Dans le cadre d'un programme de recherche sur la mise au point de nanostructures peptidiques ayant une activité membranaire, des membres de l'équipe ont démontré que les peptides synthétiques, neutres et de 14 acides aminés avaient des propriétés cytolytiques comparables à celles des peptides cationiques. Le présent mémoire propose une étude sur le design, le développement et la caractérisation de nanostructures peptidiques à visée antimicrobienne. Diverses approches pour contrer le phénomène de résistance antimicrobienne ont été employées par plusieurs groupes de recherche. L'approche de notre laboratoire est présentée au chapitre 3. Les études de perméabilité membranaire de la banque de peptides synthétisés (chapitre 4) ainsi que les études conformationnelles (chapitre 5) ont permis d'en apprendre davantage sur les déterminants moléculaires responsables de l'activité antimicrobienne. La sélectivité du composé neutre de départ a été améliorée et nous savons que les peptides sélectifs adoptent une conformation de feuillet-P en milieu membranaire.

Les pro-protéines convertases (PCs), nommées PC1/3, PC2, furine, PACE4, PC5/6, PC4 et PC7, sont impliquées dans l'activation de précurseurs protéiques de par le clivage endoprotéolytique qu'elles effectuent en C-terminal des paires de résidus basiques Lys/Arg-Arg. Ces protéases à sérine occupent des fonctions dans l'initiation et le maintient [i.e. maintien] du phénotype néoplasique puisqu'elles activent, entre autres, des protéines reliées à la prolifération, l'adhésion et l'invasion cellulaire cancéreuse. Étant donné le caractère unique et redondant dans la fonctionnalité des PCs, il est important de distinguer les rôles spécifiques tenus par chacune. Ainsi, l'implication de PACE4 dans la progression cancéreuse est de plus en plus investiguée. L'inhibiteur peptidique spécifique envers PACE4, LLLLRVKR (Multi-Leu ou ML), offre la possibilité d'étudier les impacts d'une inhibition de PACE4 sur les traits distinctifs d'une lignée cancéreuse. Pour introduire ces travaux, il a été prouvé que la lignée cancéreuse humaine de la prostate DU145 surexprimait uniquement PACE4. Nous démontrons par essais MTT que le ML réduit de 50% la prolifération de ce modèle. Suite à l'optimisation de la pénétration et de la stabilité du peptide, l'inhibition de la prolifération obtenue fut quasi complète. Des travaux ont aussi été réalisés afin de mieux comprendre ces effets. La formation de colonies, la viabilité cellulaire, le cycle de division et l'expression de diverses protéines furent étudiées. Enfin, la progression des tumeurs DU145 fut abolie par des traitements intra tumoraux avec le ML. Le ML est donc un inhibiteur de PACE4 qui bloque la progression tumorale, ce qui lui confère une application thérapeutique potentielle.

Thèse de doctorat : Chimie : Strasbourg 1 : 2007. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 12 p.

Le présent mémoire porte sur le développement d'une approche générale en vue de la préparation et de l'utilisation de canaux ioniques artificiels pour la réalisation de biosenseurs. Cependant, l'utilisation de ces nanostructures peptidiques dans des dispositifs pratiques nécessite des modifications. Nous rapportons ici la modification sélective des extrémités de nos canaux ioniques par des groupements permettant leur attachement à une surface électro-attractive et la reconnaissance d'analytes biologiques. La première partie consiste en une description générale des biosenseurs, ainsi qu'en une revue des principaux modèles proposés dans la littérature de protéines «canal» d'origine naturelle ou artificielle comme composantes des ces outils de biodétection. Le second chapitre présente notre approche générale, les molécules cibles utilisées pour faire l'ingénierie de notre système modèle, de même que les méthodes de synthèse employées pour l'élaboration et la modification sélective des extrémités de nos nanostructures peptidiques. La troisième partie est consacrée à l'attachement du peptide à des surfaces d'or. La quatrième partie présente les différentes techniques utilisées pour la caractérisation des canaux ioniques et des nanoparticules d'or.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdorales, 2016-2017 / Cette thèse porte sur l’élucidation du mode d’action de peptides synthétiques qui sont des analogues cationiques du peptide modèle 14-mère. À l’instar des peptides antimicrobiens naturels, ces peptides synthétiques induisent des perturbations membranaires et une meilleure connaissance de leur mode d’action s’avère un élément déterminant pour le design de nouveaux peptides synthétiques qui présenteront une activité antibactérienne maximale et une activité hémolytique moindre. Afin de mieux caractériser le rôle de certains déterminants moléculaires sur l’interaction membranaire, nous avons sélectionné deux catégories de peptides, soit des analogues qui ont une structure secondaire en hélice α et qui sont non sélectifs à l’égard des membranes mimétiques de bactérie et des analogues qui forment des feuillets β intermoléculaires et qui sont sélectifs à l’endroit des membranes mimétiques de bactérie. Les études réalisées ont fait intervenir plusieurs techniques spectroscopiques comme la spectroscopie infrarouge, la spectroscopie RMN des solides et la spectroscopie de fluorescence. Tout d’abord, nous avons vérifié le rôle des interactions électrostatiques sur l’interaction membranaire, et ce, en effectuant une étude comparative entre des analogues cationiques et anioniques. Les résultats obtenus démontrent que les peptides anioniques et cationiques ont un impact similaire sur la dynamique des têtes polaires des phospholipides et l’ordre conformationnel des chaînes acyle. Cependant, les tests de relargage ont démontré que seuls les peptides cationiques formant des feuillets β intermoléculaires sont sélectifs alors que les homologues anioniques qui forment des feuillets β intermoléculaires sont inactifs en présence des membranes mimétiques de bactéries et de cellules eucaryotes. Ensuite, pour mieux comprendre le mode de perturbation membranaire des peptides cationiques qui sont non sélectifs et sélectifs, nous avons effectué des études par spectroscopie RMN des solides sur des échantillons de peptides reconstitués dans des bicouches lipidiques mécaniquement orientées entre des lamelles de verre ainsi que échantillons bicellaires. Les résultats ont démontré que les peptides sélectifs perturbaient davantage l’orientation des phospholipides zwitterioniques en comparaison avec les peptides non sélectifs. De plus, les simulations spectrales réalisées sur les spectres expérimentaux suggèrent que les peptides non sélectifs induisent la formation de pores ayant une géométrie toroïdale. En terminant, nous avons étudié la topologie membranaire et la localisation dans la membrane d’un peptide ayant une conformation en hélice α (R5R10) et d’un peptide formant des feuillets β intermoléculaires (R4R11). Les résultats obtenus par RMN de l’azote-15 indiquent que le peptide R5R10 est localisé au niveau de la surface membranaire avec une certaine hétérogénéité dans l’orientation. Cette conclusion est soutenue par des expériences réalisées par spectroscopie infrarouge en mode ATR. Des mesures de distances à partir de la technique REDOR entre les phospholipides et les peptides ont permis de constater que le peptide en hélice α est localisé à proximité du noyau phosphore alors que le peptide en feuillets β agrégés est localisé plus superficiellement au niveau de la surface membranaire. Cette différence de pénétration dans la région interfaciale pourrait expliquer la différence de sélectivité entre le peptide R5R10 (non sélectif) et R4R11 (sélectif). De plus, les tests de relargage de la calcéine ont démontré que les deux peptides induisent une contrainte de courbure positive à la membrane lipidique. Ainsi, l’alliance des résultats suggèrent que le mode de perturbation membranaire des peptides R5R10 et R4R11 est similaire au mécanisme modèle du type sinking-raft. / This thesis is related to the determination of the mode of action of synthetic peptides that are cationic derivatives of the model 14-mer peptide. Similarly to the natural antimicrobial peptides, these synthetic peptides induce membrane perturbations and a better understanding of their mechanism of action is of primary importance to design new synthetic derivatives displaying higher antimicrobial and lower hemolytic activities. In order to characterize the role of certain molecular determinants on the membrane interactions, we have focused on two categories of peptides, namely peptides adopting an α-helical conformation which are non-selective towards bacterial mimetic membranes and peptides forming intermolecular β-sheet structures which are selective towards bacterial mimetic membranes. The experiments were carried out with several spectroscopic techniques such as infrared spectroscopy, solid-state NMR spectroscopy and fluorescence spectroscopy. First, we have studied the effect of electrostatic interactions on the membrane interactions by doing a comparative study between cationic and anionic analogs. The results show that both the anionic and the cationic derivatives have a similar impact on the dynamics of the phospholipid polar headgroups and on the conformational order of the acyl chains. However, dye-release experiments have shown that only the cationic derivatives forming intermolecular β-sheet structures are selective whereas their homologous β-sheet aggregated anionic peptides are inactive in the presence of both bacterial and eukaryotic mimetic membranes Then, to better understand the mode of membrane perturbation of non-selective and selective peptides, we have performed solid-state NMR experiments on peptides reconstituted in oriented samples of phospholipids. The results have shown that the selective peptides disrupt even more the orientation of zwitterionic phospholipids than the non selective peptides. In addition, the spectral simulations performed on experimental spectra suggest that the non-selective peptides induce the formation of pores having a toroidal geometry. To conclude, we have studied the membrane topology and the location into the membrane of the α-helical peptide R5R10 and the β-sheet aggregated peptide R4R11. The results obtained using ¹⁵N NMR indicate that the α-helical peptide is located on the membrane surface with a certain degree of heterogeneity. This conclusion is also supported by experiments performed using ATR spectroscopy. Distance measurements between phospholipids and peptides using the REDOR technique indicate that the α-helical peptide is near the phosphate nucleus of phospholipids whereas the β-sheet aggregated peptide is superficially located on the membrane surface. The difference of penetration into the interfacial region could explain the difference of selectivity between the R5R10 peptide (non selective) and the R4R11 peptide (selective). In addition, dye-release experiments have shown that both peptides induce a negative curvature strain to the membrane. Therefore, by taking into account all the results, it seems that the mechanism of action of these peptides is similar to the sinking-raft model mechanism.

Les médications intra canalaires, comme l’hydroxyde de calcium, sont utilisées en endodontie pour désinfecter le système radiculaire. Mais, les traitements endodontiques peuvent échouer en raison d’une infection persistante causée principalement par la subsistance de certaines bactéries dans le canal dentaire. Pour contrôler la croissance bactérienne, l’usage de peptides antimicrobiens comme la dermaseptine semble être une alternative prometteuse. Les objectifs de ce projet de recherche étaient de comparer les propriétés antibactériennes de la dermaseptine S1 (DS1) et de l’Ultracal XS (hydroxyde de calcium) sur la croissance d’Enterococcus faecalis et leur compatibilité respective sur les cellules souches de la pulpe dentaire. Méthode : E. faecalis est cultivé en présence ou non d’Ultracal XS (Ultradent), d’hydroxyde de calcium, de sulfate de baryum, de propylène glycol ou de DS1 (10, 50 and 100 µm/mL). La croissance bactérienne est évaluée pendant 24 h par spectrophotométrie. Les effets des différents composés sur les cellules souches pulpaires furent évalués par microscope optique à 24 et 48 h et par test de MTT à 48 h. Les données furent collectées de 3 expériences et soumises à une analyse statistique ANOVA à une issue et au test de Tukey. Résultats : L’Ultracal XS diminue légèrement la croissance bactérienne, alors que l’hydroxyde de calcium pur, le sulfate de baryum et le propylène glycol n’ont pas eu d’effet sur la bactérie. La DS1, même à de faibles concentrations, a significativement réduit la croissance bactérienne. L’effet inhibiteur a été présent pendant 24 heures, avec des concentrations de DS1 de 50 et 100 µm/mL. De plus, l’Ultracal XS et ses constituants ont montré un effet toxique important sur l’adhésion et la croissance des cellules souches pulpaires, alors que la DS1 montre seulement un effet toxique modéré à des concentrations de 100 µm/mL. Conclusion : L’Ultracal XS diminue modérément la croissance d’ E. faecalis alors que la DS1 la réduit de façon importante. Les effets toxiques au niveau des cellules souches pulpaires sont modérés pour la DS1 en comparaison avec l'Ultracal XS. Cette étude a démontré qu’il pourrait être intéressant d’utiliser les dermaseptines en médication intracanalaire en endodontie. / Intracanal medication is used in endodontics to disinfect the root canal system, but sometimes endodontic treatments fail due to the persistence of infection. Antimicrobial peptides such as dermaseptins might be a good alternative to calcium hydroxide for intracanal medication.Endodontic treatments can fail due to the persistence of infection. Antimicrobial peptidesmight be a good alternative to calcium hydroxide for intracanal medication. This study aimsto compare the antimicrobial properties of dermaseptin S1 (DS1) and Ultracal XS against E.faecalis growth and their compatibility with dental pulp stem cells (DPSC). Methods: E.faecalis cells were cultured in the presence or not of Ultracal XS (Ultradent), calcium hydroxide, barium sulfate, propylene glycol, or DS1 (10, 50, and 100 µm/mL). The bacterial growth was assessed over 24 h by spectrophotometry. The effect of the different chemicals on the shape and growth of DPSCs were evaluated using an optical microscope at 24 and 48h and an MTT assay after 48 h. Data were collected from 3 experiments and subjected tostatistical analysis using one-way ANOVA and Tukey’s test. Results: Ultracal XS, slightly decreased the growth of bacteria, while calcium hydroxide, barium sulfate, and propyleneglycol do not affect the growth of E. faecalis. Interestingly, DS1 significantly reduced thegrowth of E. faecalis. The inhibitory effect was present up to 24 h culture, with 50 and 100ug/ml of DS1. Ultracal XS and its constituents have a high toxic effect on DPSC adhesion and growth, while DS1 showed moderate adv erse effects only at high concentrations (100µg/ml). Conclusions: Ultracal XS moderately, while DS1 highly decreased the growth of E.faecalis. The toxic effect of DS1 on DPSCs was moderate compared to Ultracal XS. This study demonstrated the potential use of dermaseptin as an intracanal medication.

Cette thèse porte sur la détermination des mécanismes de perturbation membranaire de peptides amphiphiles synthétiques de 14 et 21 acides aminés par spectroscopies de RMN à l'état solide et infrarouge. Des études antérieures ont démontré que les peptides 14- et 21- mères possèdent des activités membranaires s'apparentant à celles observées pour les peptides antimicrobiens naturels et leurs analogues. Dans le but de mieux comprendre la nature des interactions impliquées dans leurs modes d'action, et ainsi faire le design et la synthèse de peptides synthétiques possédant une activité antimicrobienne sélective, nous avons étudié les peptides 14- et 21-mères en interaction avec différentes membranes lipidiques modèles. Les membranes modèles utilisées dans cette étude sont les vésicules multilamellaires zwitterioniques et anioniques, les bicouches lipidiques orientées entre des plaques de verre et les bicelles. Dans un premier temps, nous avons étudié l'effet des peptides 14- et 21-mères sur la conformation des têtes polaires et l'ordre orientationnel des chaînes acyle des phospholipides constituant les membranes modèles par spectroscopie de RMN du phosphore-31 et du deutérium. Ces résultats ont révélé que les peptides modèles perturbent davantage la région polaire des bicouches lipidiques, et ont un effet moindre sur les chaînes acyle des lipides. Nous avons également déterminé par spectroscopie de RMN de Pazote-15 que les peptides 14- et 21-mères adoptent une orientation en surface des bicouches orientées entre des plaques de verre. Des mesures de distances hétéronucléaires intermoléculaires ont également confirmé la proximité du peptide 14-mère avec les têtes polaires des lipides DMPC. Dans un dernier temps, nous avons étudié les interactions membranaires et la diffusion rotationnelle du peptide 21-mère en interaction avec des bicelles par RMN P, H et 15N. Les résultats ont révélé que le peptide 21-mère stabilise la structure des bicelles et n'adopte pas une distribution circulaire d'orientation dans le plan des bicelles. Finalement, la dynamique du peptide 21-mère incorporé à des vésicules multilamellaires de DMPC a été étudiée par des expériences en RMN du carbone-13 via l'analyse du nombre et de l'intensité des bandes de rotation, et ces analyses ont révélé que le peptide 21-mère est immobilisé dans son interaction membranaire. / This thesis is related to the determination of the membrane perturbation mechanisms of 14 and 21 amino acid amphipathic synthetic peptides by solid-state NMR and infrared spectroscopies. Previous studies have shown that the 14- and 21-mer peptides exhibit membrane activities similar to those observed for natural antimicrobial peptides and their related analogues. To better understand the type of interactions that are involved in the modes of membrane perturbation of the 14- and 21 -mer peptides, and then to plan the design and synthesis of synthetic peptides with selective antimicrobial activity, we have studied the interaction between the peptides and a variety of model membranes. The types of model membranes used in these studies are zwitterionic and anionic multilamellar vesicles, oriented bilayers stacked between glass plates and bicelles. We first investigated the effects of the 14- and 21-mer peptides on the conformation of polar headgroups and orientational order of lipid acyl chains by phosphorus-31 and deuterium NMR spectroscopy. The results reveal that the 14- and 21-mer model peptides perturb to a greater extent the polar region of phospholipid bilayers, and to a lesser extent the lipid hydrophobic acyl chains. Nitrogen-15 NMR results indicate that the 14- and 21-mer peptides reside at the surface of bilayers stacked between glass plates. Also, intermolecular heteronuclear distance measurements confirm the proximity of the 14-mer peptide to DMPC lipid polar headgroups. We have also studied the membrane interaction and rotational diffusion of the 21- mer peptide in interaction with bicelles by 31P, 2H and 15N NMR. The results reveal that the 21-mer peptide stabilizes the bicelle structure and do not show a circular orientational distribution in the bicelle planar region. Finally, the 21-mer peptide dynamics has been studied by l3C NMR experiments via the analysis of the number and intensity of spinning sidebands, and the results suggest that the 21-mer peptide is immobilized upon binding.

Une base de données regroupant l'ensemble des peptides antimicrobiens provenant de protéines laitières et décrits dans la littérature a été réalisée, révélant le fait que peu de peptides antimicrobiens ont été identifiés à partir d'un mélange de protéines du lactosérum ou de produits laitiers. D'autre part, un hydrolysat d'isolat de protéines sériques a été fractionné par chromatographie liquide haute performance afin de séparer spécifiquement des fractions contenant des peptides antimicrobiens. Cinq fractions antimicrobiennes ont été obtenues et les peptides responsables de l'activité ont été identifiés. En parallèle, cinq extraits peptidiques hydrosolubles ont été isolés de fromages canadiens. Deux de ces extraits ont révélé une activité antimicrobienne et confirme la présence de peptides antimicrobiens dans les produits laitiers. Les protéines laitières ont ainsi démontré leur capacité à générer des peptides antimicrobiens après hydrolyse.

L'obésité est devenue un problème mondial, qui est définie comme une augmentation du poids. L'obésité peut être influencée par la diète, la génétique, les médicaments et l'environnement. Les traitements pour l'obésité comme les interventions diététiques et les médicaments, cependant, échouent souvent, tandis que les interventions chirurgicales ont des taux de succès élevé. Le microbiote intestinal s'est avéré être impliqué dans le développement de l'obésité. Le microbiome est un ensemble de microbiote composé majoritairement de bactéries commensales et mutualistes, vivant en symbiose avec l'hôte et intervenant dans la digestion, le système immunitaire et le contrôle des pathogènes. Le microbiote intestinal est également impliqué dans la régulation du système endocannabinoïde (ECS). L'endocannabinoidome, l'extension du ECS, est un système de signalisation lipidique complexe, qui s'est avérée être dérégulée pendant l'obésité. Récemment, le peptide antimicrobien exprimé par le foie 2 (LEAP2) s'est avéré être un antagoniste du récepteur à la ghréline, à la suite d'une gastrectomie verticale. Cependant, sa régulation, son rôle physiologique et mécanisme d'action ne sont pas bien connus. Nous émettons l'hypothèse que Leap2 est dérégulée durant l'obésité et l'endotoxémie métabolique, et pourrait être régulée par le microbiote intestinal et/ou l'ECS, et en réponse à différent type de chirurgie bariatrique. Par conséquent, j'ai analysé l'expression de Leap2 dans différents modèles de rongeurs d'obésité, de souris sans germes (GF), de rats ayant subi quatre chirurgies bariatriques différentes, ainsi que des modèles in vitro. Nous montrons que dans certains modèles d'obésité, l'expression de Leap2 est modifiée dans l'intestin grêle. Ces changements peuvent être associés à des altérations du microbiome intestinal, comme les expériences sur des souris GF qui ont montré que l'expression de Leap2 était augmentée dans le jéjunum, et que cela est inversé à la suite d'une recolonisation avec une transplantation fécale. Enfin, nous montrons que, in vitro, le récepteur Pparg régule fortement l'expression de Leap2 dans les entérocytes dérivés des Caco-2. / Obesity has become a worldwide problem, and is defined as an increase in body weight, which can be influenced by diet, genetics, drugs and the environment. Treatments of obesity such as dietary interventions and drugs, however, often fail, whereas surgical interventions have high success rates. The gut microbiome has been shown to be involved in the development of obesity. The microbiome is the assembly of microbiota and their molecular warehouse. The microbiota is composed of mostly commensal and mutualist bacteria, living in symbiosis with the host, and is involved in the regulation of digestion, immune system and control of pathogens. Gut microbiota have been suggested to be involved in the regulation of the endocannabinoid system (ECS). The endocannabinoidome, an extension of the ECS, is a complex lipid signalling system that has been found to be dysregulated during obesity. Recently, liver-expressed antimicrobial peptide 2 (LEAP2) was shown to be an antagonist of the ghrelin receptor, following vertical sleeve gastrectomy. However, its regulation, physiological roles and mechanisms of action are not well known. We hypothesize that Leap2 expression is dysregulated during obesity and metabolic endotoxaemia, and might be regulated by the gut microbiome and/or the ECS and in response to different types of bariatric surgery. Therefore, I analyzed Leap2 expression in different rodent models of obesity, germ-free (GF) mice and rats that underwent four different types of bariatric surgery, as well as in vitro models. We show that in some models of obesity Leap2 expression is altered in the small intestine. These changes might be associated with alterations in the gut microbiome, as experiments in GF mice showed that Leap2 expression is increased in the jejunum of GF mice, and that this is reversed upon conventionalization of the mice with fecal microbiota transplantation. Finally, we show that, in vitro, Pparg receptor strongly upregulates Leap2 expression in Caco-2-derived enterocytes.

Le présent mémoire expose nos efforts dans le design, la synthèse ainsi que la caractérisation de nouvelles nanostructures peptidiques hélicoïdales pour la détection protéique. Le sujet sera divisé en deux volets. Premièrement, nous présenterons la synthèse de nanotransducteurs peptidiques pour la fonctionnalisation de pointes AFM pour la mesure de force de reconnaissance monomoléculaire. Deuxièmement, nous rapporterons la synthèse canaux ioniques artificiels peptidiques pour la détection de protéines par des essais de fluorescence. Une attention particulière sera portée aux efforts de synthèse ayant permis la fonctionnalisation terminale de peptides avec des espèces glycosidiques servant d’élément de reconnaissance de protéines via une stratégie de couplage de modules par cyclisation azoture-alcyne catalysée au cuivre. / This manuscript reports our results in the design, synthesis and characterization of novel helical peptide nanostructures to be used for the detection of proteins. The work is divided in two parts. The first part deals with the synthesis of peptide-based nanotransducers used for the functionalization AFM tips to perform single molecule recognition force spectroscopy. The second part reports the synthesis of peptide-based artificiel ion channels to be used as sensing elements in fluorescence protein detection assays. A special emphasis is put on our synthetic efforts leading to the terminal functionalization of peptides with glycosidic species for use as a protein recognition elements using a copper catalysed azide-alkyne cycloaddition coupling.