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Expression Of Cholera Toxin B Subunit-rotavirus Nsp4 Enterotoxin Fusion Protein In Transgenic Chloroplasts

Kalluri, Anila 01 January 2005 (has links)
Rotavirus, the major cause of life-threatening infantile gastroenteritis, is a member of the Reoviridae family and is considered to be the single most important cause of virus-based severe diarrheal illness in infants and young children particularly 6 months to 2 years of age in industrialized and developing countries. Infection in infants and young children is often accompanied by severe life threatening diarrhea, most commonly following primary infection. Diarrhea is the major cause of death among children around the world. Responsible for 4 to 6 million deaths per year according to the World Health Organization (WHO), diarrhea is especially dangerous for infants and young children. Globally, it is estimated that 1.4 billion episodes of diarrhea occur in children less than five years of age annually. In the United States alone, rotavirus causes more than 3 million cases of childhood diarrhea each year, leading to an estimated 55,000 to 100,000 hospitalizations and 20 to 100 deaths. And is a major cause of mortality for children in developing countries with approximately one million deaths annually. Rotaviruses belong to the family Reoviridae and are spherical 70-nm particles. The virus genome contains 11 segments of double-stranded RNA, each encoding a viral capsid or nonstructural protein. The identification of a rotavirus nonstructural protein gene (NSP4) encoding a peptide, which functions both as a viral enterotoxin and as a factor involved in the acquisition of host cell membrane during virus budding from cells, provides a new approach for mucosal immunization. Protein expression through chloroplast transformation system offers a number of advantages like high level of transgene expression, transgene containment via maternal inheritance, lack of gene silencing and position effect due to site specific gene integration and also the possibility of multi gene engineering in single transformation event. It is also an environmentally friendly approach due to effective gene containment and lack of transgene expression in pollen. To achieve an enhanced immune response to rotavirus infection, a fusion gene encoding the cholera toxin B subunit linked to rotavirus enterotoxin 90 aa protein (CTB-NSP490) was introduced into transgenic chloroplast and was transformed into chloroplast genome of Nicotiana tabacum by homologous recombination. The chloroplast integration of CTB-NSP4(90) fusion gene was confirmed in transgenic tobacco plants by PCR analysis. Southern blot analysis further confirmed site specific gene integration and homoplasmy. Immunoblot analysis of transformed chloroplast confirmed the expression of CTBNSP490 fusion protein both in monomeric and pentameric forms that retained the binding affinity to the enterocytes GM1 ganglioside receptor. Expression levels of CTB-NSP4 protein was quantified by GM1 ganglioside binding ELISA assay; mature leaves expressed CTB-NSP4 fusion protein to upto 2.45 % in total soluble protein, 100-400 fold higher than nuclear expression which was only 0.006%-0.026%. Antibody titration and virus challenge experiments will be performed in mice at Loma Linda University to evaluate the antigenic and protective properties of the chloroplast derived CTB-NSP4 fusion protein.
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Determination of the Molecular Basis for the Difference in Potency between Shiga Toxins 1 and 2

Flagler, Michael J. 09 April 2010 (has links)
No description available.
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Modulation du trafic des molécules de classe II par l’isoforme p35 de la chaîne invariante

Cloutier, Maryse 07 1900 (has links)
La chaîne invariante (Ii) agit à titre de chaperon dans l’assemblage et le trafic des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMHII). Chez l’humain, les deux isoformes prédominantes, p33 et p35, diffèrent par la présence d’un motif di-arginine (RXR). Ce dernier permet la rétention de p35 au réticulum endoplasmique (RE) jusqu’à son masquage par une molécule de CMHII. La chaîne invariante forme des trimères auxquels s’associent successivement jusqu’à trois dimères αß de CMHII résultant en la formation de pentamères, heptamères et nonamères. Toutefois, la stœchiométrie exacte des complexes Ii-CMHII qui quittent le RE et le mécanisme permettant le masquage du motif RXR demeurent un sujet de débats. Dans un premier temps, nous avons examiné par une approche fonctionnelle la stœchiométrie des complexes formés autour de p33 et de p35. Nous avons observé que p35 engendre la formation de complexes nonamériques (αßIi)3 et permet l’incorporation de différents isotypes de CMHII autour d’un même trimère de p35 alors que p33 facilite la formation de pentamères (αß)1Ii3. Lors de l’étude du masquage du motif RxR par les CMHII, nous avons montré que son inactivation requiert une interaction directe (en cis) entre les sous-unités p35 et CMHII, résultant en une rétention des trimères de p35 insaturés au RE. Aussi, nous avons observé que contrairement aux complexes p33-CMHII, les complexes p35-CMHII sont retenus au RE lorsque coexprimés avec la protéine NleA de la bactérie Escherichia coli entérohémorragique. Comme l’expression de NleA interfère avec la formation des vésicules COPII responsable de l’export du RE, nous supposons que la sortie du RE des complexes p35-CMHII dépend des vésicules COPII alors que la sortie des complexes formés autour de l’isoforme p33 est indépendante de la formation de ces vésicules. La trimérisation d’Ii représente la toute première étape dans la formation des complexes Ii-CMHII. Deux domaines d’Ii permettent la formation de trimères; le domaine de trimérisation (TRIM) et le domaine transmembranaire (TM). Nous nous sommes intéressés à la nécessité de ces domaines dans la trimérisation de la chaîne et la formation subséquente de complexes avec les CMHII. Nous avons démontré que le domaine TRIM n’est pas essentiel à la trimérisation de la chaîne, à la formation de pentamères et de nonamères ainsi qu’au trafic adéquat de ces complexes Ii-CMHII dans la cellule. En absence des domaines TM d’Ii et des CMHII, nous avons observé la formation de complexes pseudo-nonamériques. Ceci suppose que la présence de ce domaine n’est pas un prérequis à la formation de nonamères. En conséquence, la présence d’un seul domaine de trimérisation de Ii est requise pour la formation de trimères et de complexes nonamériques. L’ensemble de nos résultats démontrent que la fonction de p35 n’est pas redondante à celle de p33. p35 influence de manière distincte le trafic des CMHII puisqu’il affecte la stœchiométrie des sous-unités incorporées aux complexes Ii- CMHII. / The invariant chain (Ii) assists in the folding and trafficking of MHC class II molecules (MHCII). Four different isoforms of the human Ii have been described (p33, p35, p41 and p43). The main isoforms, p33 and p35, differ by the presence of a di-arginine (RXR) endoplasmic reticulum (ER) retention motif in p35. This motif is inactivated upon binding of MHCII. In the ER, p33 and p35 assemble into trimers before associating with MHCII. The sequential binding of up to three MHCII αß dimers to Ii trimers results in the formation of pentamers, heptamers and nonamers. However, the exact stoichiometry of the Ii-MHCII complex and the mechanism allowing shielding of the ER retention motif remain a matter of debate. To shed light on these issues, we chose a functional approach to examine the stoichiometry of complexes formed around the p33 and p35 isoforms. We showed that p35 promotes formation of nonameric complexes (αßIi)3 while formation of pentameric complexes (αß)1Ii3 was observed for p33. We then showed that formation of nonameric complexes can result in the inclusion of distinct MHCII isotypes around a single trimeric p35 scaffold. When answering the question wetter masking of the p35 RXR motif by MHCII results in the formation of nonamers, we showed that the actual inactivation of motif requires a direct cis-interaction between p35 and the MHCII, precluding ER egress of unsaturated p35 trimers. Interestingly, as opposed to p33-MHCII complexes, p35-MHCII complexes remained in the ER when co-expressed with the NleA protein of enterohaemorrhagic Escherichia coli. Expression of this bacterial protein is thought to interfere with the formation of COPII vesicles, leading to the conjecture that p35-MHCII and p33-MHCII complexes exit the ER in a COPII-dependant and COPII-independent manner, respectively. The trimerization of Ii represents the very first step in the formation of Ii-MHCII complex. Two domains of Ii, the trimerization domain (TRIM) and the transmembrane (TM) domain have been shown to trigger the trimerization of the chain. We focused our attention on the requirement of the two trimerization domains in Ii self-association and in the formation of pentameric and nonameric complexes. We showed that the TRIM domain of Ii is not essential for the chain’s trimerization, formation of pentamers and nonamers and for proper traffic with MHCII molecules. In absence of the Ii and MHCII TM domains, we observed the formation of a nonamer-like structure hereby suggesting that the presence of this domain is not a prerequisite for nomamer complex formation. Consequently, our results showed that either Ii trimerization domains are sufficient for Ii trimer formation and nonameric complex trafficking. Taken together, our results demonstrate that the function of the p35 isoform is not redundant, influencing distinctively MHCII trafficking as the subunit stoichiometry of oligomeric Ii/MHCII complexes is affected by p35.
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T cell immunity and postpartum control of the hepatitis C virus

Coss, Samantha Lynn 18 December 2018 (has links)
No description available.
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Dynamic chemistry : nucleobase recognition by synthetic receptors and cis-trans acylhydrazone isomerism / Chimie dynamique : reconnaissance de nucléobases par des récepteurs synthétiques et isomérie cis-trans d'hydrazones acylées

Marshall, Tracey 27 January 2012 (has links)
Chimie dynamique: reconnaissance de nucléobases par des récepteurs synthétiques et isomérie cis-trans d'hydrazones acylées.Ce travail traite du développement des systèmes moléculaires qui peuvent s'adapter à l'addition de substances qui agissent comme un gabarit. Cette approche permet d'isoler une espèce majeure à partir d'un mélange de composés par le biais de la chimie combinatoire dynamique (CCD). La première partie de ma thèse de doctorat inclus l'utilisation d'un ADN simple brin (ADNsb) comme un gabarit pour le transfert d'information par auto-assemblage de récepteurs sans avoir besoin d'enzyme. De nouveaux récepteurs de l'adénine et de la guanine (pinces A et G) solubles dans l'eau ont été conçues dans ce but. Une approche utilisant la résonance magnétique nucléaire (RMN) a été utilisée pour déterminer l'affinité de liaison comme preuve d'une reconnaissance spécifique et efficace. Une évaluation dans l'eau par dichroïsme circulaire (CD) et mesure de la température de fusion par UV (Tm) a été réalisée. Cela a permis de tester respectivement la capacité d'auto-assemblage entre les pinces et un modèle ADNsb, et la force du processus de coopérativité. La deuxième partie de ce travail est axée sur le tri spontanné de motifs pyridine acylhydrazone et sur les configurations intéressantes qu'ils adoptent. Nous avons étudié la synthèse d'une série de motifs pyridine acylhydrazone: dimère, trimères et pentamères. Des études RMN ont permis d'évaluer les changements dans l'équilibre configurationnel cis / trans de ces systèmes dynamiques. Les études ont montré que l'équilibre attendu est biaise la cis acylhydrazone pyridine isomère a été observée par diffraction des rayons X. / Dynamic chemistry: nucleobase recognition by synthetic receptors and cis-trans acylhydrazone isomerism. This work deals with the development of molecular systems which can adapt upon the addition of substances that act as templates. This approach enables one major species to be identified from a mixture of compounds through the use of dynamic combinatorial chemistry (DCC). The first part of my PhD included the use of a single stranded DNA (ssDNA) as a template for information transfer via the self-assembly of receptors without the need for enzymes. New water soluble adenine and guanine receptors (A and G clamps) were designed and synthesised for this purpose. Nuclear magnetic resonance (NMR) titration studies were carried out to calculate the binding affinity and as a proof of specific and efficient recognition. An assessment in water via circular dichroism (CD) and UV temperature melting (Tm) studies was carried out. This tested the ability for self-assembly between the clamps and a ssDNA template and the strength of the cooperative process respectively. The second part of my PhD focused on the self-sorting of acylhydrazone pyridine motifs and the interesting configurations they adopt. The feasibility to synthesise these acylhydrazone pyridine motifs (dimer, trimers and pentamers) was investigated. X-ray and NMR studies showed that the equilibrium was found to be biased in an unusual way, and the cis acylhydrazone pyridine isomer was observed.

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