La peptidyl-ARNt hydrolase est une enzyme qui hydrolyse les peptidyl-ARNt issus d'une terminaison prématurée de la traduction. Cette protéine est essentielle à la viabilité des bactéries, mais pas à celle des eucaryotes, ce qui fait d'elle une cible potentielle pour l'action d'anti-bactériens. Cela justifie également qu'on cherche à cartographier l'interaction de cette protéine avec son substrat, pour faciliter la conception d'inhibiteur. Les tentatives d'obtention de cristaux de complexes enzyme:analogue de substrat étant restées vaines, nous avons choisi d'étudier de tels complexes en solution, par RMN. Grâce à un double marquage 15N/13C, nous avons tout d'abord attribué les fréquences de résonance des atomes du squelette de la protéine et d'une grande partie des chaînes latérale. Nous avons ensuite étudié l'interaction entre la PTH d'E. coli et un analogue de son substrat synthétisé chimiquement, la diacétyl-Lys-(3'NH)-adénosine. Cette étude nous a permis de caractériser le rôle de nombreux résidus du site actif, notamment celui d'une phénylalanine (F66) interagissant via son cycle aromatique avec l'adénine 3'-terminale du substrat, celui d'une asparagine (N114) stabilisant une molécule d'eau responsable de l'hydrolyse du substrat et celui d'une autre asparagine (N10) permettant à la PTH de discriminer positivement les peptidyl-ARNt par rapport aux aminoacyl-ARNt. Nous avons aussi étudié l'interaction entre la protéine et des mini-ARNt mimant la tige acceptrice et le bras TΨC d'un ARNt. Ce travail a permis de cartographier la surface de la PTH où l'ARN s'ancre à la protéine. Il a confirmé l'importance de deux résidus basiques, la lysine K105 et l'arginine R133, pour la reconnaissance du phosphate en 5' de l'ARNt. Il a également révélé une interaction entre l'hélice C-terminale de la protéine et le bras TΨC de l'ARNt, à 30 Å du site actif. La pertinence fonctionnelle de ce dernier contact a pu être établie par mutagenèse dirigée. L'ensemble de ces résultats permet de proposer un modèle complet de l'interaction entre la PTH et un peptidyl-ARNt.