Submitted by BALTAZAR CASAGRANDE (flebalta2012@gmail.com) on 2018-05-15T16:52:24Z No. of bitstreams: 1 Tese_CASAGRANDE.pdf: 22435121 bytes, checksum: 3cd539a9c94901965801f673dffefd8a (MD5) / Approved for entry into archive by ALESSANDRA KUBA OSHIRO ASSUNÇÃO (alessandra@fct.unesp.br) on 2018-05-15T17:43:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 casagrande_b_dr_prud.pdf: 22435121 bytes, checksum: 3cd539a9c94901965801f673dffefd8a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-15T17:43:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 casagrande_b_dr_prud.pdf: 22435121 bytes, checksum: 3cd539a9c94901965801f673dffefd8a (MD5) Previous issue date: 2018-03-29 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introdução: Esta tese apresenta uma contribuição para o entendimento da produção social da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA). Particularmente, a tese aborda questões concernentes à trajetória das doenças vetoriais, como as leishmanioses, que possam estar sendo transformadas com a supressão de áreas florestadas pela expansão da monocultura da cana-de-açúcar, neste caso com destaque para o problema da LTA, que tem como vetor os flebótomos. Objetivo: O objetivo geral foi estabelecer relações entre a diversidade, a distribuição espacial de flebotomíneos, a produção do Espaço Geográfico e a saúde da população, caracterizando o Complexo Patogênico da Leishmaniose Tegumentar Americana. Metodologia: Sendo assim, utilizamos os conhecimentos geográficos de Biogeografia, revisão de literatura, tanto sistemática quanto narrativa, levantamentos de campo e trabalhos laboratoriais e análises estatísticas. Resultados: Foram realizados no total 30 levantamentos de campo e capturados 2171 exemplares de flebotomíneos distribuídos entre os Fragmentos da Estação Ecológica do Mico-Leão-Preto, Água Sumida, 72 exemplares com sete espécies diferentes e Ponte Branca, 52 exemplares com 11 espécies diferentes e no estreito de baixo do Parque Estadual do Morro do Diabo, 2044 exemplares com 13 espécies diferentes. Em todos dos casos apresenta maior diversidade em áreas preservadas e menor diversidade em áreas colonizadas. Foram mapeados diferentes meios geográficos coexistindo a área em questão, sendo eles áreas florestais (meio natural), passando por área rural com assentamentos de reforma agrária e fazendas de pecuária extensiva (meio técnico), além de fazendas de agricultura canavieira (meio técnico científico-informacional). Discussões: É evidente que a atividade do cultivo da lavoura canavieira modificou o perfil epidemiológico da LTA na região do Pontal do Paranapanema entendido a partir de um Complexo Patogênico. Isso porque a implantação da atividade canavieira dá novos rumos ao modelo de cultivo no campo e isso interfere na dinâmica ecológica desta doença afetando a população local. Assim, esse estudo resultou em uma nova caracterização da área de estudo, espacialização dos vetores na região, no estabelecimento do Complexo Patogênico da LTA e na delimitação de um campo de pesquisa denominado de “Biogeografia da Saúde”. Conclusão: Esses resultados contribuem para a evolução dos conhecimentos geográficos, formação dos alunos de geografia e também para o fortalecimento da vigilância em saúde. / Introduction: This thesis presents a contribution to the understanding of the social production of American Cutaneous Leishmaniasis (ACL). Particularly, the thesis deals with questions concerning the trajectory of vector diseases, such as leishmaniasis, that may be being transformed by the suppression of forested areas by the expansion of sugarcane monoculture, in this case highlighting the ACL problem, which has as vector the sandflies. Objective: The general objective was to establish relationships between diversity, spatial distribution of sandflies, production of Geographic Space and population health, characterizing the Pathogenic Complex of American Cutaneous Leishmaniasis. Methodology: Thus, we use the geographical knowledge of Biogeography, literature review, both systematic and narrative, field surveys and laboratory work and statistical analysis. Results: A total of 30 field surveys were carried out and 2171 specimens of sandflies were distributed among the fragments of the Mico-Leão-Preto Ecological Station, Água Sumida, 72 specimens with seven different species and Ponte Branca, 52 specimens with 11 different species and in the lower strait of Morro do Diabo State Park, 2044 specimens with 13 different species. In all cases it presents greater diversity in preserved areas and less diversity in colonized areas. Different geographic environments were coexisting with the area in question, being forest areas (natural environment), passing through rural areas with agrarian reform settlements and extensive cattle ranches (technical environment), as well as sugar cane agriculture farms (scientific-informational). Discussion: It is evident that the sugarcane cultivation activity modified the epidemiological profile of ACL in the region of Pontal do Paranapanema, understood from a Pathogenic Complex. This is because the implantation of the sugar cane activity gives new directions to the model of cultivation in the field and this interferes in the ecological dynamics of this disease affecting the local population. Thus, this study resulted in a new characterization of the study area, spatialization of the vectors in the region, in the establishment of the ACL Pathogenic Complex and in the delimitation of a research field called "Biogeography of Health". Conclusion: These results contribute to the evolution of geographic knowledge, the training of geography students and also to the strengthening of health surveillance. / FAPESP: 2013/25920-5

A diversidade genética de Crinipellis perniciosa foi avaliada quanto à capacidade adaptativa de diferentes genótipos à dispersão geográfica e à associação preferencial ou diferencial com hospedeiros. Isolados polispóricos de C. perniciosa provenientes de diferentes Estados brasileiros (AM, RO, MG, BA, SP, MT e PA) e diferentes hospedeiros (Theobroma cacao L., Solanum cernuum, Solanum paniculatum, Solanum grandiflorum L., Solanum e lianas), foram analisados pelas técnicas de compatibilidade somática (SCG - Somatic Compatibility Group), através de reações de compatibilidade e/ou incompatibilidade, o uso de gel de eletroforese de proteínas totais, velocidade de crescimento, ELISA e Western Blot. Os diversos isolados foram agrupados com base em conjuntos de dados sobre suas características genéticas, identificando-se agrupamentos de acordo com a dispersão geográfica e hospedeiros de onde foram isolados. Foram construídos dois dendogramas pelo teste de compatibilidade permitindo classificar os isolados em três grupos: i)grupo formado pelos isolados de Rondônia e Pará e ii) grupo formado pelos isolados de Rondônia, Pará e Amazonas e o iii) grupo formado pelo isolado de Mato Grosso; o segundo teste separou os isolados em dois grandes grupos: i) grupo formado pelos isolados da Bahia, Minas Gerais, São Paulo, Mato Grosso e Rondônia e ii) grupo formado pelo isolado do Pará. O dendograma criado pelo perfil protéico permitiu agrupar os isolados em três grupos, de acordo com o hospedeiro e região de origem: (1) grupo formado pelo isolado de Theobroma cacao de Ouro Preto D’Oeste; (2) grupo constituído pelos isolados de Theobroma cacao da Bahia e os diversos isolados de Solanaceae do Estado de Minas Gerais, Bahia e São Paulo e grupo (3) formado pelo isolado de Lianas (cipós). De forma geral, conclui-se que há ampla diversidade genética entre os isolados de C. perniciosa provenientes das diferentes regiões brasileiras e em relação aos hospedeiros, comprovando-se haver elevada capacidade adaptativa caracterizada pela prevalência em ambientes diversos e pela disseminação a longas distâncias geográficas. Há também indicativos de que a velocidade de crescimento do fungo pode ser um dos fatores importantes para assegurar a colonização, já que é correlacionada com a dispersão geográfica, e também, para a seleção de biótipos patogênicos e para a variabilidade genética do fungo. / The genetic diversity of Crinipellis perniciosa was evaluated how much to the capacity of adaptation of different genotypes to the geographic dispersion and the preferential or distinguishing association with hosts. Polisporics isolated of C. perniciosa proceeding from different Brazilian States (AM, RO, MG, BA, SP, MT e PA) and different hosts (Theobroma cacao L., Solanum cernuum, Solanum paniculatum, Solanum grandiflorum L., Solanum and lianas), had been analyzed by the techniques of somatic compatibility (SCG - Somatic Compatibility Group), through reactions of compatibility and/or incompatibility, the gel use of proteins electrophoresis, speed of growth, ELISA and Western Blot. Diverse the isolated ones had been grouped on the basis of different data on its genetic characteristics, identifying to groupings in accordance with the geographic dispersion and hosts of where they had been isolated. Two dendrogramas for the compatibility test had been constructed allowing to classify the isolated ones in three groups: i)group formed by isolated of Rondônia and Pará and ii) group formed for the isolated ones of Rondônia, Pará and Amazonas and iii) group formed for the isolated one of Mato Grosso; as the test separated the isolated ones in two great groups: i) group formed for isolated of the Bahia, the Minas Gerais, São Paulo, Mato Grosso and Rondônia and ii) group formed for the isolated one of Pará. The dendrograma created by the protein profile allowed to group the isolated ones in three groups, in accordance with the host and region of origin: (1) group formed for isolated of Theobroma cacao of Ouro Preto D'Oeste; (2) group consisting of isolated of Theobroma cacao of the Bahia and diverse the isolated ones of Solanaceae of the State of Minas Gerais, Bahia and São Paulo and group (3) formed by the isolated one of Liana. Of general form, it is concluded that it has ample genetic diversity enters the isolated ones of C. perniciosa proceeding from the different Brazilian regions and in relation to the hosts, proving to have high capacity of adaptation characterized by the prevalence in diverse environments and the dissemination the long geographic distances. It has also indicative of that the growth speed can be one of the factors important to assure the correlated settling since with the geographic dispersion, favors new biotypes, important factor for the genetic variability of fungus.

Apesar da espécie Vigna unguiculata (L.) Walp. ser bastante rústica e estar adaptada às condições adversas de clima e solo brasileiros, seu rendimento é muito baixo. Diversas causas têm sido levantadas para explicar esse comportamento; entre elas destacam-se as doenças fúngicas, sobretudo aquelas cujos patógenos são transmitidos por sementes, em especial a podridão cinzenta do caule, causada por Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. A abordagem analítica desse patossistema revelou alguns problemas emergentes. Entre eles, destacam-se: a) desconhecimento da qualidade sanitária das sementes de caupi, utilizadas para semeadura; b) desunifomidade na metodologia usada para detectar os patógenos presentes nas semente; c) dificuldade na esporulação do patógeno, máxime de alguns isolados reticentes em esporular em meios artificiais de cultivo, cujo comportamento dificulta os trabalhos de seleção de genótipos resistentes; d) carência de medidas de controle do patógeno, que empreguem práticas naturais, como uso de sementes sadias, de indutores de resistência e de cultivares resistentes, de fácil uso e passível de adoção por parte dos produtores. Na estruturação da matriz lógica do presente estudo, referidos problemas foram transformados em objetivos. Os trabalhos foram conduzidos no Departamento de Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola da ESALQ/USP, em Piracicaba-SP. Os resultados indicaram o teste de sanidade de sementes de caupi empregando o método do papel de filtro com restrição hídrica utilizando NaCl a –0,8Mpa, como o mais adequado para detecção dos fungos presentes nas sementes de caupi, especialmente M. phaseolina. A análise sanitária das amostras de sementes originadas de vários estados brasileiros revelou que, em 62% das amostras analisadas, o fungo M. phaseolina estava presente, sendo as amostras originadas do estado da Paraíba, Piauí, Pará e Bahia as que apresentaram maiores níveis de incidência do patógeno. Os melhores níveis de esporulação do patógeno foram conseguidos com a combinação de sobreposição de discos de folhas de trigo ao meio BDA, com temperatura de 25oC. Quanto à identificação de indutores de resistência, capazes de controlar M. phaseolina, os resultados revelaram que o acibenzolar-S-metil (ASM) foi o mais eficiente, quando comparado com quitosana e com um produto silicatado derivado de rocha micronizada (PSiM), apresentando um controle residual por mais de 40 dias após a semeadura. A maior eficiência verificada pelo ASM ocorreu devido a sua capacidade de ativar mecanismos bioquímicos de defesa, configurando-se em efetivo ativador da resistência induzida nas plantas de caupi, por atuar na cinética de importantes enzimas relacionadas à defesa, como a fenilalanina amônia-liase, peroxidase e quitinase. Quanto à reação de cultivares de caupi à doença, foi possível verificar razoável nível de resistência de algumas cultivares, tendo sido consideradas resistentes Mulato, Guariba e Maratauã. / Notwithstanding the specie Vigna unguiculata (L.) Walp is sufficiently rustic and adapted to the adverse conditions of the Brazilian soil and climate, its improvement is very low. Many causes have been raised in order to explain such behavior; among them the fungal diseases stand out, over all those whose pathogens are transmitted by the seeds especially the charcoal rot disease caused by Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. The analytical approach of such pathosystem has revealed some emerging problems. Among them, it stands out: a) the ignorance of the sanitary quality of the cowpea seeds used for sowing; b) the non-uniformity in the used methodology in order to detect the pathogens, which are present in the seed; c) the difficult in pathogen sporulation, principally of some isolated reticent in forming spores in cultivation artificial environments whose behavior hampers the selection works of the resistant genotypes; d) lack of pathogen control measures, which utilize natural practices, such as the use of healthy seeds, resistance inducers and resistant cultivars of easy utilization and liable to adoption by the producers. In structuring the logical matrix of this study, such problems were transformed into objectives. The works were conducted at the Entomology, Phytopathology and Agricultural Zoology Departments of ESALQ/USP, in Piracicaba-SP. The results have pointed out the sanity test of the cowpea seeds through the method of filter paper with hydric restriction using NaCI – 0,8Mpa, as the most suitable for detecting the current fungus in cowpea seeds, especially M. phaseolina. The sanitary analysis of the seeds samples originated from several Brazilian states has revealed that in 63% of the analyzed samples, the fungus M. phaseolina was present, and the samples originated from the states of Paraíba, Piauí, Pará and Bahia were those that have presented higher incident levels of pathogen. The best levels of sporulation were obtained with the combination of the superposition of wheat leaves disks in the middle of BDA in 25ºC. As to the identification of the resistance inducers, capable of controlling the M. phaseolina, the results have revealed that the acinbezolar-S-methyl (ASM) was more efficient when compared to chitosan and with a silicate product originated from micronized rock (PsiM), presenting a residual control for more than 40 days after the sowing. The greatest efficiency ascertained by ASM has occurred due to its capacity of activate the defense biochemistries mechanisms, forming itself in an activator effect of the induced resistance in cowpea plants because it acts in the kinetic of important enzymes related to the defense, such as the phenylalanine ammonia-lyase, peroxidase and chitinase. As to the cowpea cultivars reaction to the disease, it was possible to ascertain a reasonable resistance level of some cultivars, and BR 14 Mulato, Guariba e Maratauã were considered as resistant.

A mancha preta dos citros (MPC) é uma doença que limita a exportação de laranja brasileira para o Japão e países da Europa. Exceto para Citrus aurantium e seus híbridos, todas as outras variedades são susceptíveis ao patógeno. O fungo Guignardia citricarpa, descoberto por Kiely em 1948 em New South Wales na Austrália, é o estádio sexual do agente causal da MPC e a sua fase imperfeita é Phyllosticta citricarpa. Uma importante característica da MPC é seu longo período de latência. A infecção pode ser efetuada por ascósporos e picnidiósporos. A lesão nos frutos fica restrita ao flavedo (epicarpo), sendo que o fungo não infecta o albedo (mesocarpo). O albedo é rico em celulose, carboidratos solúveis, pectinas, compostos fenólicos (flavonóides), aminoácidos e vitaminas. Os compostos fenólicos presentes nas plantas são produtos do metabolismo secundário, e podem ser resultantes da interação planta-ambiente e podem sintetizados como resposta ao ataque de fitopatógenos. Os fenólicos presentes nos citros incluem flavonóides, antocianinas, coumarinas e psorolenos entre outros. Estes compostos podem exibir ação antimicrobiana e antiviral e podem contribuir controle da MPC. A aplicação de fungicidas é o método de controle da MPC. Uma outra possibilidade de controle seria a ativação de fatores de resistência através do uso de indutores bióticos (Saccharomyces cerevisiae) e abióticos (Bion e ácido salicílico). Deste modo, este trabalho teve como objetivos estudar os efeitos do uso de extratos aquosos, metanólicos e etanólicos de albedo de laranja na germinação formação de apressório e crescimento micelial de P. citricarpa in vitro, bem como avaliar o uso da indução de resistência para o controle da MPC através dos indutores S. cerevisiae, Bion e ácido salicílico em pós e pré-colheita em frutos de laranja ‘Pêra-Rio’ e folhas de limão ‘Siciliano’. Os resultados experimentais mostraram que os extratos de albedo, nas concentrações de 10 e 100 mg / mL de água, foram capazes de inibir em 100% a germinação, formação de apressório e o crescimento micelial de P. citricarpa. Foi observado que os extratos, dependendo da concentração, podem ter ação fungicida ou fungistática. No tocante a utilização de S. cerevisiae, Bion e ácido salicílico, aplicados em pós-colheita, foi observado que estes agentes não foram capazes de impedir o desenvolvimento de novas lesões em frutos de laranja ‘Pêra-Rio’. Também foi constatado que S. cerevisiae e Bion, aplicados em pré-colheita, não foram capazes de induzir resistência contra P. citricarpa em folhas de limão ‘Siciliano’ inoculadas previamente a campo com G. citricarpa. Nesse sentido, sugere-se que outros estudos sejam conduzidos, principalmente no que se refere ao uso potencial de extratos do albedo de laranja como medida alternativa de controle da MPC. / Black spot of citrus (CBS) has been a limiting factor in the export of brazilian oranges to Japan and European countries and Japan. Except for Citrus aurantium and its hybrids, all commercially growing Citrus spp. are susceptible to the pathogen. The fungus Guignardia citricarpa, discovered by Kiely in 1948 in New South Wales, is the sexual stage of the causal agent of CBS and Phyllosticta citricarpa is the imperfect stage. An important characteristic of CBS is the long latent period after infection. The infection is carried out by ascospores and pycnidiospores. The fungicidal application is the most important method of control of CBS. The CBS lesion in citrus fruits is limited to the flavedo, since P. citricarpa does not infect the albedo. The albedo is rich in cellulose, soluble carbohydrates, pectin, phenolic compounds, amino acids and vitamins. The phenolics present in the plants are secondary metabolic products and are believed to be produced as a result of the plant interaction with the enviromment and synthesized as a response to attempted phytopathogen attacks. The phenolics that occur in Citrus include flavonoids, anthocyanins, coumarins and psorolens. These compounds may exhibit antiviral and antimicrobial activities, and may contribute to the control of CBS disease. An another possibility to the CBS control is the activation of factors resistance by the use of abiotics (Bion and salicylic acid) and biotics (Saccharomyces cerevisiae) “plant defence activator” (inducers). Therefore, the objectives of this paper were to study the in vitro effects of aqueous, ethanolic and methanolic albedo orange extracts on the germination, appressorium formation and mycelial growth of P. citricarpa as well as to evaluate the use of the S. cerevisiae, Bion and salicylic acid as “plant defence activator” at post and preharvest conditions in fruit of “Pêra-Rio” and leaves of ’Siciliano’ lemon. The results showed that the use of albedo extracts, 10 and 100 mg per mL of water, inhibited 100 % the germination, appressorium formation and mycelial growth of P. citricarpa. It was also observed that the extracts of albedo, depending upon the concentration, exhibited fungicidal or fungistatic activity. The use of S. cerevisiae, Bion and salicylic acid at postharvest conditions did not affect the development of new lesions of CBS in ‘Pêra-Rio’ orange fruit. It was also observed that the use of S. cerevisiae and Bion at preharvest conditions, did not induce resistance against P. citricarpa in leaves of ‘Siciliano’ lemon naturally infected with G. citricarpa under field conditions. Thus, it is suggested that other studies be carried out, mainly regarding the potential of orange albedo’s extracts as a alternative method for CBS control.

Dentre as espécies do gênero Yersinia, Yersinia enterocolitica é a espécie mais prevalente como causa de doença em humanos e animais. Y. enterocolitica é dividida em seis biotipos. Os biotipos 1B, 2, 3, 4 e 5 compreendem linhagens associadas à doença em humanos e animais, enquanto o biotipo 1A consiste de linhagens consideradas não patogênicas. Apesar de Y. enterocolitica biotipo 2 ser de importância clínica, há uma escassez de estudos no país, o que dificulta avaliar o envolvimento dessa bactéria como causa de doença em humanos e em animais, bem como, determinar o impacto de sua presença no meio-ambiente. O objetivo deste trabalho foi investigar o potencial patogênico, determinar o perfil de suscetibilidade a antimicrobianos e verificar a diversidade genotípica de linhagens de Y. enterocolitica biotipo 2 isoladas no Brasil. Foram estudadas 40 linhagens de Y. enterocolitica biotipo 2, isoladas de humanos (5), ambiente (34) e animal (1), entre os anos de 1979 e 1998. Ademais, nas análises filogenéticas, foram acrescidas 26 linhagens de Y. enterocolitica pertencentes aos outros biotipos, com o intuito de comparar as linhagens de Y. enterocolitica biotipo 2 aos biotipos 1A, 1B, 3, 4 e 5. As linhagens de humanos e animal foram sensíveis a todos os 14 antimicrobianos testados. Dentre as 34 linhagens de ambiente, sete (20,6%) foram resistentes a um ou dois antimicrobianos, sendo esses, amicacina, cefoxitina, gentamicina, e sulfametoxazol - trimetoprima. Todas as linhagens apresentaram os genes inv, ail, ystA, hreP, tccC e myfA. Os genes fepD e fes foram detectados em 39 (97,5%) linhagens, o gene virF foi encontrado em três (7,5%) linhagens, os genes ystB e fepA não foram detectados em nenhuma linhagem. Todas as linhagens apresentaram comportamento relacionado à virulência frente aos testes fenotípicos de atividade da pirazinamidase, hidrólise da esculina e fermentação da salicina. O dendrograma de similaridade genética de Enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR (ERIC-PCR) agrupou as linhagens de Y. enterocolitica biotipo 2 em cinco grupos denominados A, B, C, D e E. Todas as linhagens, com exceção de duas, apresentaram similaridade genética superior a 88,3%. O dendrograma de similaridade genética de Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) agrupou as linhagens de Y. enterocolitica biotipo 2 em três grupos denominados I, J e K. A maioria das linhagens (72,5%) apresentou similaridade ii genética superior a 78,3%. O dendrograma de similaridade genética de Multilocus variable number tandem repeat analysis (MLVA) agrupou as linhagens de Y. enterocolitica biotipo 2 em dois grupos denominados O e P com similaridade genética superior a 37,7%. Pode-se concluir que o potencial patogênico das linhagens de Y. enterocolitica biotipo 2 foi evidenciado pela prevalência da maioria dos marcadores de virulência, bem como, pelo comportamento relacionado à virulência frente aos testes fenotípicos pesquisados. Algumas linhagens apresentaram-se resistentes a antimicrobianos de primeira escolha no tratamento de yersiniose, o que pode acarretar em falha terapêutica. Os resultados de ERIC-PCR e PFGE mostraram a alta similaridade entre as linhagens de Y. enterocolitica biotipo 2, sugerindo que as mesmas pouco se diferenciaram ao longo dos 19 anos e que possivelmente o meio ambiente tem sido uma fonte de contaminação para humanos e animais no Brasil. A técnica de MLVA agrupou as linhagens de Y. enterocolitica biotipo 2 quanto à sua origem e a técnica de ERIC-PCR agrupou as linhagens de Y. enterocolitica biotipos 1A, 1B, 2, 3, 4, e 5 quanto às diferentes patogenicidades características de cada biotipo. / Among the species of the genus Yersinia, Yersinia enterocolitica is the most prevalent species that cause illness in humans and animals. Y. enterocolitica is divided into six biotypes. Biotypes 1B, 2, 3, 4 e 5 comprise strains associated to illness in humans and animals, while biotype 1A comprise strains considered nonpathogenic. Despite of the fact that Y. enterocolitica biotype 2 is of clinical importance, there is a paucity of studies in this country, which makes difficult to assess the involvement of this bacteria as a cause of illness in humans and animals, as well as to determine the impact of its presence in the environment. The aim of this work was to investigate the pathogenic potential, to determine the antimicrobial resistance profile and to verify the genetic diversity of Y. enterocolitica biotype 2 strains isolated in Brazil. Forty strains of Y. enterocolitica biotype 2 isolated from humans (5), environment (34) and animal (1), between 1979 and 1998 were studied. Besides, in the phylogenetic analyzes it was added 26 Y. enterocolitica strains belonging to the other biotypes, in order to compare the Y. enterocolitica biotype 2 strains to biotypes 1A, 1B, 3, 4 e 5. Humans and animals strains showed susceptibility to all 14 antibiotics tested. Among the 34 environment strains, seven (20.6%) were resistant to one or two antibiotics used such as amikacin, cefoxitin, gentamicin and sulfamethoxazole-trimethoprim. All the strains presented the genes inv, ail, ystA, hreP, tccC and myfA. Genes fepD and fes were detected in 39 (97.5%) strains, virF was found in three (7.5%) strains, and ystB and fepA were not detected in any strains. All the strains exhibited behavior related to virulence against the phenotypic tests of pyrazinamidase activity, esculin hydrolysis and salicin fermentation. The dendrogram of genetic similarity of Enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR (ERIC-PCR) grouped the Y. enterocolitica biotype 2 strains in five groups, designated A, B, C, D and E. All the strains, except two, showed a genetic similarity of more than 88.3%. The dendrogram of genetic similarity of Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) grouped the Y. enterocolitica biotype 2 strains in three groups, designated I, J and K. The majority of the strains (72.5%) showed a genetic similarity of more than 78.3%. The dendrogram of genetic similarity of Multilocus variable number tandem repeat analysis (MLVA) grouped the Y. enterocolitica iv biotype 2 strains in two groups, designated O and P with a genetic similarity of more than 37.7%. It is possible to conclude that the pathogenic potential of the Y. enterocolitica biotype 2 strains was highlighted by the prevalence of the majority of the virulence markers searched, as well as by the behavior related to virulence against the phenotypic tests. Some strains were resistant to antimicrobials that are the first choice for yersiniosis treatment, which can result in therapeutic failure. The results of ERIC-PCR and PFGE showed a high genetic similarity between the Y. enterocolitica biotype 2 strains, suggesting that the strains differed little over 19 years, and that the environment has been possibly a source of humans and animals infections in Brazil. The MLVA technique grouped the Y. enterocolitica biotype 2 strains according their origins, and the ERIC-PCR technique grouped the Y. enterocolitica biotypes 1A, 1B, 2, 3, 4 and 5 strains according to the different pathogenicity characteristics of each biotype.

Dentre as 18 espécies do gênero Yersinia, as espécies Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis e Y. pestis foram extensivamente caracterizadas em diversos aspectos como ecologia, epidemiologia e mecanismos de patogenicidade. Sete das 15 espécies restantes (Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii e Y. rohdei), usualmente conhecidas como Y. enterocolitica-like, até o momento, não tiveram seu potencial patogênico caracterizado e são, geralmente, consideradas não-patogênicas. Entretanto, dados da literatura sugerem que algumas dessas espécies possam causar doença. Esses dados estimularam o surgimento de questões sobre os mecanismos pelos quais as espécies de Y. enterocolitica-like possam interagir com as células do hospedeiros e causar doenças. Esse projeto teve como principal objetivo caracterizar o potencial patogênico de linhagens de Y. enterocolitica-like, especificamente das espécies Y. frederiksenii, Y. kristensenii e Y. intermedia. No presente trabalho, o potencial patogênico de 118 linhagens de Y. enterocolitica-like (50 Y. frederiksenii, 55 Y. intermedia e 13 Y. kristensenii) foi avaliado pela pesquisa da presença dos genes relacionados à virulência ail, fepA, fepD, fes, hreP, myfA, tccC, ystA, ystB e virF por PCR. Além disso, a habilidade de algumas linhagens de Yersinia de aderir e invadir células Caco-2 e HEp-2 após diferentes períodos de incubação, bem como, de sobreviver no interior de macrófagos humanos U937 foi testada. Aspectos morfológicos da adesão bacteriana foram visualizados por microscopia eletrônica. Finalmente, a presença de possíveis novos mecanismos de virulência foi avaliada a partir do sequenciamento de RNA de uma linhagem de Y. enterocolitica-like. As linhagens estudadas apresentaram os seguintes genes: Y. frederiksenii, fepA (44%), fes (44%) e ystB (18%); Y. intermedia, ail (53%), fepA (35%), fepD (2%), fes (97%), hreP (2%), ystB (2%) e tccC (35%); e Y. kristensenii, ail (62%), ystB (23%), fepA (77%), fepD (54%), fes (54%) e hreP (54%). De modo geral, as linhagens de Y. enterocolitica-like tiveram a habilidade de aderir e invadir células Caco-2 e HEp-2 inferior à da linhagem altamente patogênica Y. enterocolitica 8081. Contudo, Y. kristensenii FCF 410 e Y. frederiksenii FCF 461 apresentaram elevado potencial de invasão a células Caco-2 após cinco dias de pré-incubação, os quais foram 45 e 7,2 vezes maiores do que o controle Y. enterocolitica 8081, respectivamente, porém, o gene ail não foi detectado nessas linhagens. O ensaio de sobrevivência em macrófagos humanos U937 ii mostrou que as linhagens de Y. frederiksenii FCF 461 (40,0%) e Y. frederiksenii FCF 379 (24,6%) tiveram porcentagens de sobrevivência superior à de Y. enterocolitica 8081 (13,4%). Todavia, linhagens de Y. intermedia e Y. kristensenii apresentaram uma capacidade reduzida de sobreviver em macrófagos. A microscopia eletrônica de varredura mostrou as bactérias em contato com a filipódia celular. As bactérias foram distribuídas tanto individualmente quanto em pequenos aglomerados. Portanto, podemos concluir que a presença dos genes relacionados à virulência encontrados nas Y. enterocolitica-like estudadas indicou o possível potencial patogênico de algumas dessas linhagens. Os ensaios de adesão e invasão a células de mamíferos sugerem que a patogenicidade de Y. kristensenii e Y. frederiksenii possa ser linhagem-dependente. O ensaio de sobrevivência em macrófagos humanos U937 evidenciou o potencial patogênico de algumas linhagens de Y. frederiksenii. Em conjunto, os resultados obtidos sugerem a existência de mecanismos de virulência alternativos aos mecanismos clássicos descritos para Y. enterocolitica patogênica. Contudo, a presença de possíveis novos mecanismos de virulência não pode ser verificada, uma vez que a plataforma 454 GS Junior (Roche) não se mostrou adequada para a realização de sequenciamento de RNA de amostras provenientes de interações com células devido à baixa cobertura obtida. / Among the 18 species of the Yersinia genus, Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis and Y. pestis were extensively characterized in different subjects as ecology, epidemiology and pathogenicity mechanisms. Seven among the remaining 15 species (Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii and Y. rohdei), often called Y. enterocolitica-like have not their pathogenic potential characterized and are usually considered to be nonpathogenic. However, literature data suggest that some of these species can cause diseases. These data stimulate the upsurge of questions about the mechanisms of which Y. enterocolitica-like species may interact with host cells and cause diseases. The main objective of this preject was to characterize the pathogenic potential of Y. enterocolitica-like strains, specifically of the species Y. frederiksenii, Y. kristensenii and Y. intermedia. This work evaluated the pathogenic potential of 118 Y. enterocolitica-like strains (50 Y. frederiksenii, 55 Y. intermedia and 13 Y. kristensenii) searching for the presence of the virulence-related genes ail, fepA, fepD, fes, hreP, myfA, tccC, ystA, ystB and virF by PCR. Besides, Yersinia strains ability of adhesion and invasion to Caco-2 and HEp-2 cells after different pre-incubation periods, and its survival within human macrophages U937 were tested. Morphologic aspects of bacterial adhesion were observed by scanning electronic microscopy. Finally, the presence of new possible virulence mechanisms was evaluated through RNA sequencing of one Y. enterocolitica-like strain. The studied strains showed the following genes: Y. frederiksenii, fepA (44%), fes (44%) and ystB (18%); Y. intermedia, ail (53%), fepA (35%), fepD (2%), fes (97%), hreP (2%), ystB (2%) and tccC (35%); and Y. kristensenii, ail (62%), ystB (23%), fepA (77%), fepD (54%), fes (54%) and hreP (54%). Usually Y. enterocolitica-like strains presented less ability of adhere and invade Caco-2 and HEp-2 cells than the highly pathogenic strain Y. enterocolitica 8081. On the other hand, Y. kristensenii FCF 410 and Y. frederiksenii FCF 461 showed high potential of invasion in Caco-2 cells after 5 days of pre-incubation, which were 45 and 7.2 times higher than the control Y. enterocolitica 8081 respectively, but ail gene was not found in these strains. Survival assay in human macrophages U937 showed that Y. frederiksenii FCF 461 (40.0%) and Y. frederiksenii FCF 379 (24.6%) strains presented survival percentages higher than Y. enterocolitica 8081 (13.4%). However, Y. intermedia and Y. iv kristensenii strains showed a reduced capability of surviving in macrophages. Scanning electron microscopy showed bacteria at the surface in contact with the cellular filopodia. The bacteria were distributed either individually or in small clumps. Therefore, it may be concluded that the presence of virulence-related genes in some of the Y. enterocolitica-like strains indicated their possible pathogenic potential. Mammal cells adhesion and invasion assays suggest that the pathogenicity of Y. kristensenii and Y. frederiksenii may be strain-dependent. Human macrophages U937 surviving assay highlighted the pathogenic potential of some Y. frederiksenii strains. Together, the results suggest the existence of alternative virulence mechanisms other than the classical mechanisms described for pathogenic Y. enterocolitica. However, we could not verify the presence of possible new virulence mechanisms because 454 GS Junior (Roche) platform was not suitable for RNA sequencing of strains from cells interaction due its low coverage obtained.

Dentre as 18 espécies do gênero Yersinia, as espécies Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis e Y. pestis foram extensivamente caracterizadas em diversos aspectos como ecologia, epidemiologia e mecanismos de patogenicidade. Sete das 15 espécies restantes (Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii e Y. rohdei), usualmente conhecidas como Y. enterocolitica-like, até o momento, não tiveram seu potencial patogênico caracterizado e são, geralmente, consideradas não-patogênicas. Entretanto, dados da literatura sugerem que algumas dessas espécies possam causar doença. Esses dados estimularam o surgimento de questões sobre os mecanismos pelos quais as espécies de Y. enterocolitica-like possam interagir com as células do hospedeiros e causar doenças. Esse projeto teve como principal objetivo caracterizar o potencial patogênico de linhagens de Y. enterocolitica-like, especificamente das espécies Y. frederiksenii, Y. kristensenii e Y. intermedia. No presente trabalho, o potencial patogênico de 118 linhagens de Y. enterocolitica-like (50 Y. frederiksenii, 55 Y. intermedia e 13 Y. kristensenii) foi avaliado pela pesquisa da presença dos genes relacionados à virulência ail, fepA, fepD, fes, hreP, myfA, tccC, ystA, ystB e virF por PCR. Além disso, a habilidade de algumas linhagens de Yersinia de aderir e invadir células Caco-2 e HEp-2 após diferentes períodos de incubação, bem como, de sobreviver no interior de macrófagos humanos U937 foi testada. Aspectos morfológicos da adesão bacteriana foram visualizados por microscopia eletrônica. Finalmente, a presença de possíveis novos mecanismos de virulência foi avaliada a partir do sequenciamento de RNA de uma linhagem de Y. enterocolitica-like. As linhagens estudadas apresentaram os seguintes genes: Y. frederiksenii, fepA (44%), fes (44%) e ystB (18%); Y. intermedia, ail (53%), fepA (35%), fepD (2%), fes (97%), hreP (2%), ystB (2%) e tccC (35%); e Y. kristensenii, ail (62%), ystB (23%), fepA (77%), fepD (54%), fes (54%) e hreP (54%). De modo geral, as linhagens de Y. enterocolitica-like tiveram a habilidade de aderir e invadir células Caco-2 e HEp-2 inferior à da linhagem altamente patogênica Y. enterocolitica 8081. Contudo, Y. kristensenii FCF 410 e Y. frederiksenii FCF 461 apresentaram elevado potencial de invasão a células Caco-2 após cinco dias de pré-incubação, os quais foram 45 e 7,2 vezes maiores do que o controle Y. enterocolitica 8081, respectivamente, porém, o gene ail não foi detectado nessas linhagens. O ensaio de sobrevivência em macrófagos humanos U937 ii mostrou que as linhagens de Y. frederiksenii FCF 461 (40,0%) e Y. frederiksenii FCF 379 (24,6%) tiveram porcentagens de sobrevivência superior à de Y. enterocolitica 8081 (13,4%). Todavia, linhagens de Y. intermedia e Y. kristensenii apresentaram uma capacidade reduzida de sobreviver em macrófagos. A microscopia eletrônica de varredura mostrou as bactérias em contato com a filipódia celular. As bactérias foram distribuídas tanto individualmente quanto em pequenos aglomerados. Portanto, podemos concluir que a presença dos genes relacionados à virulência encontrados nas Y. enterocolitica-like estudadas indicou o possível potencial patogênico de algumas dessas linhagens. Os ensaios de adesão e invasão a células de mamíferos sugerem que a patogenicidade de Y. kristensenii e Y. frederiksenii possa ser linhagem-dependente. O ensaio de sobrevivência em macrófagos humanos U937 evidenciou o potencial patogênico de algumas linhagens de Y. frederiksenii. Em conjunto, os resultados obtidos sugerem a existência de mecanismos de virulência alternativos aos mecanismos clássicos descritos para Y. enterocolitica patogênica. Contudo, a presença de possíveis novos mecanismos de virulência não pode ser verificada, uma vez que a plataforma 454 GS Junior (Roche) não se mostrou adequada para a realização de sequenciamento de RNA de amostras provenientes de interações com células devido à baixa cobertura obtida. / Among the 18 species of the Yersinia genus, Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis and Y. pestis were extensively characterized in different subjects as ecology, epidemiology and pathogenicity mechanisms. Seven among the remaining 15 species (Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii and Y. rohdei), often called Y. enterocolitica-like have not their pathogenic potential characterized and are usually considered to be nonpathogenic. However, literature data suggest that some of these species can cause diseases. These data stimulate the upsurge of questions about the mechanisms of which Y. enterocolitica-like species may interact with host cells and cause diseases. The main objective of this preject was to characterize the pathogenic potential of Y. enterocolitica-like strains, specifically of the species Y. frederiksenii, Y. kristensenii and Y. intermedia. This work evaluated the pathogenic potential of 118 Y. enterocolitica-like strains (50 Y. frederiksenii, 55 Y. intermedia and 13 Y. kristensenii) searching for the presence of the virulence-related genes ail, fepA, fepD, fes, hreP, myfA, tccC, ystA, ystB and virF by PCR. Besides, Yersinia strains ability of adhesion and invasion to Caco-2 and HEp-2 cells after different pre-incubation periods, and its survival within human macrophages U937 were tested. Morphologic aspects of bacterial adhesion were observed by scanning electronic microscopy. Finally, the presence of new possible virulence mechanisms was evaluated through RNA sequencing of one Y. enterocolitica-like strain. The studied strains showed the following genes: Y. frederiksenii, fepA (44%), fes (44%) and ystB (18%); Y. intermedia, ail (53%), fepA (35%), fepD (2%), fes (97%), hreP (2%), ystB (2%) and tccC (35%); and Y. kristensenii, ail (62%), ystB (23%), fepA (77%), fepD (54%), fes (54%) and hreP (54%). Usually Y. enterocolitica-like strains presented less ability of adhere and invade Caco-2 and HEp-2 cells than the highly pathogenic strain Y. enterocolitica 8081. On the other hand, Y. kristensenii FCF 410 and Y. frederiksenii FCF 461 showed high potential of invasion in Caco-2 cells after 5 days of pre-incubation, which were 45 and 7.2 times higher than the control Y. enterocolitica 8081 respectively, but ail gene was not found in these strains. Survival assay in human macrophages U937 showed that Y. frederiksenii FCF 461 (40.0%) and Y. frederiksenii FCF 379 (24.6%) strains presented survival percentages higher than Y. enterocolitica 8081 (13.4%). However, Y. intermedia and Y. iv kristensenii strains showed a reduced capability of surviving in macrophages. Scanning electron microscopy showed bacteria at the surface in contact with the cellular filopodia. The bacteria were distributed either individually or in small clumps. Therefore, it may be concluded that the presence of virulence-related genes in some of the Y. enterocolitica-like strains indicated their possible pathogenic potential. Mammal cells adhesion and invasion assays suggest that the pathogenicity of Y. kristensenii and Y. frederiksenii may be strain-dependent. Human macrophages U937 surviving assay highlighted the pathogenic potential of some Y. frederiksenii strains. Together, the results suggest the existence of alternative virulence mechanisms other than the classical mechanisms described for pathogenic Y. enterocolitica. However, we could not verify the presence of possible new virulence mechanisms because 454 GS Junior (Roche) platform was not suitable for RNA sequencing of strains from cells interaction due its low coverage obtained.