Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2018-08-24T19:19:55Z No. of bitstreams: 1 2016 - Marli Sidoni.pdf: 1735106 bytes, checksum: 03907fc3437a44bf96b94d6040184407 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-24T19:19:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016 - Marli Sidoni.pdf: 1735106 bytes, checksum: 03907fc3437a44bf96b94d6040184407 (MD5) Previous issue date: 2016-12-01 / This work focused on deploying IgY technology into developing ELISA immunoenzymatic test to FIV diagnose, contributing to the establishment of a production model for a kit in the field of veterinary medicine. The first stage of this work consisted in analyzing the literature of the veterinary documents aimed to diagnose animal diseases, as stated in our current legislation. The access to both national and international optimized the enlightenment of developing parameters and method validation criteria for the development of this new product, named ELISA r-p24 IgY. The second stage consisted in establishing purification production and physicochemical characterization of the recombinant protein p24 of FIV. The biological activity maintenance was proved by way of Western Blot test with the banda presence of approximately 25 kDa, referring to the p24 protein. The third stage was to obtain IgY cat anti-IgG, derived from hens inoculation. The kinetics were monitored by ELISA and the outcome demonstrated that as of the second week, there was a gradual increase in antibody in the yolk, and remained high throughout the period of five months. Reference to the chicken 1, the average concentration was 40,1 mg/mL e for the chicken 2 was 32,2 mg/mL, throughout the period of 5 months. The fourth stage was the use of IgY technology to develop, standardize e validate the r-p24 IgY ELISA related to its use to diagnose the infection caused by FIV. The results were: 99% accuracy, 97.7% sensitivity, 99.5% specificity and 99.1% kappa index. In the fifth stage was carried out a comparative study between ELISA r-p24 IgY and ELISA r-p24 IgG, and it was demonstrated superior performance of the ELISA r-p24 IgY. The ELISA r-p24 IgY to have favorable characteristics from a commercial perspective, such as high precision and maintenance of reactivity for a minimum period of 12 months. Therefore, the above described procedure was efficient and enabled the development of a FIV test. The predominance of IgY technology may contribute to research and development of new tests, following both international regulation related to animal welfare and validation, thus boosting national development of diagnostic kits, for the benefit of human health or animal. / O objetivo deste trabalho foi aplicar a tecnologia IgY no desenvolvimento de um teste imunoenzim?tico, ELISA, para o diagn?stico do FIV, contribuindo no estabelecimento de um modelo de produ??o para um kit nacional na ?rea de medicina veterin?ria. A primeira etapa do desenvolvimento deste trabalho consistiu na revis?o da literatura dos documentos pr?prios para produtos de uso veterin?rio, destinados a diagnosticar doen?as dos animais, disponibilizados na legisla??o vigente. A consulta aos documentos nacionais e internacionais potencializou o esclarecimento de par?metros de desempenho ou crit?rios de valida??o de m?todos, para o desenvolvimento deste novo produto, denominado ELISA r-p24 IgY. A segunda etapa consistiu no estabelecimento da produ??o, purifica??o e caracteriza??o f?sico-qu?mica da prote?na recombinante p24 do FIV. A preserva??o da atividade biol?gica foi demonstrada por Western Blot com a presen?a de uma banda pept?dica de aproximadamente 25 kDa, referente ? prote?na r-p24. A terceira etapa deste trabalho, consistiu na obten??o de anticorpos IgY anti-IgG de gato, a partir da inocula??o em galinhas poedeiras. A cin?tica foi acompanhada por ELISA demonstrando um aumento gradativo do t?tulo de anticorpos na gema a partir da segunda semana, com um aumento significativo no 2? m?s, e mantendo-se elevado durante todo o per?odo de cinco meses. As concentra??es m?dias de prote?nas na galinha 1 foi de 40,1 mg/mL a partir de uma gema e na galinha 2 foi de 32,2 mg/mL por gema, no per?odo de 5 meses. A quarta etapa deste trabalho consistiu no emprego da tecnologia IgY para o desenvolvimento, padroniza??o e a valida??o do teste de Elisa r-p24 IgY para o diagn?stico da infec??o causada pelo FIV. Os resultados obtidos foram: a acur?cia de 99%, a sensibilidade de 97,7%, a especificidade de 99,5%, e o ?ndice kappa de 99,1%. Na quinta etapa deste trabalho realizou-se o estudo comparativo do ELISA r-p24 IgY frente ao ELISA r-p24 IgG, e foi demonstrado o desempenho superior no ELISA r-p24 IgY. A valida??o do ELISA r-p24 IgY mostrou caracter?sticas desej?veis para o uso comercial, tais como alta precis?o e manuten??o da reatividade por um per?odo m?nimo de 12 meses. Conclui-se que o procedimento elaborado foi eficiente e possibilitou o desenvolvimento de um teste para o diagn?stico do FIV. O dom?nio da Tecnologia IgY poder? contribuir com a pesquisa e o desenvolvimento de novos ensaios atendendo ?s normas e diretrizes nacionais e internacionais, tanto de bem-estar animal como de valida??o, impulsionando o desenvolvimento nacional de kits diagn?sticos de interesse em sa?de humana ou animal.

Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2016-10-11T21:19:41Z No. of bitstreams: 1 2015 - Bruno Oliveira de Carvalho.pdf: 1725115 bytes, checksum: 78e6b6f127705b066a8a0f75bbb08e88 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-11T21:19:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015 - Bruno Oliveira de Carvalho.pdf: 1725115 bytes, checksum: 78e6b6f127705b066a8a0f75bbb08e88 (MD5) Previous issue date: 2015-03-17 / CAPES / The knowledge of bacterial genetic information has enable advances in many areas allowing detecting microorganisms and evaluating the production of virulence factors and resistance in certain populations. This knowledge allows the detection of microorganisms, as well as the evaluation of virulence and resistance factors production in certain populations. More recently, molecular diagnosis based on the detection of specific fragments from these agents has been implemented in no viable bacterial cultivation environments or hampered by biotic or abiotic conditions. Besides specific agent detection, bacterial diversity analysis might be an important criterion, such as assessing soil quality. Cultivation has been the most common way for evaluating bacterial diversity. However, most of soil bacteria are not cultivable; therefore, the employment of molecular tools has been increasingly used on this sort of analysis. This survey aimed standardizing the use of cultivation independent techniques for granting three agriculture sectors demands. The first chapter standardized the employment of DGGE technique for analyzing milk bacterial diversity from mastitis and healthy teats belonging to the same animal. Results pointed to differences on bacterial profile from both groups. The second chapter evaluated the impact of the employment of drill cuttings with castor beans and cramble pies association as agricultural fertilizers by DGGE analysis. The application of this technique was efficient for evaluating treatments, as well as, confirming the treatments contribution for increasing bacterial diversity in soil samples. The third chapter compared the cultivation technique sensitivity for American Foul Brood (AFB) diagnosis, a bee disease caused by Paenibacillus larvae, to cultivation independent technique by PCR. This survey demonstrated that sensitivity of the technique was greater than that one by P. larvae cultivation technique. Thus, the present survey concluded that cultivation independent techniques were useful for granting agriculture sectors demands. / O conhecimento das informa??es gen?ticas bacterianas tem permitido avan?os em diversas ?reas do conhecimento. Esse conhecimento permite detectar microrganismos, bem como avaliar a produ??o de fatores de virul?ncia e resist?ncia em determinadas popula??es. Mais recentemente, o diagn?stico molecular pela detec??o de fragmentos de DNA espec?ficos desses agentes vem sendo implementado em situa??es onde o cultivo bacteriano n?o ? vi?vel ou ? dificultado por condi??es bi?ticas ou abi?ticas. Al?m da detec??o de agentes espec?ficos, o conhecimento da diversidade bacteriana presente em alguns ambientes pode ser um importante crit?rio, como, por exemplo, para avaliar a qualidade do solo. A forma mais comum de avaliar a diversidade bacteriana se d? atrav?s do cultivo. Por?m, a maior parte das popula??es bacterianas presentes no solo n?o s?o cultiv?veis, com isso, a utiliza??o de ferramentas moleculares s?o cada vez mais utilizadas nesse tipo de an?lise. O presente estudo teve como objetivo padronizar a utiliza??o de t?cnicas independentes de cultivo para atender demandas de tr?s setores da agricultura. O primeiro cap?tulo padronizou a utiliza??o da t?cnica de DGGE (Eletroforese em Gel de Gradiente Desnaturante) para an?lise da diversidade bacteriana do leite de tetos mast?ticos e sadios de um mesmo animal. Os resultados apontaram para diferen?as no perfil bacteriano dos dois grupos analisados. O segundo cap?tulo avaliou o impacto sobre a microbiota bacteriana em solos tratados com associa??es de cascalho de perfura??o e tortas de mamona e crambe como adubos agr?colas atrav?s da an?lise de DGGE. A aplica??o da t?cnica de DGGE foi eficiente na avalia??o e confirmou que os tratamentos contribu?ram para o aumento da diversidade bacteriana nas amostras de solos estudadas. O terceiro experimento comparou a sensibilidade da t?cnica de cultivo, oficial para diagn?stico da Cria P?trida Americana (CPA), uma doen?a ap?cola causada por Paenibacillus larvae, com t?cnica de independente de cultivo por PCR do material extra?do direto do mel. Este estudo constatou que a sensibilidade da t?cnica proposta foi superior ? obtida pela t?cnica de cultivo de P. larvae. Com isso, conclui-se que as t?cnicas independentes de cultivo foram ?teis no atendimento das demandas das quest?es dos setores agr?colas contemplados no estudo.