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Vectorisation d'acides nucléiques dans le muscle squelettique à des fins thérapeutiques / Nucleic acid vectorization in skeletal muscle for therapeutic purposesAlimi-Guez, Debborah 23 September 2009 (has links)
Il existe deux catégories de techniques de vectorisation d’ADN, les vecteurs viraux et non viraux. Parmi les stratégies non virales, on peut distinguer celles basées sur des techniques physiques, celles utilisant des molécules non chargées, et celles qui sont les plus utilisées, à savoir les approches utilisant des composés cationiques. Les copolymères amphiphiles non chargés, constitués de motifs oxyde de polyéthylène (POE) et oxyde de polypropylène (PPO), sont capables d’améliorer l’efficacité de transfection dans le muscle. Afin de mieux comprendre quelles propriétés sont requises pour avoir un transfert de gènes efficace, nous avons décidé de faire une étude structure-activité. Nous avons montré que tous les poloxamères testés augmentent l'expression au niveau musculaire de manière significative comparé à l’injection d’ADN nu. Ceci montre qu’il n’existe pas un composé unique pour améliorer le transfert de gène dans le muscle mais qu’il existe une grande flexibilité en termes de poids moléculaire et de rapport hydrophile/hydrophobe. En parallèle, des études ont été menées in vitro afin d’évaluer la cytotoxicité de ces produits et de mieux comprendre le mécanisme d’action de ces molécules. Nos résultats indiquent que ces polymères sont peu toxiques et que l’amélioration du transfert de gènes ne se fait pas en perméabilisant la membrane des cellules musculaires. Enfin, l’étude de l’acide déoxycholique, un acide biliaire, a donné des résultats très encourageants en transfert de gènes dans le muscle puisqu’une efficacité égale, voire supérieure, à celle des poloxamères a été obtenue. Toutefois, ces résultats restent à démontrer plus clairement. / There are two types of vectorization techniques of DNA, viral vectors and nonviral. Among non-viral strategies, we can distinguish those based on physical techniques, those using uncharged molecules, and those that are most used, namely approaches using cationic compounds. The uncharged amphiphilic copolymers, composed of units of polyethylene oxide (POE) and polypropylene oxide (PPO), can improve the efficiency of transfection in muscle. To better understand what properties are required to have an efficient gene transfer, we decided to study structure-activity. We showed that all tested poloxamers increase expression in muscle significantly compared to injection of naked DNA. This shows that there is not a single compound to improve gene transfer into muscle but there is great flexibility in terms of molecular weight and ratio of hydrophilic / hydrophobic. In parallel, studies were conducted in vitro to evaluate the cytotoxicity of these products and to better understand the mechanism of action of these molecules. Our results indicate that these polymers are not toxic and that the improvement of gene transfer is not in permeabilizing the membrane of muscle cells. Finally, the study deoxycholic acid, a bile acid, has yielded very encouraging results in gene transfer into muscle since equally effective or even superior to that of poloxamers has been obtained. However, these results remain to be demonstrated more clearly.
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Caractérisation de l'activité biologique de l'entérotoxine STb d'Escherichia coli à l'aide de membranes lipidiques artificielles et de cellules en cultureGonçalves, Carina January 2007 (has links)
Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.
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Caractérisation de l'activité biologique de l'entérotoxine STb d'Escherichia coli à l'aide de membranes lipidiques artificielles et de cellules en cultureGonçalves, Carina January 2007 (has links)
Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal
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Perméabilisation photocontrôlée de la membrane biologique : étude en systèmes modèles et en cellulesMilioni, Dimitra 26 November 2012 (has links) (PDF)
La perméabilisation de la membrane lipidique est actuellement un domaine de recherche important, puisque l'optimisation du transport des petites molécules (comme l'ADN ou les protéines) dans les cellules est nécessaire. Dans ce travail, nous tentons une contribution dans ce domaine en proposant une méthode de perméabilisation contrôlée à l'aide des Azobenzene Modified Polymers (AMP). Des copolymères avec un taux d'hydrophobicité modéré ont été montrés dans le passé comme perméabilisant la membrane. Les AMP nous permettraient alors de contrôler cette perméabilisation via le contrôle de leur taux d'hydrophobicité (selon la longueur d'onde de la lumière à laquelle ils sont illuminés). Cette hypothèse a été vérifiée à l'aide des vésicules géantes unilamellaires (GUV) encapsulant des sondes fluorescentes solubles. La cinétique de la fuite de ces sondes en combinaison avec des expériences d'électrophysiologie sur des films noirs (BLM) nous donne accès à une meilleure caractérisation des structures de perméation créées par l'interaction entre l'AMP et les lipides. En outre, des expériences ont été réalisées sur des cellules CHO (Chinese Hamster Overy). La possibilité de faire rentrer dans les cellules des molécules qui a priori n'y sont pas internalisées a été étudiée. Par ailleurs, la fuite de molécules encapsulées dans les cellules et sa cinétique ont été examinées
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Imagerie térahertz par réflexion interne totale pour la biologie. : Application à l'étude de la perméabilisation cellulaire. / Terahertz imaging by total internal reflection for Biology. : Application to cell permeabilization study.Grognot, Marianne 18 October 2016 (has links)
Les ondes térahertz s’étendent de 0.1 à 10x1012 Hz, à la frontière entre les domaines de l’optique et des radiofréquences. Cette position intermédiaire originale en a longtemps rendu l’accès difficile : les technologies térahertz n’ont pris leur essor qu’au cours des années 90. Le domaine n’a pas encore atteint la maturité des domaines des microondes ou de l’infrarouge qui le jouxtent. Cependant, les motivations exploratoires sont fortes, de par la sensibilité spectroscopique du térahertz aux états moléculaires (rotationnels, vibrationnels..) et aux liaisons faibles établies dans et entre les molécules. Dans le cas des objets biologiques, le térahertz est particulièrement sensible à l’eau : sa quantité, son état physico-chimique et ses solutés.Nous avons mis en œuvre un montage d’imagerie en réflexion interne totale atténuée (ATR) pour pouvoir distinguer des cellules vivantes de leur milieu physiologique. Au cours de ce travail, le montage d’imagerie ATR a été caractérisé théoriquement, puis expérimentalement. La première démonstration de l’origine du contraste sur ces images térahertz a été réalisée. Il provient du contenu intracellulaire, plus spécifiquement des protéines et peptides dissouts dans le cytoplasme.Une analyse fine des mécanismes sous-jacents à la nature protéique du contraste térahertz a également été développée. Elle donne accès à des informations spectroscopiques inédites sur l’eau, les protéines dissoutes et la couche de solvatation les entourant.Mettant à profit cette compréhension de notre montage térahertz, nous l’avons proposé comme outil non invasif de suivi quantitatif de la perméabilisation de cellules en conditions physiologiques. Lors de la perméabilisation, augmentation des transferts moléculaires à travers la membrane, notre outil permet de quantifier le passage des peptides et protéines. La perméabilisation de cellules vivantes a une gamme d’application vaste, de l’entrée de fluorochromes pour l’imagerie ou de médicaments à la thérapie génique. Afin d’assurer ces passages à travers la membrane des cellules, il est nécessaire d’altérer ses propriétés, sans pour autant compromettre la viabilité cellulaire. L’étude de deux types de perméabilisation avec notre outil térahertz est proposée : la perméabilisation chimique et l’électroporation. Dans les deux cas, des mécanismes d’effet dose ont été caractérisés quantitativement. Notre outil térahertz a démontré de grands avantages devant les méthodes actuellement utilisées pour quantifier ces dynamiques de perméabilisation et en caractériser la réversibilité. / Lying between 0.1 to 10x1012 Hz, the terahertz radiation occupies a middle ground between microwaves and infrared light waves, sometimes named “the terahertz gap” for technologies relevant to generation and detection have only risen at the beginning of the 90’s and aren’t fully developed yet. Nevertheless, there are strong exploratory incentives because of terahertz spectroscopic sensitivity to molecular states (rotational, vibrational…) and weak bounds in and between molecules. In the case of biological object, terahertz waves are especially sensitive to water: its quantity, physico-chemical state and solutes. We implemented an Attenuated Total internal Reflection (ATR) imaging setup in order to distinguish live cells from their physiological bathing medium. Throughout this work, we characterized both experimentally and experimentally the ATR setup. The first demonstration of the contrast origin in the terahertz images obtained was done. It arises from the intracellular content, more specifically the proteins and peptides dissolved in the cytoplasm.A precise analysis of the underlying mechanism of this proteinaceous terahertz contrast has also been developed. It gives access to original spectroscopic information about water, dissolved proteins and the hydration shell around them.Taking advantage of our whole setup comprehension, we proposed it as a non-invasive tool for quantitative live-cell permeabilization assessment in physiological conditions. During permeabilization, aka increased molecular transfers through the cell membrane, our tool allows to quantify the transfer of peptides and proteins. Live-cell permeabilization has a large application range, from fluorochrome entry in imaging, to drugs or gene therapy. In order to ensure molecules crossing the cell membrane, it’s necessary to alter its properties without compromising cell viability.A study of two permeabilization methods is proposed: chemical permeabilization and electroporation. In both cases dose effect mechanisms were quantitatively characterized. Our terahertz tool demonstrated great advantages over classical permeabilization quantification methods and permeabilization reversibility assessment methods.
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Study of cell membrane permeabilization induced by pulsed electric field – electrical modeling and characterization on biochip / Etude de la permeabilisation d’une membrane cellulaire par un champ électrique pulsé développement d’une modélisation électrique – caractérisation sur biopuces à cellulesTrainito, Claudia 04 December 2015 (has links)
Depuis plusieurs années, de nouvelles méthodologies basées sur l’utilisation du champ électrique pour agir ou caractériser les cellules ou les tissus cellulaires génèrent de nombreuses avancées et apportent des nouvelles promesses dans les laboratoires de recherche et dans l'industrie : diagnostic de cancer, ElectroChimioThérapie (insertion d’un médicament en perméabilisant les membranes des cellules), thérapie génique (insertion d’un gène thérapeutique), immunothérapie (vaccins anti-tumoraux obtenus par électrofusion de cellules dendritiques et cellules cancéreuses pour réactiver le système immunitaire).L’application d’ impulsions électriques à des cellules ou dans des tissus cellulaires induit un changement sur leurs propriétés, en particulier sur leurs membranes qui deviennent transitoirement perméables, laissant temporairement le passage aux ions et macro-molécules. Les phénomènes induits lors d’une perméabilisation par application de champ électrique ont été partiellement caractérisés en microscopie epi-fluorescence. Pour effectuer un suivi en temps réel de la dynamique du processus de l’électroperméabilisation, une voie prometteuse consiste à caractériser électriquement l’échantillon. Dans cet objectif, mon travail de thèse consiste à mettre en oeuvre le suivi en temps réel de l’évolution des caractéristiques électriques sur une large bande de fréquences d’un tissu cellulaire ou d’une cellule isolée, avant, pendant et après la sollicitation par un champ électrique pulsé.Dans le cadre de ma thèse un modèle du système biologique et de son environnement a été élaboré, afin de mieux décrire des phénomènes observés expérimentalement: effet des sollicitations électriques sur la viabilité cellulaire, sur la perméabilité de la membrane externe, effets induits sur les composés intracellulaires, dynamique de fusion membranaire. Le degré de perméabilisation de l’objet biologique (cellule ou tissu) dépend de manière fortement non-linéaire de nombreux paramètres, ce qui rend complexe l’élaboration de ce modèle et son interprétation. La détection de ce niveau de perméabilisation est effectuée en temps réel (mesure du niveau de perméabilisation avant, pendant et après l’application de l’impulsion électrique). In fine cette approche devrait permettre d’optimiser le taux de perméabilisation cellulaire en fonction de l’application considérée. Ce système de contrôle individuel du niveau de perméabilisation cellulaire pourrait à terme être parallélisé massivement sur une puce dédiée à l’électroporation d’un grand nombre de cellules. Afin d’avoir une vision multi-échelle des effets, l’étude a été menée sur plusieurs modèles expérimentaux: qui vont du tissu (échelle millimétrique) à la cellule unique, en passant par les échelles intermédiaires (caractérisation de spéroides cellulaires).Dans ces deux derniers cas (sphéroide, cellule unique) l’objet biologique est isolé dans une biopuce microfluidique équipée d’électrodes de mesure et d’application du champ (échelle micrométrique).Les micro-dispositifs que j’ai réalisé pour caractériser en temps réel la perméabilisation de cellules, intègrent une géométrie spécifique d’électrodes, ainsi que d'un réseau de canaux microfluidiques pour contrôler le débit de cellules Le degré de miniaturisation de ces puces permet de travailler au niveau de la cellule unique, et appliquer des champs électriques de forte amplitude, de forte fréquence, localisés spatialement. / The increasing interest for new methodologies based on the use of the electric field to characterize the cells or tissue cells and generate brought promising development in research laboratories and industry: cancer diagnosis, electrochemotherapy (insertion of a drug after cell membranes permeabilization), gene therapy (insertion of a therapeutic gene), immunotherapy (anti-tumor vaccines obtained by electrofusion of dendritic cells and cancer cells to activate the immune system).The application of electrical pulses to cells or cell tissues induces a change in their properties, in particular on their membranes which become transiently permeable, and temporarily allow the passage of ions and macromolecules. Effect linked to the permeabilization phenomenon have been partially characterized by epi-fluorescence microscopy. Nevertheless, in order to perform the real-time monitoring of the electroporation process and know its dynamics, the electrical sample characterization is employed. Thus the aim of this work is to implement a real-time monitoring of dielectrical characteristics changes, on a wide frequency range, of a cellular tissue or a single cell, before, during and after the pulsed electric field application.As part of my thesis a model of the biological system has been developed to better describe the phenomena observed experimentally: effect of electrical stress on cell viability, on the permeability of the outer membrane, induced effects on the intracellular compounds, dynamics of membrane fusion.The degree of permeabilization of the biological sample (cells or tissues) is non linearly dependent of several parameters, which makes complicated the development of the model and its interpretation.The detection of a specific level of permeabilization is done in real time (measure of the level of permeabilization before, during and after the electric pulses application). This cell permeabilization level control could eventually be parallelized on a chip dedicated to the electroporation of a large number of cells. The latter can be used to optimize the electric pulses parameters in order to reach the desired permeabilization level. In order to have a multi-scale overview of the phenomenon, the study was performed on different size-level: from the tissue level (millimeter scale) to the single cell model through the intermediate scales (cell spéroides characterization).In the latter two cases (spheroid, single cell) the biological sample is isolated in a microfluidic biochip where the electric field solicitation are applied (micrometer scale).The microdevice designed and fabricated during this work, allows the real time characterization of the cell permeabilization. Furthermore the miniaturization of the system is crucial to work at the level of the single cell, and make possible the application of electrical fields of high amplitude, high frequency and spatially localized.
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Synthèse de nouveaux sels de benzimidazolium rigide pour la perméabilisation membranaireDubreuil, Amélie 12 1900 (has links)
La résistance aux antibiotiques est responsable de nombreuses maladies et décès depuis plusieurs décennies. L'augmentation de la résistance bactérienne a donc encouragé les chercheurs à développer de nouveaux antibiotiques, et de nouvelles stratégies pour contrer les différents mécanismes de résistance. L'un des mécanismes de résistance les plus notables est la formation de biofilms. Par conséquent, notre groupe de recherche s'est concentré sur différents types de mécanismes d'action des antibiotiques, plus particulièrement sur la perméabilisation de la membrane cellulaire. Ceci est réalisé par la formation de pores, d'agrégats, de canaux ou de micelles à travers celle-ci. En réponse à cela, nous avons synthétisé des composés antibactériens possédant deux cations benzimidazolium, deux chaînes apolaires hydrophobes et un échafaudage phényl- ou pyridyl-phényléthynylène, ayant la capacité de former des agrégats supramoléculaires via des interactions π-π et des liaisons hydrogène à travers la bicouche lipidique. Ces composés perturbateurs de la membrane agissent par un mécanisme rapide et efficace et ont montré de bons résultats contre les souches MRSA (Methicilin Resistant Staphylococcus Aureus), ce qui en fait des candidats prometteurs pour combattre les infections bactériennes et la formation des biofilms. / Antibiotic resistance has been responsible for multiple diseases and deaths for several decades. The rise of bacterial resistance has therefore encouraged researchers to develop new antibiotics, and new strategies to counter their various resistance mechanisms. One of the more notable resistance mechanics is the formation of biofilms. Consequently, our research group focused on the different types of antibiotics mechanisms of action, more particularly on the permeabilization of the cell membrane. This is achieved through the formation of pores, aggregate, channels, or micelles through it. In response to this, we have thus synthesized antibacterial compounds with a benzimidazolium cation, a hydrophobic apolar chain and a phenyl- or pyridyl-phenylethynylene scaffold with the capacity to form supramolecular aggregates via π-π interaction and hydrogen bonding through the lipid bilayer. These membrane-disrupting compounds act via a rapid and effective mechanism and have shown good results against strains of MRSA, thus making promising candidates to combat bacterial infections and biofilms formation.
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Identification et caractérisations physico-chimiques et pharmacologiques de nouvelles molécules bioactives isolées à partir de venins d’animaux : exemple des peptides antimicrobiens / Identification, physicochemical and pharmacological characterisation of new bioactive molecules isolated from animals venoms : example of antimicrobial peptidesMollet, Chloé 20 October 2017 (has links)
La recherche de nouvelles molécules bioactives utilisables en thérapeutique est un enjeu majeur de santé publique en particulier dans le traitement de certaines maladies telle que les infections bactériennes.La résistance naturelle des bactéries et la surutilisation des antibiotiques ont entraîné la sélection de bactéries pathogènes résistantes à de multiples médicaments. Depuis les dernières décennies, la résistance aux antibiotiques conventionnels a limité les options thérapeutiques, entraînant une augmentation significative de la mortalité et de la morbidité dans les hôpitaux. En outre, depuis 1970, seules deux nouvelles classes d'antibiotiques ont été mises sur le marché. Les venins constituent une source riche de substances naturelles pharmacologiquement actives uniques et novatrices, tels que les peptides antimicrobiens (PAMs) qui représentent une alternative originale pour remédier à ce problème de santé publique.Dans notre étude, parmi les 200 venins d’animaux étudiés pour leurs propriétés antibactériennes, au moins six PAMs ont été isolés à partir d’un venin d’insecte. Le peptide 1 original inhibe la croissance des bactéries Gram positives et négatives mais présente une forte hémotoxicité (IT = 1,6-3,2). La synthèse en phase solide d’analogues structuraux a permis d’identifier R1W8 et I1N11, moins toxiques (IT = 18 et >800 respectivement). Les résultats préliminaires de l’étude du mécanisme d’action suggèrent que ces peptides agissent contre les bactéries par perméabilisation de leur membrane cytoplasmique. Ces peptides peuvent servir de modèles pour l’élaboration de nouveaux agents antimicrobiens. / The research for new bioactive molecules which can be used in therapeutic is a major public health issue, particularly in the treatment of certain diseases such as bacterial infections.The natural resistance of bacteria consecutive to overuse of antibiotics have resulted in the selection of pathogenic multi-drug resistant bacteria. Over the last few decades, resistance to conventional antibiotics has limited treatment options, resulting in a significant increase in mortality and morbidity in hospitals. Moreover, since 1970, only two new classes of antibiotics have been placed on the market. Venoms are known to be a rich source of unique and innovative pharmacologically active substances, such as antimicrobial peptides (PAMs), which represent an original alternative to small molecules for the development of new active and non-resistance inducing antibiotics.In our study, among the 200 venoms of animals studied for their antibacterial properties, at least six PAMs were isolated from an insect venom. The original peptide 1 inhibits the growth of Gram positive and negative bacteria but shows a high hemotoxicity (TI = 1,6-3,2). The solid phase synthesis of structural analogs allowed to identify R1W8 and I1N11, less toxic (TI = 18 et >800 respectively). The preliminary results of the action mechanism study suggest that these peptides have a pore-forming action on bacteria cytoplasmic membrane. These peptides can be used as models for the development of new antimicrobial agents.
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Spectroscopie diélectrique hyperfréquence de cellules individualisées sous électroporation / Microwave dielectric spectroscopy of single cells under electroporationTamra, Amar 09 March 2017 (has links)
L'électroporation est un procédé physique qui consiste à appliquer des impulsions de champ électrique pour perméabiliser de manière transitoire ou permanente la membrane plasmique. Ce phénomène est d'un grand intérêt dans le domaine clinique ainsi que dans l'industrie en raison de ses diverses applications, notamment l'électrochimiothérapie qui combine les impulsions électriques à l'administration d'une molécule cytotoxique, dans le cadre du traitement des tumeurs. L'analyse de ce phénomène est traditionnellement réalisée à l'aide des méthodes optique et biochimique (microscopie, cytométrie en flux, test biochimique). Elles sont très efficaces mais nécessitent l'utilisation d'une large gamme de fluorochromes et de marqueurs dont la mise en œuvre peut être laborieuse et coûteuse tout en ayant un caractère invasif aux cellules. Durant ces dernières années, le développement de nouveaux outils biophysiques pour l'étude de l'électroporation a pris place, tels que la diélectrophorèse et la spectroscopie d'impédance (basse fréquence). Outre une facilité de mise en œuvre, ces méthodes représentent un intérêt dans l'étude des modifications membranaires de la cellule. De là vient l'intérêt d'opérer au-delà du GHz, dans la gamme des micro-ondes, pour laquelle la membrane cytoplasmique devient transparente et le contenu intracellulaire est exposé. L'extraction de la permittivité relative suite à l'interaction champ électromagnétique/cellules biologiques reflète alors l'état cellulaire. Cette technique, la spectroscopie diélectrique hyperfréquence, se présente comme une méthode pertinente pour analyser les effets de l'électroporation sur la viabilité cellulaire. De plus, elle ne nécessite aucune utilisation des molécules exogènes (non-invasivité) et les mesures sont directement réalisées dans le milieu de culture des cellules. Deux objectifs ont été définis lors de cette thèse dont les travaux se situent à l'interface entre trois domaines scientifiques : la biologie cellulaire, l'électronique hyperfréquence et les micro-technologies. Le premier objectif concerne la transposition de l'électroporation conventionnelle à l'échelle micrométrique, qui a montré une efficacité aussi performante que la première. La deuxième partie du travail concerne l'étude par spectroscopie diélectrique HyperFréquence de cellules soumises à différents traitements électriques (combinés ou non à une molécule cytotoxique). Ces travaux présentent une puissance statistique et montrent une très bonne corrélation (R2 >0 .94) avec des techniques standards utilisées en biologie, ce qui valide 'biologiquement' la méthode d'analyse HF dans le contexte d'électroporation. Ces travaux montrent en outre que la spectroscopie diélectrique hyperfréquence s'avère être une technique puissante, capable de révéler la viabilité cellulaire suite à un traitement chimique et/ou électrique. Ils ouvrent la voie à l'analyse 'non-invasive' par spectroscopie diélectrique HyperFréquence de cellules électroporées in-situ. / Electroporation is a physical process that consists in applying electric field pulses to transiently or permanently permeabilize the plasma membrane. This phenomenon is of great interest in the clinical field as well as in the industry because of its various applications, in particular electrochemotherapy which combines electrical pulses with the administration of a cytotoxic molecule in the treatment of tumors. The evaluation of this phenomenon is raditionally carried out using optical and biochemical methods (microscopy, flow cytometry, biochemical test). They are very effective but require the use of a wide range of fluorochromes and markers, which can be laborious and costly to implement, while being invasive to the cells. In recent years, the development of new biophysical tools for the study of electroporation has taken place, such as dielectrophoresis and impedance spectroscopy (low frequency). In addition to the ease of implementation, these methods are of interest in the study of membrane modifications of the cell. Hence the advantage of operating beyond the GHz, in the range of microwaves, for which the cytoplasmic membrane becomes transparent and the intracellular content is exposed. The extraction of the relative permittivity as a result of the electromagnetic field / biological cell interaction then reflects the cell state. This technique, microwave dielectric spectroscopy, is a relevant method for analyzing the effects of electroporation on cell viability. Moreover, it does not require any use of the exogenous molecules (non-invasive) and the measurements are directly carried out in the culture medium of the cells. Two objectives were defined during this thesis whose work is located at the interface between three scientific fields: cellular biology, microwave electronics and micro-technologies. The first objective concerns the transposition of conventional electroporation to the micrometric scale, which has shown an efficiency as efficient as the first. The second part of the work concerns the study by HighFrequency dielectric spectroscopy of cells subjected to different electrical treatments (combined or not with a cytotoxic molecule). This work presents a statistical power and shows a very good correlation (R2> 0.94) with standard techniques used in biology, which biologically validates the HF analysis method in the context of electroporation. This work also shows that microwave dielectric spectroscopy proves to be a powerful technique capable of revealing cell viability following chemical and / or electrical treatment. They open the way to 'non-invasive' analysis by hyper-frequency dielectric spectroscopy of electroporated cells in situ.
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Etude de la perméabilisation de la membrane plasmique et des membranes des organites cellulaires par des agents chimiques et physiques / Study of plasma membrane and organelles membranes permeabilization by chemical and physical agentsMénorval, Marie-Amélie de 25 November 2013 (has links)
Il est possible de perméabiliser la membrane plasmique des cellules par des agents chimiques (tels que les polyéthylènes glycols ou le diméthylsulfoxyde) ou par des agents physiques (tels que les ultrasons ou les impulsions électriques). Cette perméabilisation peut être réversible ou non, ce qui signifie qu’après la perméabilisation, la membrane retrouve son intégrité et ses propriétés d’hémi-perméabilité ou pas. Ces techniques peuvent être utilisées pour faire rentrer des médicaments ou des acides nucléiques dans les cellules ou pour générer des fusions cellulaires. Une approche récente, la dynamique moléculaire, utilise des simulations numériques pour prédire les effets des agents perméabilisants sur les membranes à l’échelle moléculaire, et permet d’apporter de nouvelles données pour comprendre les mécanismes moléculaires, encore peu connus à ce jour.Les impulsions dites « classiques » en électroperméabilisation, de l’ordre de la dizaine de millisecondes à la centaine de microsecondes et d’amplitude de champ de l’ordre de 100 kV/m, perméabilisent la membrane plasmique uniquement. Cependant, récemment, des impulsions plus courtes, dites impulsions nanoseconde (quelques nanosecondes) et de plus grande amplitude de champ (de l’ordre de 10 MV/m) ont été utilisées et permettent d’affecter également les membranes des organites cellulaires. Les travaux de cette thèse portent dans un premier temps sur les effets perméabilisants d’un agent chimique (le diméthylsulfoxyde, DMSO) en comparant les modèles prédictifs de la dynamique moléculaire avec des expériences in vitro sur des cellules. Le modèle numérique prédit trois régimes d’action en fonction de la concentration du DMSO. Utilisé à faible concentration, il y a déformation de la membrane plasmique. L’utilisation d’une concentration intermédiaire entraîne la formation de pores membranaires et les fortes concentrations de DMSO ont pour conséquence la destruction de la membrane. Les expériences in vitro faites sur des cellules ont confirmé ces résultats en suivant l’entrée de marqueurs de perméabilisation. Cette étude a été comparée avec la perméabilisation par un agent physique (les impulsions électriques). Dans un deuxième temps, ces travaux traitent du développement et de l’utilisation d’un nouveau dispositif d’exposition des cellules aux impulsions nanoseconde qui permet d’appliquer des champs électriques très élevés et d’observer par microscopie leurs au niveau cellulaire. Pour finir, ce dispositif a été utilisé avec des impulsions nanoseconde pour générer des pics calciques dans de cellules souches mésenchymateuses qui présentent des oscillations calciques spontanées liées à leur état de différenciation. Ces pics induits sont dus à la libération de calcium stocké dans les organites et/ou à la perméabilisation de la membrane plasmique permettant l’établissement d’un flux de calcium intramembranaire. Il est aussi possible d’utiliser des impulsions microseconde pour générer des pics calciques dans ces cellules. Dans ce cas, les pics calciques ne sont dus qu’à la perméabilisation de la membrane plasmique. En jouant sur l’amplitude des champs électriques appliqués et sur la présence ou l’absence de calcium externe, il est possible de manipuler les concentrations calciques cytosoliques en mobilisant le calcium interne ou externe. Une des particularités de ces nouveaux outils est de pouvoir être déclenchés et arrêtés instantanément, sans réminiscence, contrairement aux molécules chimiques permettant de produire des pics calciques. Ces outils pourraient donc permettre de mieux comprendre l’implication du calcium dans des mécanismes comme la différenciation, la migration ou la fécondation. / It is possible to permeabilize the cellular plasma membrane by using chemical agents (as polyethylen glycols or diméthylsulfoxyde) or physical agents (as ulstrasounds or electric pulses). This permeabilization can be reversible or not, meaning that after the permeabilization, the membrane recovers its integrity and its hemi-permeable properties. These techniques can be used for the uptake of medicines or nucleic acids or to generate cellular fusions. A recent approach, the molecular dynamics, uses numerical simulations to predict the effects of permeabilizing agents at the molecular scale, allowed generating of new data to understand the molecular mechanisms that are not completely known yet.The pulses so called “classical” in electropermeabilization, from the range of the ten of milliseconds to the hundred of microseconds and with a field amplitude in the range of 100 kV/m, can only permeabilize the plasma membrane. However, more recently, shorter pulses, so called nanopulses (few nanosecondes) and with an higher field amplitude (in the range of 10 MV/m) have been used and allow to affect also cellular organelles membranes.This thesis is, in a first time, about the permeabilizing effects of a chemical gent (the diméthylsulfoxyde, DMSO) by comparing predictive models from molecular dynamics with experiments in vitro on cells. The numerical model predicts three regimes of action depending on the DMSO concentration. Used at low concentration, there is a plasma membrane deformation. The use of an intermediate concentration lead to membrane pores formation and higher DMSO concentrations resulted in membrane destruction. The experiments done in vitro on cells confirmed these results using the following of permeabilization markers. This study has been compared to permeabilization due to a physical agent (electric pulses).Secondly, it is about the development and the use of a new cell exposure device for nanopulses that permit to apply very high electric fields and to observe induced cellular effects simultaneously by microscopy.To finish, this device has been used with nanopulses to generate calcium peaks in mesenchymal stem cells that are presenting spontaneous calcium oscillations in correlation to their differentiation state.. These induced peaks are due to the release of the calcium stored in organelles and/or to plasma membrane permeabilization leading to a intramembrane calcium flux establishment. It is also possible to use microsecond pulses to generate calcium peaks in these cells. In this case, the calcium peaks are due to the plasma membrane permeabilization . By changing the amplitude of the applied electric fields and the presence or the absence of external calcium, it is possible to manipulate cytosolic calcium concentrations by mobilizing internal or external calcium. One feature of these new tools is to be triggered and stopped instantly without reminiscence, unlike chemical molecules permitting the production of calcium peaks. These tools could therefore lead to a better understanding of the involvement of calcium in mechanisms such as differentiation, migration or fertilization.
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