L'utilisation des produits phytosanitaires est indispensable pour augmenter la qualité des productions agricoles. Cependant les directives européennes et nationales préconisent une réduction de 50 % de leur utilisation pour préserver l'environnement et limiter les effets secondaires sur les organismes non-cibles. Dans cette optique, et pour optimiser l'efficacité de ces produits tout en diminuant leur dose d'utilisation, il est nécessaire de caractériser les facteurs cellulaires et moléculaires impliqués dans la modulation de l'effet insecticide de ces composés sur leurs cibles membranaires. Parmi les insecticides les plus utilisés en agriculture, les néonicotinoïdes occupent une place importante sur le marché. Ils ont pour cible les récepteurs à l'acétylcholine de type nicotinique (nAChRs) du système nerveux central des insectes. Chez la blatte Periplaneta americana, des cellules neurosecrétrices identifiées, les neurones DUM, expriment deux sous-types de nAChRs, (nAChR1 et nAChR2). Alors que nAChR1 est sensible à l'imidaclopride (IMI), néonicotinoïde de première génération, cet insecticide ne présente aucun effet sur nAChR2. Afin d'obtenir une meilleure compréhension du mode d'action de ces insecticides sur des nAChRs insensibles, l'objectif de ce travail de recherche a été de caractériser du point de vue électro-pharmacologique les facteurs cellulaires et moléculaires qui influencent l'efficacité d'un insecticide néonicotinoïde de seconde génération, l'acétamipride (ACT) qui présente des caractéristiques chimiques différentes de l'IMI. Grâce à la technique électrophysiologique du patch-clamp, dans des conditions de potentiel imposé, il a été possible de démontrer que l'effet de l'ACT sur nAChR2 dépend du potentiel de membrane. Une dépolarisation de la membrane augmente légèrement la sensibilité de nAChR2 pour l'ACT alors qu'une hyperpolarisation produit un effet inverse significatif. Dans les deux cas, l'implication du calcium intracellulaire a été démontrée. Pour des potentiels plus positifs que le potentiel de membrane (i.e., -50 mV), l'inhibition de l'influx calcique via l'activation des canaux calciques à haut seuil d'activation (High Voltage- Activated) par le chlorure de cadmium et l'ω-conotoxine GVIA augmente la sensibilité de nAChR2 pour l'ACT. Des effets similaires sont obtenus pour des potentiels de membrane plus hyperpolarisés lorsque la perméabilité calcique est inhibée par le LOE 908, un inhibiteur des canaux TRPγ. Dans ce dernier cas, l'utilisation d'outils pharmacologiques spécifiques (e.g., forskoline, W7) a permis de révéler que la voie de signalisation intracellulaire AMPcyclique/adenylate cyclase est impliquée dans la modulation de l'efficacité de l'ACT sur nAChR2. Enfin, des mesures de la résistance membranaire, réalisées en parallèle dans des conditions de courant imposé, indiquent que l'état conformationnel des nAChR2 joue également un rôle important dans la modulation de l'efficacité de l'ACT. L'ensemble de ces résultats qui ont permis d'identifier de nouveaux facteurs cellulaires et moléculaires impliqués dans la modulation de l'efficacité d'un néonicotinoide, l'ACT ouvrent des perspectives très intéressantes pour optimiser l'efficacité d'un traitement insecticide.

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:00:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 parte1.pdf: 1450137 bytes, checksum: 1838bf2efddf0ca147f276df88417bb6 (MD5) Previous issue date: 2009-09-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / It was been demonstrated that curine and reticuline, induced a vasodilator effect in the rat small mesenteric arteries through inhibition of voltage-gated Ca2+ channels (VGCC). These compounds, curine and reticuline were isolated from the root barks of Chondrondendron platyphyllum and Ocotea duckei Vattimo, respectively, therefore the aim of this work was to evaluate the vasodilator mechanism of curine and reticuline, bisbenzylisoquinoline alkaloids (BBA), isolated from the root barks of Chondrondendron platyphyllum and Ocotea duckei Vattimo, respectively, using functional and molecular approaches. Tension measurements in aorta rings, whole-cell patch-clamp and confocal techniques were employed to study the action of these alkaloids. The A7r5 smooth muscle derived cell line was used for Ca2+ currents measuring and the intracellular calcium concentration ([Ca2+]i) were evaluated using confocal microscopy. The main results are as follows: in aortic rings, curine (3 - 300 μM) antagonized KCl (60 mM) and Bay K8644 (3 x 10-7 M) induced contractions. In whole-cell configuration, curine reduced the voltage-activated peak amplitude of ICa,L in a concentration-dependent manner. However, the Ca+2 current density versus voltage relationship and maximal activation voltage of ICa,L were not changed. Moreover curine did not also affect the steady-state activation of ICa,L, but shifted the steady-state inactivation curve of ICa,L for more negative potentials, however this effect was not changed in the presence of IBMX, dbcAMP and 8-brcGMP, suggesting that cyclic mononucleotides, such as cAMP and cGMP, are not involved in curine effect. In confocal experiments, curine inhibited the rise on the [Ca2+]i induced by KCl (60 mM) in dispersed vascular smooth muscle cells. In reference to reticuline (3 300 μM) was verified that alkaloid agonized CaCl2 and KCl-induced contractions and elicited vasorelaxation in aortic rings. In whole-cell configuration, reticuline reduced the voltage-activated peak amplitude of ICa,L in a concentration-dependent manner, but did not change the characteristics of current density versus. voltage relationship. Reticuline shifted leftwards the steady-state inactivation curve of ICa,L, however this effect was not changed after application of dibutyryl cyclic adenosine monophosphate to the cell. In cells pretreated with forskolin, an adenylate cyclase activator, the addition of reticuline caused further inhibition of the Ca2+ currents suggesting an additive effect, indicating that cyclic mononucleotides were not involved. Taken together the results have shown that curine and reticuline elicits vasorelaxation due to the blockade of the L-type voltage-dependent Ca2+ current in rat aorta smooth muscle cells. The reported effect may contribute to the potential cardioprotective efficacy of curine and reticuline. / Curina e reticulina são alcalóides isolados das cascas do caule e raízes de Chondrondendron platyphyllum e de Ocotea duckei Vattimo, respectivamente. Estudos anteriores demonstraram que esses alcalóides são capazes de induzir efeito vasodilatador em artéria mesentérica e aorta de rato, respectivamente, devido possível inibição dos canais para Ca2+ dependentes de voltagem (VGCC). O objetivo deste trabalho foi investigar o mecanismo vasodilatador de curina e reticulina realizando experimentações funcionais e moleculares. Foram utilizadas medidas de tensão em anéis de aorta de rato, e empregadas técnicas de patch-clamp e de microscopia confocal para estudos da ação desses alcalóides. Também foram utilizadas células A7r5, uma linhagem de células musculares lisas embrionária derivada de aorta torácica de rato, que foram usadas para medir as correntes de Ca2+ macroscópicas e a concentração de cálcio intracelular ([Ca2+]i), que foram avaliadas usando a técnicas de patch-clamp e microscopia confocal, respectivamente. Os principais resultados são: em anéis de aorta, curina (3 - 300 μM) antagonizou as contrações induzidas por KCl (60 mM) e Bay K8644 (3 x 10-7 M). Na configuração whole-cell patch clamp , curina reduziu a amplitude da corrente de cálcio do tipo L (ICa,L) de maneira dependente de concentração. Porém, curina não alterou as características das correntes na relação corrente-voltagem. A voltagem de ativação máxima para ICa,L não foi diferente em relação ao controle. Além disso, curina também não afetou a ativação no estado estacionário das ICa,L, mas deslocou a curva da inativação estacionária para potenciais mais negativos. No entanto, esse efeito promovido por curina não foi alterado na presença de IBMX, dbcAMP e 8- brcGMP, sugerindo que os mononucleotídeos cíclicos, como APMc e GMPc, não estão envolvidos no efeito da curina. Em experimentos com microscopia confocal curina inibiu os transientes de cálcio intracelulares, e reduziu o aumento de [Ca2+]i induzidos por KCl (60 mM) em células de músculo liso vascular. Em relação à reticulina (3 300 μM), foi verificado que esse alcalóide antagonizou as contrações induzidas por CaCl2 e KCl, provocando vasorelaxamento em anéis de aorta. Na configuração whole-cell patch clamp , reticulina também reduziu a amplitude das ICa,L de maneira dependente de concentração, mas não mudou as características da corrente na relação corrente-voltagem. A reticulina deslocou para potenciais mais negativos a curva de inativação estacionária para as ICa,L. Porém, esse efeito não foi alterado após a aplicação de dbcAMP e 8-brcGMP. Em células pré-tradadas com forskolina, um ativador da adenilil ciclase, a adição da reticulina causou uma inibição adicional das correntes de Ca2+ que sugere um efeito aditivo da reticulina, indicando que os mononucleotídeos cíclicos não estão envolvidos. Dessa forma, curina e reticulina provocaram vasorelaxamento, devido ao bloqueio das correntes de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo-L em células de músculo liso, em cultura e recémdispersas, de aorta de rato, revelando que esses alcalóides têm um importante potencial como modelo químico para a concepção e posterior desenvolvimento de novos fármacos com propriedade protetora cardiovascular.