with these different issues, we adopted a strategy combining approaches of phytochemistry, molecular biology and genetics. First, we studied global metabolic changes caused by the application of two environmental stresses, ozone and mechanical wounding, on parsnip. The obtained results allowed us to identify 40 metabolites differentially accumulated under these conditions, including some furocoumarins. Subsequently, we focused our study on these molecules by evaluating their accumulation profiles under mechanical wounding stress condition, using differential analyzes. From this data, we initiated the search and identification of candidate genes potentially involved in this pathway based on transcriptomic and genomic parsnip libraries analyses. The function of the selected genes was evaluated by heterologous expression approach in yeast. In parallel to this work, we have developed a strategy to better understand the metabolic cost of specialized metabolites synthesis. To do this, we have adapted a multigene cloning method to furocoumarines, allowing to transfer several genes involved in the same pathway in a plant, in a single operation. This method allowed us to initiate the generation of stable lines having integrated the first two genes of the pathway. These plants will be compared to wild plants and will thus allow to study the metabolic and physiological costs of the introduction of this new biosynthetic pathway and its benefits in terms of plant defense.

Les furanocoumarines (FCs) sont des métabolites secondaires principalement synthétisés chez quatre familles botaniques et dérivent de la voie de biosynthèse des phénylpropanoïdes. Ces phytoalexines interviennent dans les processus de défense de la plante et présentent un fort potentiel thérapeutique. Des travaux réalisés dans les années 1960 sur des cultures cellulaires en parallèle de l’utilisation de précurseurs radiomarqués ont permis de démontrer que de nombreuses enzymes impliquées dans cette voie appartenaient à la famille des cytochromes P450 (P450s). Seules deux d’entre elles avaient pu être identifiées d’un point de vue moléculaire au début de ce travail de thèse. Afin de générer des informations concernant le génome de plantes productrices de FCs, nous avons fait séquencer les ARNm extraits de feuilles de Pastinaca sativa, de Ruta graveolens et de Cullen cinereum. L’analyse in silico de ces trois banques de données a permis d’identifier près de 800 fragments d’ADNc codants pour des P450s. Des travaux antérieurs réalisés au laboratoire et l’analyse comparative des transcriptomes de ces 3 plantes nous ont amenés à nous focaliser sur la sous-famille CYP71AZ au travers d’une étude fine de CYP71AZ3 et CYP71AZ4. La caractérisation fonctionnelle de ces enzymes a été réalisée dans un système d’expression hétérologue eucaryote : Saccharomyces cerevisiae. Les résultats obtenus ont permis de montrer que CYP71AZ4 avait une spécificité de substrat assez large puisqu’elle pouvait métaboliser au moins une FC et 4 coumarines. L’analyse et la comparaison des constantes cinétiques pour chacun de ces substrats indiquent néanmoins que le psoralène est le substrat préférentiel. La caractérisation fonctionnelle de CYP71AZ3 a mis en évidence que cette enzyme pouvait hydroxyler l’esculétine, une coumarine, mais ne jouait aucun rôle dans la synthèse de FCs. Ces travaux mettent en évidence la diversité fonctionnelle au sein d’une même sous-famille enzymatique et permettent d’émettre des hypothèses nouvelles quant à l’apparition de cette voie de biosynthèse chez les Apiacées d’une part, et chez les autres familles botaniques d’autre part / Furanocoumarins (FCs) are secondary metabolites mainly synthetized in four botanical families deriving from the phenylpropanoid biosynthetic pathway. These phytoalexins are involved in plant defense mechanisms and present strong therapeutic potential. Early studies in the 1960s based on cell cultures and the use of radiolabeled precursors have shown that many enzymes involved in this pathway belong to the cytochrome P450 family (P450s). Only two of them had been identified from a molecular point of view at the beginning of this thesis. In order to generate information regarding the genome of plants producing FCs, we sequenced the mRNA extracted from leaves of Pastinaca sativa, Ruta graveolens, and Cullen cinereum. In silico analysis of these three libraries identified nearly 800 cDNA fragments encoding for P450s. Previous studies in the laboratory and comparative transcriptome analysis of these three plants have led us to focus on the subfamily CYP71AZ through a detailed study of CYP71AZ3 and CYP71AZ4. Functional characterization of these enzymes was performed in an eukaryote heterologous expression system: Saccharomyces cerevisiae. The results showed that CYP71AZ4 had a broad substrate specificity enough as it could metabolize one FC and 4 coumarins. The analysis and comparison of the kinetic constants for each of these substrates indicate, however, that the preferred substrate is psoralen. The functional characterization of CYP71AZ3 showed that this enzyme could hydroxylate esculetin, a coumarin, but played no role in the synthesis of FCs. This study highlights the functional diversity within a single enzyme subfamily and allows to issue new hypotheses about the emergence of this biosynthetic pathway in Apiaceae on one hand, and among other botanical families on the other hand