O Papel da 1,25(OH)2D3 (VD3) ou calcitriol, o metabolito ativo da Vitamina D, em câncer de mama tem sido extremamente explorado. Os efeitos antiproliferativos, prodiferenciativos e antiinflamatórios da VD3 são bem documentados na literatura. Análises de microarray vêm auxiliando a identificação de vários genes responsivos e modulados pela VD3 e seus análogos. A maioria desses genes apresentados na literatura é proveniente de estudos utilizando linhagens celulares de câncer de mama ou modelos animais. Pouco é sabido sobre a ação da VD3 em outros tipos celulares constituintes do microambiente tumoral. Fibroblasto associado ao câncer (FAC), o principal componente do microambiente tumoral, apresenta um papel central no complexo processo de interação entre tumor e estroma e consequentemente em todos os passos envolvidos na tumorigênese. O objetivo do nosso estudo foi identificar genes chaves regulados pela VD3 em fibroblastos associados ao câncer de mama. Para isso, culturas primárias de fibroblastos provenientes de cinco amostras de carcinoma mamário ductal invasivo foram estabelecidas e posteriormente caracterizadas fenotipicamente por um conjunto de marcadores. Após a confirmação da presença de receptor de vitamina D, os fibroblastos de cada amostra foram divididos em três grupos: um grupo controle e grupos de tratamento com 0,5 nM e 100 nM de VD3 durante 24 horas. A determinação do perfil de expressão gênica foi realizado utilizando tecnologia de oligo microarray com o GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 (Affymetrix). Foram obtidos 274 genes diferentemente expressos entre os grupos controle e tratamento com 0,5 nM de VD3, muitos deles envolvidos em processos como apoptose e migração celular. Os 161 genes diferentemente expressos obtidos a partir da comparação entre grupos controle e tratamento com 100 nM de VD3 apresentaram-se funcionalmente envolvidos em diversos processos biológicos, sendo que os mais significativos processos regulados pela VD3 em fibroblastos associados ao câncer de mama foram respostas inflamatória e imune, sugerindo que a ação antiinflamatória da VD3, anteriormente relatada em estudos utilizando células epiteliais de câncer de mama, pode também ser aplicada a fibroblastos associados ao câncer de mama / The role of 1,25(OH)2D3 (calcitriol), the active metabolite of Vitamin D, in breast cancer has been extremely explored. Antiproliferative, prodifferentiating and anti-inflammatory effects of calcitriol have been reported in breast cancer. Expression profile by microarray analysis has identified many responsive genes modulated by calcitriol and analogs. The majority of them defined to date are based on studies using breast cancer cell lines or mouse models. Little is known about the action of calcitriol in the others cell types present into the tumor microenvironment. Cancerassociated fibroblasts (CAFs), the principal cell component of the tumor microenvironment, play a central role in the complex process of tumour stroma interaction and consequently in all breast cancer tumorigenesis steps. The aim of our study was to identify key genes that are regulated by calcitriol in breast cancer associated fibroblasts. Primary fibroblasts cell cultures from five breast cancer samples were established and then phenotyping characterized by a set of markers. The occurrence of vitamin D receptor was confirmed in all samples and fibroblasts were divided in three groups: one control group and two treatment groups, 0.5 nM and 100 nM of calcitriol during 24 hours. The determination of gene expression profile was performed by oligo microarray technology using the GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 (Affymetrix). Control and 0.5 nM calcitriol analysis resulted in 274 differentially expressed genes, many of then involved in biological processes as apoptosis and cell migration. The 161 differentially expressed genes obtained from comparison between groups control and 100 nM calcitriol treatment were functionally involved in several biological processes. The most significantive processes regulated by VD3 in breast CAFs were the inflammatory and immune responses, suggesting that the anti-inflammatory action of calcitriol, yet reported in several studies using epithelial breast cancer cells, may also been applied to breast cancer associated fibroblasts

As interações epitélio-mesênquima podem influenciar o desenvolvimento do tumor no sítio primário e no linfonodo comprometido de pacientes com câncer de mama. Nosso objetivo foi avaliar a taxa de proliferação e perfil gênico de fibroblastos de linfonodos comprometidos e não comprometidos obtidos de pacientes com câncer de mama e determinar a influência de células epiteliais mamárias normais (MCF10A) ou malignas (MDA-MB-231) na expressão gênica destes fibroblastos. Foram estabelecidas culturas primárias de fibroblastos de linfonodos (3 comprometidos e 3 não comprometidos) de 6 diferentes pacientes com câncer de mama e não houve diferença na taxa de proliferação destes fibroblastos. Co-culturas de células MCF10A ou MDA-MB-231 com fibroblastos, separadas fisicamente por membranas porosas, foram realizadas por 72 horas. O RNA total dos fibroblastos foi extraído, amplificado e o perfil gênico foi analisado usando-se uma lâmina de cDNA microarray. Fibroblastos de linfonodos comprometidos e não comprometidos apresentaram perfil gênico similar, pois apenas 13 genes foram modulados, sendo que maior expressão de PGBD3 e PTBP2 em fibroblastos de linfonodos comprometidos foi confirmada em ensaios de RT-PCR em tempo real. Em fibroblastos, a cocultura com células MCF10A alterou a expressão de maior número de genes que a co-cultura com células MDA-MB-231. Em fibroblastos originários de linfonodos não comprometidos mantidos em co-cultura com células MDA-MB-231 foram modulados 151 genes, em relação aos mesmos fibroblastos cultivados na ausência de células epiteliais, sendo que oito deles apresentaram variação de expressão superior a três vezes (BET1, ENTPD1, USP7, DAPK1, ERBB2 e NCF2). As células MDA-MB-231 modularam algumas vias de sinalização em fibroblastos não comprometidos, como vias do cálcio, insulina, hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH) e da regulação do citoesqueleto de actina, mas o mesmo não ocorreu em fibroblastos de linfonodos comprometidos. Duzentos e quarenta e nove genes foram diferencialmente expressos em fibroblastos originários de linfonodos comprometidos mantidos em co-cultura com células MDA-MB-231 e quatro genes apresentaram variação superior a três vezes (ACLY, AXUD1, CLCN5 e PDE6D). Nestes fibroblastos, algumas funções biológicas foram reguladas apenas por influência da célula MDA-MB-231, entre as quais metabolismo de aminoácidos, excreção, transporte intra Golgi e regulação da forma celular. As vias de sinalização e funções biológicas reguladas em fibroblastos pela interação com células epiteliais malignas podem estar implicadas no desenvolvimento de metástases regionais no câncer de mama. / Tumor development may be influenced by epithelial-mesenchimal interactions in the primary site as well as in the involved lymph node from breast cancer patients. Our aim was to evaluate the proliferation rate and gene profile of fibroblasts obtained from involved and uninvolved lymph nodes from breast câncer patients and to determine the influence of normal (MCF10A) or malignant (MDA-MB-231) mammary epithelial cells on the gene expression of these fibroblasts. Primary culture from fibroblasts obtained from 3 involved and 3 uninvolved lymph nodes (ILF and NILF) from 6 different breast cancer patients was established and no difference in their proliferation rate was detected. These fibroblasts were co-cultured with MCF10A or MDA-MB-231 cells, physically separated by a porous membrane for 72 hours. Total RNA was extracted from the cells, amplified and the gene profile from fibroblasts cultured alone or with epithelial cells was analyzed by cDNA microarray slides. Fibroblasts from involved and uninvolved lymph nodes present a similar gene profile as only 13 genes were differentially expressed between them, including PGBD3 and PTBP2, which higher expression in fibroblasts from involved lymph nodes was confirmed by real time RT-PCR. In fibroblasts, more genes seem to be regulated upon co-cultured with MCF10A than with MDA-MB-231 cells. In fibroblasts from uninvolved lymph nodes co-cultured with MDA-MB-231 cells, 151 genes were modulated as compared with fibroblasts cultured alone, and eight of them, presented an expression variation superior to three times (BET1, ENTPD1, USP7, DAPK1, ERBB2 e NCF2). In these fibroblasts, MDA-MB-231 could modulate some signaling pathways as calcium, insulin, gonadotrophin releasing hormone (GnRH) and actin cytoskeleton regulation signaling pathways. Two hundred forty nine genes were differentially expressed by fibroblasts from involved lymph nodes co-cultured with MDA-MB-231 cells, four of which with an expression variation superior to three times (ACLY, AXUD1, CLCN5 e PDE6D). In the last condition, fibroblasts had some biological functions regulated upon MDA-MB-231 cells influence, among which amino acid metabolism, excretion, intra-Golgi transport and regulation of cell shape. Signaling pathways and biological functions regulated in fibroblasts after interaction with malignant epithelial cells might be implicated in the development of regional metastasis in breast cancer.

O desenvolvimento da metástase depende, entre outros fatores de um microambiente propício e é possível que as células do câncer de mama influenciem o perfil da expressão gênica das células estromais, tanto no tumor primário como no linfonodo regional. Para estudar este último evento obtivemos fibroblastos de linfonodos comprometidos (n=3) ou não (n=3) de pacientes com câncer de mama, os quais foram co-cultivados com células de câncer de mama MDA-MB-231, separados fisicamente por membranas porosas por 72 horas. O perfil da expressão gênica foi determinado utilizando-se uma plataforma de cDNA microarray. A presença de células MDA-MB231 modulou a expressão de 415 genes em fibroblastos de linfonodos não comprometidos e 779 genes em fibroblastos de linfonodos comprometidos, em relação a células mantidas em mono-cultura, sendo que 120 genes tiveram sua expressão reguladas em ambas comparações. A expressão destes genes determinou a separação dos fibroblastos mantidos em co-cultura daqueles mantidos isoladamente em cultura por análise de agrupamento hierárquico, indicando que a presença das células de câncer de mama influencia o perfil da expressão gênica das células. Entre as funções reguladas pela presença de células MDA-MB231 encontramse tradução e receptor de superfície ligado à transmissão de sinal, em fibroblastos de linfonodos não comprometidos e autofosforilação de proteína e ciclo celular, em fibroblastos de linfonodos comprometidos. Para determinar se a expressão gênica diferencial é um fenômeno que pode ser generalizado para o câncer de mama, realizamos ensaios utilizando outras amostras de fibroblastos obtidos de linfonodos comprometidos de 5 pacientes e de linfonodos não comprometidos de outras 5 pacientes (incluindo as 6 amostras de fibroblastos previamente analisadas), as quais foram co-cultivadas com três linhagens celulares de câncer de mama (MDA-MB231, MDA-MB435 e MCF-7). A expressão relativa de MAP2K3, AKAP8L e CREG1, inicialmente identificados como diferencialmente expressos em análise de cDNA microarray, foi então determinada por RT-PCR em tempo real. Observamos que nenhuma das três linhagens celulares influenciou a expressão de AKAP8L e CREG1 tanto em fibroblastos de linfonodos comprometidos quanto não comprometidos. MAP2K3 foi hiperexpresso tanto em fibroblastos de linfonodos comprometidos quanto em não comprometidos co-cultivados com células MDA-MB231, mas não com células MDA-MB435 ou MCF-7. Nossos resultados indicam que a presença de células MDA-MB231 influencia o perfil de expressão gênica de fibroblastos originário tanto de linfonodos comprometidos quanto de não comprometidos. Alguns genes comumente regulados em fibroblastos de linfonodo comprometido ou não comprometidos, incluindo MAP2K3, podem estar envolvidos no estabelecimento de metástase regional. / Metastasis development may depend on a favorable microenvironment and breast cancer cells may influence stromal cells gene expression profile not only in the primary site but also in the lymph nodes. To study the latter event, fibroblasts were obtained from involved or uninvolved lymph nodes from six breast cancer patients and co-cultivated with breast cancer MDA-MB-231 cells, physically separated by porous membranes, for 72 hours. The gene expression profile was determined utilizing a cDNA microarray platform. The presence of MDA-MB231 cells modulated the expression of 415 genes in fibroblasts from uninvolved nodes and 779 genes in fibroblasts from involved nodes, as compared to fibroblasts cultured isolated, including 120 genes, which were regulated in fibroblasts from both origins. Unsupervised hierarchical clustering allowed a correct segregation of fibroblasts co-cultured with MDA-MB231 cells from fibroblasts cultured alone, indicating that the gene expression profile gene is influenced by the presence of breast cancer cells. Functions, which were regulated by presence of MDA-MB231 cells included translation and cell surface receptor linked signal transduction in fibroblasts from uninvolved nodes and protein autophosphorylation and cell cycle in fibroblasts from involved nodes. To determine whether this differential gene expression was a general process influenced by breast cancer cells, further assays were performed utilizing samples of fibroblasts from involved (n=5) and uninvolved nodes (n=5) from breast cancer patients (including the 6 samples of fibroblasts previously analyzed), which were co-cultured with three breast cancer cell lines (MDAMB231, MDA-MB435 and MCF-7). Relative expression of MAP2K3, AKAP8L and CREG1, initially identified as differentially expressed in co-cultured fibroblasts upon cDNA microarray analysis, was determined by RT-PCR real time. AKAP8L and CREG1 expression in fibroblasts from involved or uninvolved nodes was not influenced by the presence of any of the three cell lines. MAP2K3 was over-expressed in fibroblasts from both involved and uninvolved nodes when co-cultured with MDA-MB231 cells, but not with MDA-MB435 or MCF-7 cells. Our results indicate that the gene expression profile of fibroblasts from involved and uninvolved lymph nodes are influenced by the presence of MDA-MB231. Some genes commonly regulated in fibroblasts from both involved and uninvolved nodes, as MAP2K3, may be involved in regional metastasis establishment.

O desenvolvimento da metástase depende, entre outros fatores de um microambiente propício e é possível que as células do câncer de mama influenciem o perfil da expressão gênica das células estromais, tanto no tumor primário como no linfonodo regional. Para estudar este último evento obtivemos fibroblastos de linfonodos comprometidos (n=3) ou não (n=3) de pacientes com câncer de mama, os quais foram co-cultivados com células de câncer de mama MDA-MB-231, separados fisicamente por membranas porosas por 72 horas. O perfil da expressão gênica foi determinado utilizando-se uma plataforma de cDNA microarray. A presença de células MDA-MB231 modulou a expressão de 415 genes em fibroblastos de linfonodos não comprometidos e 779 genes em fibroblastos de linfonodos comprometidos, em relação a células mantidas em mono-cultura, sendo que 120 genes tiveram sua expressão reguladas em ambas comparações. A expressão destes genes determinou a separação dos fibroblastos mantidos em co-cultura daqueles mantidos isoladamente em cultura por análise de agrupamento hierárquico, indicando que a presença das células de câncer de mama influencia o perfil da expressão gênica das células. Entre as funções reguladas pela presença de células MDA-MB231 encontramse tradução e receptor de superfície ligado à transmissão de sinal, em fibroblastos de linfonodos não comprometidos e autofosforilação de proteína e ciclo celular, em fibroblastos de linfonodos comprometidos. Para determinar se a expressão gênica diferencial é um fenômeno que pode ser generalizado para o câncer de mama, realizamos ensaios utilizando outras amostras de fibroblastos obtidos de linfonodos comprometidos de 5 pacientes e de linfonodos não comprometidos de outras 5 pacientes (incluindo as 6 amostras de fibroblastos previamente analisadas), as quais foram co-cultivadas com três linhagens celulares de câncer de mama (MDA-MB231, MDA-MB435 e MCF-7). A expressão relativa de MAP2K3, AKAP8L e CREG1, inicialmente identificados como diferencialmente expressos em análise de cDNA microarray, foi então determinada por RT-PCR em tempo real. Observamos que nenhuma das três linhagens celulares influenciou a expressão de AKAP8L e CREG1 tanto em fibroblastos de linfonodos comprometidos quanto não comprometidos. MAP2K3 foi hiperexpresso tanto em fibroblastos de linfonodos comprometidos quanto em não comprometidos co-cultivados com células MDA-MB231, mas não com células MDA-MB435 ou MCF-7. Nossos resultados indicam que a presença de células MDA-MB231 influencia o perfil de expressão gênica de fibroblastos originário tanto de linfonodos comprometidos quanto de não comprometidos. Alguns genes comumente regulados em fibroblastos de linfonodo comprometido ou não comprometidos, incluindo MAP2K3, podem estar envolvidos no estabelecimento de metástase regional. / Metastasis development may depend on a favorable microenvironment and breast cancer cells may influence stromal cells gene expression profile not only in the primary site but also in the lymph nodes. To study the latter event, fibroblasts were obtained from involved or uninvolved lymph nodes from six breast cancer patients and co-cultivated with breast cancer MDA-MB-231 cells, physically separated by porous membranes, for 72 hours. The gene expression profile was determined utilizing a cDNA microarray platform. The presence of MDA-MB231 cells modulated the expression of 415 genes in fibroblasts from uninvolved nodes and 779 genes in fibroblasts from involved nodes, as compared to fibroblasts cultured isolated, including 120 genes, which were regulated in fibroblasts from both origins. Unsupervised hierarchical clustering allowed a correct segregation of fibroblasts co-cultured with MDA-MB231 cells from fibroblasts cultured alone, indicating that the gene expression profile gene is influenced by the presence of breast cancer cells. Functions, which were regulated by presence of MDA-MB231 cells included translation and cell surface receptor linked signal transduction in fibroblasts from uninvolved nodes and protein autophosphorylation and cell cycle in fibroblasts from involved nodes. To determine whether this differential gene expression was a general process influenced by breast cancer cells, further assays were performed utilizing samples of fibroblasts from involved (n=5) and uninvolved nodes (n=5) from breast cancer patients (including the 6 samples of fibroblasts previously analyzed), which were co-cultured with three breast cancer cell lines (MDAMB231, MDA-MB435 and MCF-7). Relative expression of MAP2K3, AKAP8L and CREG1, initially identified as differentially expressed in co-cultured fibroblasts upon cDNA microarray analysis, was determined by RT-PCR real time. AKAP8L and CREG1 expression in fibroblasts from involved or uninvolved nodes was not influenced by the presence of any of the three cell lines. MAP2K3 was over-expressed in fibroblasts from both involved and uninvolved nodes when co-cultured with MDA-MB231 cells, but not with MDA-MB435 or MCF-7 cells. Our results indicate that the gene expression profile of fibroblasts from involved and uninvolved lymph nodes are influenced by the presence of MDA-MB231. Some genes commonly regulated in fibroblasts from both involved and uninvolved nodes, as MAP2K3, may be involved in regional metastasis establishment.

As interações epitélio-mesênquima podem influenciar o desenvolvimento do tumor no sítio primário e no linfonodo comprometido de pacientes com câncer de mama. Nosso objetivo foi avaliar a taxa de proliferação e perfil gênico de fibroblastos de linfonodos comprometidos e não comprometidos obtidos de pacientes com câncer de mama e determinar a influência de células epiteliais mamárias normais (MCF10A) ou malignas (MDA-MB-231) na expressão gênica destes fibroblastos. Foram estabelecidas culturas primárias de fibroblastos de linfonodos (3 comprometidos e 3 não comprometidos) de 6 diferentes pacientes com câncer de mama e não houve diferença na taxa de proliferação destes fibroblastos. Co-culturas de células MCF10A ou MDA-MB-231 com fibroblastos, separadas fisicamente por membranas porosas, foram realizadas por 72 horas. O RNA total dos fibroblastos foi extraído, amplificado e o perfil gênico foi analisado usando-se uma lâmina de cDNA microarray. Fibroblastos de linfonodos comprometidos e não comprometidos apresentaram perfil gênico similar, pois apenas 13 genes foram modulados, sendo que maior expressão de PGBD3 e PTBP2 em fibroblastos de linfonodos comprometidos foi confirmada em ensaios de RT-PCR em tempo real. Em fibroblastos, a cocultura com células MCF10A alterou a expressão de maior número de genes que a co-cultura com células MDA-MB-231. Em fibroblastos originários de linfonodos não comprometidos mantidos em co-cultura com células MDA-MB-231 foram modulados 151 genes, em relação aos mesmos fibroblastos cultivados na ausência de células epiteliais, sendo que oito deles apresentaram variação de expressão superior a três vezes (BET1, ENTPD1, USP7, DAPK1, ERBB2 e NCF2). As células MDA-MB-231 modularam algumas vias de sinalização em fibroblastos não comprometidos, como vias do cálcio, insulina, hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH) e da regulação do citoesqueleto de actina, mas o mesmo não ocorreu em fibroblastos de linfonodos comprometidos. Duzentos e quarenta e nove genes foram diferencialmente expressos em fibroblastos originários de linfonodos comprometidos mantidos em co-cultura com células MDA-MB-231 e quatro genes apresentaram variação superior a três vezes (ACLY, AXUD1, CLCN5 e PDE6D). Nestes fibroblastos, algumas funções biológicas foram reguladas apenas por influência da célula MDA-MB-231, entre as quais metabolismo de aminoácidos, excreção, transporte intra Golgi e regulação da forma celular. As vias de sinalização e funções biológicas reguladas em fibroblastos pela interação com células epiteliais malignas podem estar implicadas no desenvolvimento de metástases regionais no câncer de mama. / Tumor development may be influenced by epithelial-mesenchimal interactions in the primary site as well as in the involved lymph node from breast cancer patients. Our aim was to evaluate the proliferation rate and gene profile of fibroblasts obtained from involved and uninvolved lymph nodes from breast câncer patients and to determine the influence of normal (MCF10A) or malignant (MDA-MB-231) mammary epithelial cells on the gene expression of these fibroblasts. Primary culture from fibroblasts obtained from 3 involved and 3 uninvolved lymph nodes (ILF and NILF) from 6 different breast cancer patients was established and no difference in their proliferation rate was detected. These fibroblasts were co-cultured with MCF10A or MDA-MB-231 cells, physically separated by a porous membrane for 72 hours. Total RNA was extracted from the cells, amplified and the gene profile from fibroblasts cultured alone or with epithelial cells was analyzed by cDNA microarray slides. Fibroblasts from involved and uninvolved lymph nodes present a similar gene profile as only 13 genes were differentially expressed between them, including PGBD3 and PTBP2, which higher expression in fibroblasts from involved lymph nodes was confirmed by real time RT-PCR. In fibroblasts, more genes seem to be regulated upon co-cultured with MCF10A than with MDA-MB-231 cells. In fibroblasts from uninvolved lymph nodes co-cultured with MDA-MB-231 cells, 151 genes were modulated as compared with fibroblasts cultured alone, and eight of them, presented an expression variation superior to three times (BET1, ENTPD1, USP7, DAPK1, ERBB2 e NCF2). In these fibroblasts, MDA-MB-231 could modulate some signaling pathways as calcium, insulin, gonadotrophin releasing hormone (GnRH) and actin cytoskeleton regulation signaling pathways. Two hundred forty nine genes were differentially expressed by fibroblasts from involved lymph nodes co-cultured with MDA-MB-231 cells, four of which with an expression variation superior to three times (ACLY, AXUD1, CLCN5 e PDE6D). In the last condition, fibroblasts had some biological functions regulated upon MDA-MB-231 cells influence, among which amino acid metabolism, excretion, intra-Golgi transport and regulation of cell shape. Signaling pathways and biological functions regulated in fibroblasts after interaction with malignant epithelial cells might be implicated in the development of regional metastasis in breast cancer.