Les Rotavirus appartiennent à la famille des Reoviridae, famille du groupe III des virus à ARN double brin. Identifiés en 1973 par Ruth Bishop, ces virus non enveloppés sont la première cause de diarrhée aiguë sévère du jeune enfant dans le monde. La capside virale icosaédrique est constituée de 3 couches protéiques de structure : la couche externe formée par la glycoprotéine VP7 d’où émergent les spicules de protéine VP4, la couche intermédiaire constituée par la protéine VP6 représentant près de 50 % du poids du virus et enfin, la couche interne appelée core, résultant de l’assemblage des protéines VP2, d’où émergent vers l’intérieur les protéines VP1 et VP3. Cette capside renferme un génome divisé en 11 segments d’ARN bicaténaires. A ces 6 protéines structurales s’ajoutent les protéines non structurales qui interviennent lors de la réplication du virus. Les deux protéines structurales, VP4 et VP7 sont essentielles pour la fixation de la particule triple couche (TLP) aux membranes des cellules hôtes, par interaction aux récepteurs intégrines, elle sont également impliqués dans la déstabilisation des membranes endosomales, indispensable à la libération de la particule double couche (DLP) infectieuse dans le cytoplasme. Actuellement, contrairement au mécanisme d’action de la protéine VP5*, celui de la glycoprotéine VP7 est inconnu. L’objectif de cette thèse, a été de comprendre le mécanisme moléculaire de déstabilisation des membranes par les peptides dérivés de VP7. Dans un premier temps nous avons montré, par des études in silico, l’existence d’un domaine prédit en hélice membranaire bordé de résidus arginine et lysine hautement conservés, situé à l’extrémité C-terminale de la glycoprotéine VP7. Ces résultats ont conduit à la synthèse de quatre peptides avec lesquels des tests de perméabilisation de membranes modèles de larges vésicules unilamellaires (LUVs) ont été menés. Ceux-ci ont permis d’identifier le domaine minimum le plus actif, VP723, parmi les peptides sélectionnés. Dans un second temps nous avons déterminé la structure de ces peptides par RMN, dans des conditions mimant l’environnement hydrophobe de la membrane. Le peptide minimal VP723 s’organise en hélice α-amphipathique, structure souvent impliquée dans la déstabilisation des membranes cellulaires. La comparaison de sa structure obtenue par RMN à celle du domaine correspondant dans la structure cristallographique de la protéine native montre le réarrangement conformationnel de ce segment après maturation par la trypsine. Ces résultats ont été confirmés par deux mutants de synthèse, dont l’un est inactif pour la perméabilisation des membranes modèles. Ces travaux ont été complétés par des expériences de Résonance Plasmonique aux Ondes guidée (PWR). Des études par RMN du solide sont en cours afin de déterminer l’orientation du peptide dans les membranes modèles. En conclusion, nos résultats mettent en évidence l’importance du domaine C-terminal VP723 de la protéine VP7 dans la déstabilisation des membranes, permettant d’assurer la translocation de la particule virale infectieuse (DLP) de l’endosome vers le cytoplasme. Un modèle du mécanisme d’entrée du virus, médié par les peptides dérivés de la maturation par la trypsine de la glycoprotéine VP7 est proposé. / Rotaviruses belong to the Reoviridae family, belonging to the group III of dsRNA viruses. Identified in 1973 by Ruth Bishop, these non-enveloped viruses are the leading cause of severe diarrhea in young children worldwide. The icosahedral capsid is composed of three structural protein layers: the outer one, formed by the glycoprotein VP7, emerges spicules protein VP4, the intermediate one consists of VP6 protein representing nearly 50% of the weight of the virus and finally, the inner one called core, results from the assembly of proteins VP2, emerges towards the inside of proteins VP1 and VP3. The capsid contains a genome divided into 11 segments of dsRNA. To these six structural proteins are added nonstructural proteins involved in virus replication. The two structural proteins, VP4 and VP7, are involved in the interaction of the triple layer particle (TLP) to integrin receptors, necessary for the release of the infectious double layer particle (DLP) into the cytoplasm following the permeabilization of the membrane of the endosome compartments. Currently, unlike the mechanism of action of the protein VP5*, the glycoprotein VP7 remains unknown. The objective of this work was to understand the molecular mechanism involved in the destabilization of membranes by peptides derived from VP7. In a first step, we have shown, by in silico studies, the existence of a helical trans-membrane domain predicted containing a highly conserved arginine and lysine residues, located at the C-terminus of the VP7 glycoprotein. These results led to the synthesis of four peptides with which permeabilizing tests of model membranes were conducted. We have identified the minimum of the most active domain, named VP723, among the selected peptides. In a second step, we determined the structure of these peptides by NMR under conditions mimicking the hydrophobic environment of the membrane. The VP723 peptide is organized like an α-helical amphipathic structure often involved in the destabilization of cell membranes. The comparison of the structure obtained by NMR to that of the corresponding domain in the crystallographic structure of the native protein shows a conformational rearrangement of the segment after trypsin maturation. These results were confirmed by two synthetic mutants, one of which is inactive for the permeabilization of model membranes. These studies were complemented by experiments Plasmon Resonance guided the Waves (PWR). Studies by solid state NMR are in progress to determine the orientation of the peptide in model of membranes. In conclusion, our results highlight the importance of the C-terminal domain of the VP7 protein, named VP723, in the destabilization of membranes, to ensure the translocation of the infectious viral particle (DLP) from the endosome into the cytoplasm compartments. A mechanism of virus entry mediated by peptides derived from trypsin maturation of the VP7 glycoprotein is proposed in this study.

La perméabilisation de la membrane mitochondriale externe (MOMP) est un évènement décisif lors de la balance entre la vie et la mort de la cellule. Les évènements biochimiques responsables de la MOMP ne sont pas encore complètement définis. Deux mécanismes majeurs et distincts ont été impliqués dans le contrôle de la MOMP: i) l'action des protéines de la famille de Bcl-2, qui peuvent directement s'insérer dans la membrane mitochondriale externe (OMM) et induire l'ouverture de pores; et ii) le pore de transition de perméabilité (PTP), un canal non sélectif de la membrane mitochondriale interne, qui induit un gonflement des mitochondries à la suite d'une ouverture prolongée, suivie d'une éventuelle rupture de la MOM. L'intérêt croissant pour la biologie de la mort cellulaire, entretenu par des contributions significatives d'études sur la levure dans la compréhension des mécanismes biologiques de base, ont amené l'eucaryote unicellulaire Saccharomyces cerevisiae sur le devant de la scène. La levure est dépourvue de certains régulateurs majeurs de l'apoptose, mais possède cependant des homologues des facteurs pro-apoptotiques mitochondriaux, ainsi que des orthologues des composantes moléculaires généralement attribuées au PTP, notamment le l'échangeur ADP/ATP (AAC) et la Porine (Por1). Ces caractéristiques de S. cerevisiae, ainsi que la disponibilité d'outils moléculaires et génétiques, ont fourni une excellente opportunité d'étudier les membres de la famille de Bcl-2 dans un environnement contrôlé, ainsi que la contribution du PTP et de ses composantes à la mort cellulaire. Dans ce travail, la contribution des groupes thiol de l'AAC, leur oxydation, Por1, et la possible interaction entre ces deux protéines, ont été explorées au cours de la mort cellulaire de la levure induite par l'acide acétique. Nous avons observé que l'oxydation de Aac2p, notamment la formation de ponts disulfures, ne contribuait pas au programme de mort induit par l'acide acétique. Cette conclusion est soutenue par l'absence d'un profil particulier d'oxydation d'Aac2p. Néanmoins, il avait été précédemment démontré que l'AAC était requis pour la relocalisation du cytochrome c induite par l'acide acétique, et que son absence promouvait la survie des cellules de levure. Par contre, la délétion de Por1 diminue la viabilité de levures traitées par l'acide acétique. Il a été émis l'hypothèse que les deux protéines participent à la même voie de régulation de la mort cellulaire. Pour la tester, la relocalisation du cytochrome c a été mesurée dans des mitochondries isolées de cellules Δaac1/2/3, Δpor1 et Δaac1/2/3Δpor1 suite à l'exposition à l'acide acétique. Les données obtenues suggèrent que l'absence de Por1 n'affecte pas la relocalisation du cytochrome c pendant la mort cellulaire induite par l'acide acétique, mais pourrait être importante pour sa régulation. Quand à la fois AAC et Por1 sont absentes, les mitochondries de levure peuvent toujours relarguer le cytochrome c, suggérant l'existence d'un mécanisme indépendant de l'AAC. De plus, nous avons montré que les deux protéines ont des effets distincts dans les réponses cellulaires à différents stress. En effet, l'absence des AACs contribue à l'augmentation de la résistance au stress osmotique et de l'intégrité de la paroi cellulaire. Enfin, S.cerevisiae a été utilisé comme modèle pour étudier les aspects mécanistiques relatifs à la fonction des protéines de la famille de Bcl-2. Notamment, nous avons évalué le rôle des sphingolipides sur l'action du régulateur pro-apoptotique humain Bax. Nous avons montré que l'absence de Isc1p, une inositol phospholipase C qui dégrade les sphingolipides complexes en céramides chez la levure, favorise la viabilité de cellules de levures exprimant une forme active de Bax. Nous avons ensuite révélé que cet effet n'est pas associé à des modifications de l'activité de Bax. Il semblerait plutôt que cet effet soit lié aux conséquences cellulaires de l'action de Bax. / A decisive event in the cell’s life-or-death decision is the mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP). The biochemical events responsible for MOMP, are not entirely defined. Two major and distinct mechanisms have been implicated in the control of MOMP: i) the action of Bcl-2 family proteins, which can directly engage the outer mitochondria membrane (OMM) and induce the opening of pores; and ii) the mitochondrial permeability transition pore (PTP), an inner membrane unselective channel that induces mitochondria swelling upon long term openings, and eventual rupture of the OMM. The growing interest in cell death biology, fostered by the relevant contributions of yeast to the understanding of basic biological processes, brought the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae into the scene. Yeast cells lack some of the major regulators of apoptosis but still possess homologues of mitochondrially enclosed pro-apoptotic factors, as well as orthologues of the molecular components generally ascribed to PTP, including the ADP/ATP carrier (AAC) and Porin (Por1). These particular features of S. cerevisiae, along with the availability of genetic and molecular tools, provided an excellent opportunity to study Bcl-2 family members in a “controlled” environment, or the contribution of the PTP and its components to cell death. In this work, the particular contribution of AAC’s thiol goups, its oxidation, Por1, and of a possible interaction between both proteins to acetic acid-induced yeast cell death, was explored. We observed that oxidative modifications of Aac2p, namely the crosslinking of thiols, do not contribute to the acetic acid-induced cell death program. Such idea is supported by the apparent absence of a particular Aac2p oxidation pattern. Nevertheless, the AAC was previously found to be required for acetic acid-induced cytochrome c release, and its absence promoted the survival of yeast cells. Deletion of Por1, on the other hand, decreased the viability of yeast cells treated with acetic acid. It was hypothesized that the two proteins could share the same pathway in the regulation of cell death. To test it, cytochrome c release was evaluated in mitochondria isolated from Δaac1/2/3, Δpor1 and Δaac1/2/3Δpor1 cells following acetic acid exposure. The data obtained suggest that absence of Por1 does not affect cytochrome c releaseduring acetic acid induced-death, but it may be important for its regulation. When both the AAC and Por1 were absent, yeast mitochondria could still release cytochrome c, raising the possibility of an AAC-independent mechanism. Furthermore, we found both proteins have distinct effects that regulate the cellular response to different stresses. Indeed, absence of the AACs somehow contributed to increased osmotic stress and cell wall resistance. Finally, S. cerevisiae was used as a model to study mechanistic aspects relative to the function of Bcl-2 family proteins. Namely, we assessed the role of sphingolipids in the action of the human pro-apoptotic regulator Bax. We found that absence of Isc1p, an inositol phospholipase C that degrades complex sphingolipids into ceramides in yeast, favored the viability of yeast cells expressing an active form of Bax. It was further revealed that this effect is not associated with changes to the action of Bax; rather, it might be related with the cellular consequences of Bax-action. A parallel with the effect of Uth1p absence in yeast cells expressing Bax suggests that the absence of Isc1p could affect the selective degradation of mitochondria by mitophagy, and thus produce a different cell death response. This work provides new insights into the physiological events underlying the contribution of mitochondrial proteins, previously associated with cell death responses, and sphingolipid metabolism to cell death induced by acetic acid and Bax, respectively. Once again, the yeast S. cerevisiae proved to be an excellent model for the research of cell life and death.