Orientador: Aníbal Eugênio Vercesi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T00:12:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_ViniciusVercesiAlmadaNogueira_M.pdf: 1353533 bytes, checksum: b60bd544902662a56e45ea9cf1e14b01 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Além de essencial na respiração celular, a mitocôndria é considerada uma organela de papel fundamental em processos de sinalização e morte celular. A geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) e de espécies reativas de nitrogênio (ERNs) pela mitocôndria podem ser consequência destes processos de sinalização tanto em condições fisiológicas quanto em patologias, tais como a dislipidemia e câncer. A transição de permeabilidade mitocondrial (TPM) é um tipo de permeabilização não-seletiva da membrana mitocôndrial interna que permite a passagem de moléculas de até 1,5 KDa, causando dissipação do potencial eletroquímico de H+ e inchamento da organela. O termo transição é usado porque a permeabilização pode ser parcialmente revertida, logo após o inicio do processo, pela adição de quelantes de Ca2+ como o EGTA, por exemplo, ou redutores tiólicos. A oxidação de grupamentos tiólicos promove a TPM. Os experimentos apresentados nesta tese indicam o composto 2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-l-oxyl-3-oxide (cPTIO) caracteriza-se como um inibidor da TPM. As pequenas alterações observadas em relação à respiração e fosforilação oxidativa não se correlacionam com a abertura do PTP, pelo menos com base na literatura corrente. Em outras palavras, a presença de cPTIO diminuiu os níveis de NOo mitocondrial e desviou a reação deste composto com o ânion superóxido diminuindo a produção de peroxinitrito, provável indutor de abertura do PTP nestas condições experimentais / Abstract: In addition to be the site of cellular respiration, the mitochondrion has important role in cell signaling for cell physiology and death. The generation of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) by the mitochondrion can participate in cellular signaling both in physiological and pathological conditions, such as dyslipidemia and cancer. The Mitochondrial Permeability Transition (MPT) is a non-selective inner membrane permeabilization that enables free passage of molecules up to 1.5 kDa, dissipating the H+ electrochemical gradient and the organelle's swelling. The term transition is applied because the permeabilization can be partially reverted, right after the beginning of the process, by chelating extramitochondrial Ca2+ with EGTA, for example, or by using thiol reducers. The oxidation of membrane protein thiols leads to MPT. The experiments shown in this thesis indicate that the compound 2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-l-oxyl-3-oxide (cPTIO) has proven to be a strong inhibitor agent of the MPT. The small changes observed in relation to respiration and oxidative phosphorylation did not correlate with the opening of PTP, at least on the basis of the current literature. In other words, the presence of cPTIO decreased levels of NOo and mitochondrial diverted reaction of this compound with superoxide anion decreasing production of peroxynitrite, likely inducing PTP opening under these experimental conditions / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientadores: Anibal Eugênio Vercesi, Helena Coutinho Franco de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T11:59:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marques_AnaCarolina_M.pdf: 1109688 bytes, checksum: 76a66df390130e764ca54b415b0756b4 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Os camundongos hipercolesterolêmicos (LDLr-/-) provenientes do Jackson Laboratory são modelos experimentais valiosos para o estudo da aterosclerose. Estes animais apresentam elevadas taxas de lipogênese, processo que consome grandes quantidades de NADPH. Pesquisas recentes revelaram que esta linhagem possui, além da deleção do gene do receptor de LDL, uma mutação no gene da NADP- transidrogenase (NNT). A falta da NNT pode gerar estresse oxidativo devido ao fornecimento deficiente de NADPH mitocondrial. O objetivo deste trabalho foi investigar a participação da elevação da lipogênese e da deficiência de NNT sobre o estado redox mitocondrial e suscetibilidade à transição de permeabilidade mitocondrial (TPM). Para tanto foram comparadas três linhagens de camundongos: LDLr-/- (deficiente do receptor de LDL e da NNT), C57BL6/J (deficiente apenas da NNT) e C57BL6/JUnib (controle). Foram avaliados: o controle respiratório mitocondrial (consumo de oxigênio), o estado redox de NAD(P) (fluorimetria), a susceptibilidade à transição de permeabilidade mitocondrial induzida por cálcio (inchamento e dissipação do potencial elétrico de membrana (??) sensíveis à ciclosprina A e a geração de peróxido de hidrogênio (H2O2) (Amplex red®) em mitocôndrias isoladas de coração e fígado. Observamos que não houve diferenças significativas nos parâmetros respiratórios mitocondriais nos dois tecidos das três linhagens estudadas. Como esperado, as mitocôndrias dos camundongos LDLr-/- e C57BL6/J não podem sustentar o estado reduzido de NADPH in vitro, uma vez que são deficientes de NNT. Observamos que houve diferenças significativas entre as 3 linhagens quanto à TPM da seguinte maneira: LDLr-/- > C57BL6/J > C57BL6/JUnib (controle) em mitocôndrias isoladas de fígado (inchamento e dissipação de ??) e em mitocôndrias de coração (??). Além disso, a produção de H2O2 por mitocôndrias hepáticas seguiu o mesmo padrão, sendo LDLr-/- > C57BL6/J > C57BL6/JUnib (controle). Em conjunto, estes resultados indicam que a maior suscetibilidade à TPM das mitocôndrias de camundongos LDLr-/- está correlacionada com diminuição de NADPH, tanto por aumento de consumo (devido a elevada lipogênese) quanto por diminuição de sua produção (deficiência em NNT) / Abstract: Hypercholesterolemic LDL receptor knockout mice (LDLr-/-) from Jackson Laboratory are valuable experimental models to study atherosclerosis development. These mice exhibit high rates of lipogenesis, a process that consumes large amounts of NADPH. It was recently discovered that the mice strain used to produce the LDLr-/- also carries a homozygous NADP-transhydrogenase (NNT) mutation. Loss of NNT may cause oxidative stress due to a poor supply of mitochondrial NADPH. The objective of this study was to investigate the role of elevated lipogenesis and NNT deficiency on the mitochondrial redox status and susceptibility to mitochondrial permeability transition (MPT). Three mice strains were compared: LDLr-/- mice (deficient of both LDL receptor and NTT), C57BL6/J (deficient in NNT only) and the wild type control mice C57BL6/JUnib. We evaluated the mitochondrial respiratory control (oxygen consumption), the NAD(P) redox status (fluorimetry), the susceptibility to calcium induced mitochondrial permeability transition (swelling and dissipation of membrane potential (??) sensitive to cyclosporin A) and the generation of H2O2 (Amplex red®) in isolated heart and liver mitochondria. We observed no significant differences in mitochondrial respiratory parameters in both tissues of the three mice strains studied. As expected, the mitochondria of LDLr-/- and C57BL6/J mice cannot maintain the NADP in the reduced state in vitro, since they are deficient in NNT. Regarding the susceptibility to MPT, we observed significant differences among mitochondria from the 3 strains, as follows: LDLr-/- > C57BL6/J > C57BL6/JUnib (control) in isolated liver mitochondria (swelling and potential dissipation) and in heart mitochondria potential dissipation). Furthermore, the production of H2O2 by the liver mitochondria followed the same MPT pattern: LDLr-/- > C57BL6/J > C57BL6/JUnib (control). Together, these results indicated that the greater susceptibility of LDLr-/- mitochondria to MPT is correlated with decreased NADPH which is explained by both increased consumption (due to high lipogenesis) and decreased production (deficiency NNT) / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestra em Ciências

O sulindaco é um antiinflamatório não esteroidal (AINE) classificado quimicamente como ácido carboxílico, da classe dos acetatos, que inibe de forma não seletiva a cicloxigenase 1 e 2. Terapeuticamente, é utilizado como agente analgésico e antiinflamatório para o tratamento de sintomas da artrite reumatóide aguda e crônica, osteoartrite e espondilite anquilosante, no entanto, seu uso não está restringido somente a estas patologias, pois apresenta atividade quimiopreventiva, sendo atualmente também utilizado para este fim, apesar de inúmeros relatos de toxicidade gastrointestinal e hepática terem sido relatados na literatura. Ele é ingerido como um pró-fármaco, e por reações de biotransformação hepática origina um metabólito reduzido (sulindaco sulfeto, ativo farmacologicamente) e outro oxidado (sulindaco sulfona, inativo). Para avaliar os efeitos do sulindaco e seus metabólitos, foram realizados estudos in vitro em mitocôndrias isoladas de fígado de rato, para explorar aspectos mecanísticos de toxicidade mitocondrial, e ensaios com linhagem celular de hepatoma humano HepG2, para avaliar seus efeitos após metabolização, uma vez que estas células mantém enzimas responsáveis pelas reações de biotransformação de fase I e II. Nossos resultados demonstram que o sulindaco sulfeto estimula a respiração de estado 4 e promove a liberação de cálcio pré-acumulado pela organela de maneira concentração-dependente, sendo evidente o efeito desacoplador sobre a fosforilação oxidativa, refletidos na diminuição da viabilidade celular em associação com a diminuição do conteúdo de ATP, provocado pela dissipação do potencial de membrana mitocondrial, sugerindo um mecanismo protonoforético de desacoplamento, responsável pela toxicidade deste antiinflamatório. Além disso, foi observado o inchamento das mitocôndrias em meio energizado, condição que ocorre independente de cálcio presente no meio reacional. Este evento foi parcialmente sensível a ciclosporina A e Mg2+, teve prevenção total com a adição de BHT e insensibilidade a outros moduladores, como ADP, ATP, DTT e NEM. Os resultados não condizem com a transição de permeabilidade mitocondrial clássica, uma vez que é dependente de cálcio, e o mecanismo de prevenção deste efeito obtida com a adição de BHT é desconhecido, pois não foi observada a indução de formação de radicais livres nos dois modelos experimentais utilizados. No entanto, a indução de intumescimento mitocondrial pode contribuir para seus efeitos tóxicos. O sulindaco e o sulindaco sulfona não apresentaram quaisquer efeitos descritos para o sulindaco sulfeto, indicando que somente o metabólito farmacologicamente ativo é responsável pelos efeitos tóxicos observados. A biotransformação por reações de Fase I e II podem contribuir para a toxicidade in vivo, por originarem o metabólito reduzido, e como o sulindaco é utilizado em terapias que envolvem uso por tempo prolongado, é prudente realizar um monitoramento da função hepática antes e durante o período de tratamento, no sentido de prevenir complicações do uso na terapia convencional / Sulindac is a nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID) known to inhibit non-selectively ciclooxygenases (COX) 1 and 2. Sulindac is therapeutically used as anti-inflammatory and analgesic in the symptomatic treatment of acute and chronic rheumatoid arthritis, osteoarthritis, and ankylosing spondylits. In addition to this property, a role in the prevention/regression of colonic carcinogenesis, has been described for both sulindac and metabolites. Nevertheless, its therapeutic use has been limited because of its toxicity to the gastrointestinal tract and liver, reported in the literature. Sulindac is a prodrug that is ?in vivo? metabolized to its pharmacological active metabolite, sulindac sulfide and its pharmacological inactive one, sulindac sulfone. In order to assess the effects of sulindac and its metabolites, we used ?in vitro? studies with isolated rat liver mitochondria, to evaluate the aspects of its toxicity in mitochondria; and studies with human hepatoma cell line (HepG2), to evaluate its affects after biotransformation. The present study shows that sulindac sulfide, but not sulindac sulfone or sulindac itself, cause mitochondrial uncoupling, releasing pre-accumulated Ca2+ from the organelle, and decrease Hep-G2 cell viability in an apparent association with cellular ATP depletion resulted from mitochondrial uncoupling-associated membrane potential dissipation. We therefore propose mitochondrial uncoupling by sulindac sulfide as a potential mechanism for the well established toxicity of sulindac, at least to the liver in humans. It was also observed a mitochondrial swelling in energized media that can occur without dependence on the calcium present in the media. This event was partial inhibited by CsA and Mg2+, and completely inhibited with the addition of BHT. It did not show any inhibition with the addition of ADP, ATP, DTT or NEM. These results can not be associated to the classical mitochondrial permeability transition that is dependent to calcium, and the mechanism of inhibition observed with BHT is not known, since it was not observed any production of free radicals in our models, but the swelling observed can also contribute to the toxic effects observed. The sulindac itself and the sulfone metabolite did not show any toxic effect observed for the sulfide form, indicating that just the pharmacological active metabolite is responsible for the toxic effects. The biotransformation (phase I and II reactions) can contribute to sulindac toxicity, because they generate the reduced form. Sulindac is also used in long term treatment, so it is necessary the monitoring of the hepatic function is necessary before and during the treatment, in order to prevent any further complication.

Tamarindus indica L. é um componente natural amplamente consumido por humanos, apresentando propriedade antiinflamatória, antidiabética e antihepatotóxica. Além disso, como nós demonstramos previamente, o extrato apresenta atividade hipolipêmica e antioxidante. Neste trabalho, nós demonstramos o efeito do extrato de T. indica sobre mitocôndrias isoladas de fígado de rato. Na presença de Ca2+, o extrato causou um inchamento osmótico mitocondrial concentração-dependente, associado ao aumento da velocidade basal (V4), dissipação do potencial de membrana e liberação do Ca2+ pré-acumulado, os quais foram inibidos por ciclosporina A (CsA) e assim atribuídos a transição de permeabilidade da membrana mitocondrial (TPMM). A indução do inchamento osmótico mitocondrial foi prevenida por EGTA e vermelho de rutênio, indicando a dependência da TPMM de Ca2+. A oxidação de proteínas tiol mitocondrial, um mecanismo bem estabelecido como causador da TPMM, foi detectado. Entretanto, nenhuma alteração significante foi observada no estado redox de GSH. A oxidação de NAD(P)H e o acúmulo de espécies reativas de oxigênio produzidas pela mitocôndria foram observadas, em ambos os casos, foram prevenidas por CsA e/ou EGTA, indicando que são conseqüências da TPMM induzida pelo extrato de T. indica. Portanto, sem aparente envolvimento do estresse oxidativo no processo, sugerindo uma interação direta de compostos do extrato com grupos tiólicos de proteínas da membrana. O extrato de T. indica induziu uma depleção de ATP associada à TPMM, mostrando assim potencial para causar a morte celular por apoptose ou necrose, resultante da indução da TPMM por si ou pela depleção do ATP via TPMM. In vitro, o extrato apresentou capacidade scavenger de radicais livres, verificado pelo ensaio do DPPH, radical superóxido e radical hidroxil; e ainda foi capaz de diminuir a lipoperoxidação mitocondrial. Além disso, em baixas concentrações, o extrato mostrou uma propriedade quelante de Fe2+. / Tamarindus indica L. is a natural dietary component widely consumed by humans, presenting well established anti-inflammatory, anti-diabetic and anti-hepatotoxic properties. In addition, as we have previously demonstrated, extract presents hypolipemic and antioxidant activities. We show here the effects of T. indica extract on isolated rat liver mitochondria. In the presence of Ca2+, the extract caused mitochondrial concentration-dependent swelling, associated to, resting respiration increase (V4), membrane potential dissipation and release of pre-accumulated Ca2+, inhibited by cyclosporine A (CsA) and thus ascribable to mitochondrial permeability transition (MPT). This swelling induction was prevented by EGTA and ruthenium red, indicating strict dependence of MPT on Ca2+. Oxidation of mitochondrial membrane protein thiols, a well established mechanism causing MPT was detected. However, no significant change was observed in the GSH redox state, and the NADPH oxidation and accumulation of mitochondria-generated reactive oxygen species that was observed, were prevented by CsA and/or EGTA, indicating that they are consequence of the MPT induced by T. indica extract. Therefore, no apparent oxidative stress condition is involved as cause of this process suggesting that direct interaction with membrane protein thiol groups of the compounds responsible for MPT induction occurs. T. indica extract led to MPTassociated ATP depletion, thus showing the potential to cause cell death by apoptosis or necrosis resulting from MPT induction per se or from ATP depletion by MPT. In vitro, the extract presented free radical scavenging ability, as assessed by the 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH), superoxide radicals and radical hydroxyl assays, and led to decreased lipid peroxidation in mitochondria, as assessed by the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assay. In addition, the extract showed an iron chelanting property in low concentrations.

Tamarindus indica L. é um componente natural amplamente consumido por humanos, apresentando propriedade antiinflamatória, antidiabética e antihepatotóxica. Além disso, como nós demonstramos previamente, o extrato apresenta atividade hipolipêmica e antioxidante. Neste trabalho, nós demonstramos o efeito do extrato de T. indica sobre mitocôndrias isoladas de fígado de rato. Na presença de Ca2+, o extrato causou um inchamento osmótico mitocondrial concentração-dependente, associado ao aumento da velocidade basal (V4), dissipação do potencial de membrana e liberação do Ca2+ pré-acumulado, os quais foram inibidos por ciclosporina A (CsA) e assim atribuídos a transição de permeabilidade da membrana mitocondrial (TPMM). A indução do inchamento osmótico mitocondrial foi prevenida por EGTA e vermelho de rutênio, indicando a dependência da TPMM de Ca2+. A oxidação de proteínas tiol mitocondrial, um mecanismo bem estabelecido como causador da TPMM, foi detectado. Entretanto, nenhuma alteração significante foi observada no estado redox de GSH. A oxidação de NAD(P)H e o acúmulo de espécies reativas de oxigênio produzidas pela mitocôndria foram observadas, em ambos os casos, foram prevenidas por CsA e/ou EGTA, indicando que são conseqüências da TPMM induzida pelo extrato de T. indica. Portanto, sem aparente envolvimento do estresse oxidativo no processo, sugerindo uma interação direta de compostos do extrato com grupos tiólicos de proteínas da membrana. O extrato de T. indica induziu uma depleção de ATP associada à TPMM, mostrando assim potencial para causar a morte celular por apoptose ou necrose, resultante da indução da TPMM por si ou pela depleção do ATP via TPMM. In vitro, o extrato apresentou capacidade scavenger de radicais livres, verificado pelo ensaio do DPPH, radical superóxido e radical hidroxil; e ainda foi capaz de diminuir a lipoperoxidação mitocondrial. Além disso, em baixas concentrações, o extrato mostrou uma propriedade quelante de Fe2+. / Tamarindus indica L. is a natural dietary component widely consumed by humans, presenting well established anti-inflammatory, anti-diabetic and anti-hepatotoxic properties. In addition, as we have previously demonstrated, extract presents hypolipemic and antioxidant activities. We show here the effects of T. indica extract on isolated rat liver mitochondria. In the presence of Ca2+, the extract caused mitochondrial concentration-dependent swelling, associated to, resting respiration increase (V4), membrane potential dissipation and release of pre-accumulated Ca2+, inhibited by cyclosporine A (CsA) and thus ascribable to mitochondrial permeability transition (MPT). This swelling induction was prevented by EGTA and ruthenium red, indicating strict dependence of MPT on Ca2+. Oxidation of mitochondrial membrane protein thiols, a well established mechanism causing MPT was detected. However, no significant change was observed in the GSH redox state, and the NADPH oxidation and accumulation of mitochondria-generated reactive oxygen species that was observed, were prevented by CsA and/or EGTA, indicating that they are consequence of the MPT induced by T. indica extract. Therefore, no apparent oxidative stress condition is involved as cause of this process suggesting that direct interaction with membrane protein thiol groups of the compounds responsible for MPT induction occurs. T. indica extract led to MPTassociated ATP depletion, thus showing the potential to cause cell death by apoptosis or necrosis resulting from MPT induction per se or from ATP depletion by MPT. In vitro, the extract presented free radical scavenging ability, as assessed by the 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH), superoxide radicals and radical hydroxyl assays, and led to decreased lipid peroxidation in mitochondria, as assessed by the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assay. In addition, the extract showed an iron chelanting property in low concentrations.

O sulindaco é um antiinflamatório não esteroidal (AINE) classificado quimicamente como ácido carboxílico, da classe dos acetatos, que inibe de forma não seletiva a cicloxigenase 1 e 2. Terapeuticamente, é utilizado como agente analgésico e antiinflamatório para o tratamento de sintomas da artrite reumatóide aguda e crônica, osteoartrite e espondilite anquilosante, no entanto, seu uso não está restringido somente a estas patologias, pois apresenta atividade quimiopreventiva, sendo atualmente também utilizado para este fim, apesar de inúmeros relatos de toxicidade gastrointestinal e hepática terem sido relatados na literatura. Ele é ingerido como um pró-fármaco, e por reações de biotransformação hepática origina um metabólito reduzido (sulindaco sulfeto, ativo farmacologicamente) e outro oxidado (sulindaco sulfona, inativo). Para avaliar os efeitos do sulindaco e seus metabólitos, foram realizados estudos in vitro em mitocôndrias isoladas de fígado de rato, para explorar aspectos mecanísticos de toxicidade mitocondrial, e ensaios com linhagem celular de hepatoma humano HepG2, para avaliar seus efeitos após metabolização, uma vez que estas células mantém enzimas responsáveis pelas reações de biotransformação de fase I e II. Nossos resultados demonstram que o sulindaco sulfeto estimula a respiração de estado 4 e promove a liberação de cálcio pré-acumulado pela organela de maneira concentração-dependente, sendo evidente o efeito desacoplador sobre a fosforilação oxidativa, refletidos na diminuição da viabilidade celular em associação com a diminuição do conteúdo de ATP, provocado pela dissipação do potencial de membrana mitocondrial, sugerindo um mecanismo protonoforético de desacoplamento, responsável pela toxicidade deste antiinflamatório. Além disso, foi observado o inchamento das mitocôndrias em meio energizado, condição que ocorre independente de cálcio presente no meio reacional. Este evento foi parcialmente sensível a ciclosporina A e Mg2+, teve prevenção total com a adição de BHT e insensibilidade a outros moduladores, como ADP, ATP, DTT e NEM. Os resultados não condizem com a transição de permeabilidade mitocondrial clássica, uma vez que é dependente de cálcio, e o mecanismo de prevenção deste efeito obtida com a adição de BHT é desconhecido, pois não foi observada a indução de formação de radicais livres nos dois modelos experimentais utilizados. No entanto, a indução de intumescimento mitocondrial pode contribuir para seus efeitos tóxicos. O sulindaco e o sulindaco sulfona não apresentaram quaisquer efeitos descritos para o sulindaco sulfeto, indicando que somente o metabólito farmacologicamente ativo é responsável pelos efeitos tóxicos observados. A biotransformação por reações de Fase I e II podem contribuir para a toxicidade in vivo, por originarem o metabólito reduzido, e como o sulindaco é utilizado em terapias que envolvem uso por tempo prolongado, é prudente realizar um monitoramento da função hepática antes e durante o período de tratamento, no sentido de prevenir complicações do uso na terapia convencional / Sulindac is a nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID) known to inhibit non-selectively ciclooxygenases (COX) 1 and 2. Sulindac is therapeutically used as anti-inflammatory and analgesic in the symptomatic treatment of acute and chronic rheumatoid arthritis, osteoarthritis, and ankylosing spondylits. In addition to this property, a role in the prevention/regression of colonic carcinogenesis, has been described for both sulindac and metabolites. Nevertheless, its therapeutic use has been limited because of its toxicity to the gastrointestinal tract and liver, reported in the literature. Sulindac is a prodrug that is ?in vivo? metabolized to its pharmacological active metabolite, sulindac sulfide and its pharmacological inactive one, sulindac sulfone. In order to assess the effects of sulindac and its metabolites, we used ?in vitro? studies with isolated rat liver mitochondria, to evaluate the aspects of its toxicity in mitochondria; and studies with human hepatoma cell line (HepG2), to evaluate its affects after biotransformation. The present study shows that sulindac sulfide, but not sulindac sulfone or sulindac itself, cause mitochondrial uncoupling, releasing pre-accumulated Ca2+ from the organelle, and decrease Hep-G2 cell viability in an apparent association with cellular ATP depletion resulted from mitochondrial uncoupling-associated membrane potential dissipation. We therefore propose mitochondrial uncoupling by sulindac sulfide as a potential mechanism for the well established toxicity of sulindac, at least to the liver in humans. It was also observed a mitochondrial swelling in energized media that can occur without dependence on the calcium present in the media. This event was partial inhibited by CsA and Mg2+, and completely inhibited with the addition of BHT. It did not show any inhibition with the addition of ADP, ATP, DTT or NEM. These results can not be associated to the classical mitochondrial permeability transition that is dependent to calcium, and the mechanism of inhibition observed with BHT is not known, since it was not observed any production of free radicals in our models, but the swelling observed can also contribute to the toxic effects observed. The sulindac itself and the sulfone metabolite did not show any toxic effect observed for the sulfide form, indicating that just the pharmacological active metabolite is responsible for the toxic effects. The biotransformation (phase I and II reactions) can contribute to sulindac toxicity, because they generate the reduced form. Sulindac is also used in long term treatment, so it is necessary the monitoring of the hepatic function is necessary before and during the treatment, in order to prevent any further complication.

Orientadores: Anibal Eugênio Vercesi, Helena Coutinho Franco de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Aplicadas / Made available in DSpace on 2018-08-24T17:38:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_Audreyde_M.pdf: 2287376 bytes, checksum: 667ac52246453deec2cd72f05541e70c (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital quando liberada / Abstract: Note: The complete abstract is available with the full electronic document / Mestrado / Fisiopatologia Médica / Mestra em Ciências

Orientadores: Anibal Eugenio Vercesi, Nadja Cristhina de Souza Pinto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T03:45:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ravagnani_FelipeGustavo_D.pdf: 7335132 bytes, checksum: 7043cdada57a4c0242520d7fcb95daeb (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O número de indivíduos que sofrem com patologias associadas ao consumo abusivo de etanol tem aumentado significativamente no último século. Como consequência desse fato, os custos associados ao tratamento do alcoolismo, bem como das doenças associadas a ele também têm aumentado, onerando o sistema de saúde e se tornando um problema de saúde pública de grande relevância atualmente. Os mecanismos moleculares que desencadeiam muitas dessas doenças não estão completamente esclarecidos. O tecido hepático é o mais afetado pelo etanol e as mitocôndrias têm sido apontadas como alvos cruciais na toxicidade hepática induzida pelo álcool. Logo, o objetivo desse trabalho foi investigar como o consumo de etanol afeta o estado redox e o metabolismo mitocondriais no fígado. Ratos Wistar machos adultos jovens e de meia-idade receberam ad libitum solução alcoólica 25% (v/v) como única fonte de líquido. Os grupos controle receberam somente água. Ambos os grupos receberam ração ad libitum. Mitocôndrias hepáticas foram isoladas usando técnicas padrão. O consumo de ração e de líquidos foi significativamente menor em animais que ingeriram álcool, resultando em menor ganho de massa corpórea nos protocolos utilizados. As mitocôndrias dos animais que consumiram etanol apresentaram menores níveis de respiração em condição basal e quando energizadas com substratos respiratórios. A atividade e os níveis protéicos de citocromo c oxidase foi menor nos grupos tratados com etanol. Independente da duração do período de tratamento, mitocôndrias hepáticas de animais que ingeriram álcool foram menos susceptíveis à transição de permeabilidade mitocondrial induzida por cálcio, quando comparadas às mitocôndrias dos animais do grupo controle. Esse efeito foi revertido pela adição de oxidantes de nucleotídeos de piridina (acetoacetato, diamida ou tert butil-hidroperóxido) ou em mitocôndrias desacopladas. Também houve aumento em nucleotídeos de piridina na forma reduzida e aumento na razão NAD(P)H/NAD(P)+ em mitôndrias hepáticas de ratos consumidores de etanol. Em concordância a esses dados, houve aumento na capacidade de retenção de cálcio, processo que é dependente do estado redox intramitocondrial. Por outro lado, não houve diferença na produção de espécies reativas de oxigênio entre os grupos controle e tratados com álcool. A atividade de glutationa peroxidase e as quantidades de GSH e de GSSG também não sofreram alterações. Entretanto, houve redução nos níveis de DNA mitocondrial nos tratamentos agudos, porém com tendência para retornar aos níveis normais nos tratamentos crônicos, indicando uma resposta adaptativa à injúria induzida pelo etanol. Em conjunto, nossos resultados indicam que o consumo de etanol modula o estado redox mitocondrial e de sistemas antioxidantes, prevenindo a abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial. A presença desse xenobiótico no fígado também altera significativamente os níveis de NADP reduzido, agente redutor final para o sistema glutationa redutase/peroxidase que detoxifica H2O2 na matriz mitocondrial. Além disso, a resposta adaptativa ao álcool observada no DNA mitocondrial pode contribuir para compreender melhor os mecanismos envolvidos no reparo de lesões a biomoléculas e os estágios iniciais de adaptação a esse xenobiótico, etapas que precedem a morte celular, hepatite alcoólica ou carcinogênese em tecido hepático exposto cronicamente ao etanol / Abstract: The number of people suffering from alcoholism has increased significantly over the last century. As a result, costs associated with treating the addiction itself as well as the associated pathologies have also increased, such that this is considered as public health issue. Furthermore, the molecular events leading to several of these diseases are not yet clearly understood. Hepatic tissue is the most affected by alcohol, and mitochondria have been suggested to be a crucial target in alcohol-induced liver toxicity. Thus, the aim of our study was to investigate how ethanol consumption affects the redox state and mitochondrial metabolism in the liver. Young adult and middle-aged male Wistar rats were given a 25 % (v/v) ethanol solution as the only source of drinking water. Control groups received water only. Liver mitochondria were isolated using standard techniques. Food and water intake was significantly lower in alcohol-drinking rats, resulting in lower weight gain during the treatment regimes. Mitochondria from the alcohol-drinking group had lower respiration under levels in basal condition, when energized by substrates feeding electrons into complexes I and IV. Cytochrome c oxidase activity and protein levels were lower in the alcohol group as well. Additionally, regardless of the length of the treatment, liver mitochondria from the alcohol-treated animals were more resistant to Ca2+-induced mitochondrial permeability transition (MPT), when compared to mitochondria from control animals. This effect was abrogated by oxidizing agents of pyridine nucleotides (acetoacetate, diamide or tert butylhydroperoxide) or in uncoupled mitochondria. We also found that liver mitochondria from the alcohol-drinking rats had a more reduced pyridine nucleotide pool and higher NAD(P)H/NAD(P)+ ratios. In addition, Nampt (an enzyme of the NAD+ synthetic pathway) protein levels did not differ after alcohol consumption. Accordingly, the calcium retention capacity of the isolated mitochondria, which is dependent upon intramitochondrial redox state, was higher in the alcohol group. On the other hand, levels of reactive oxygen species showed no differences between the control and alcohol groups, both in mitochondria and in splenic lymphocytes. Glutathione peroxidase activity and the amounts of GSH and GSSG were also not changed. However, mitochondrial DNA levels were decreased in the short term treatments, but tended to go back up to normal levels in the chronic treatments, indicating an adaptative response to ethanol-induced injury. Together, our results indicate that ethanol consumption modulates the mitochondrial redox state and the antioxidant systems, protecting against Ca2+-induced mitochondrial pore transition permeability opening. The presence of this xenobiotic can significantly change the levels of reduced NADP, the ultimate reducing agent in the gluthatione reductase/peroxidase system that detoxifies H2O2 in the mitochondrial matrix. In addition, the adaptative response to ethanol, seen in mitochondrial DNA, may contribute to further understand the mechanisms related to lesions in biomolecules and the initial steps that preceed cell death, alcoholic hepatitis or carcinogenic process in hepatic tissue exposed chronically to ethanol / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientadores: Tiago Rezende Figueira, Roger Frigério Castilho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-27T03:45:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Chweih_Hanan_M.pdf: 1684363 bytes, checksum: edae156378f90e7315bca30c16544071 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Algumas das características das mitocôndrias, incluindo as suas funções de transporte de Ca2+, podem apresentar dimorfismo sexual e especificidades teciduais. No entanto, as mensurações do transporte de Ca2+ em mitocôndrias isoladas estão sujeitas a artefatos secundários a abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (PTP) induzido pelo acúmulo excessivo de Ca2+ nesta organela. Neste estudo, o objetivo inicial foi avaliar se a inibição do PTP pela ciclosporina A (CsA) afeta a mensuração de diversas variáveis que descrevem o transporte de Ca2+por mitocôndrias isoladas de fígado de rato. Os resultados obtidos indicam que as concentrações de estado estável do Ca2+ externo a mitocôndria e as taxas deefluxo mitocondrial de Ca2+através de trocadores seletivos foram superestimados em até 4 vezes quando o PTP não foi inibido farmacologicamente pela CsA. O objetivo subsequente foi analisar o transporte de Ca2+ em mitocôndrias isoladas de fígado, de músculo esquelético, de coração e de cérebro de ratos machos e fêmeas sob condições experimentais específicas (i.e. meio de incubação contendo inibidores TPM, substratos energéticos ligados a NAD e níveis relevantes de Ca2+, Mg2+e Na+). Os dados indicaram que a taxa de influxo de Ca2+em mitocôndrias de fígado foi ~4 vezes superior a dos outros tecidos, as quais foram semelhantes entre si. Em contrapartida, as taxas de efluxo de Ca2+ apresentaram uma maior diversidade entre tecidos, especialmente na presença de Na+. Curiosamente, o efluxo de Ca2+na ausência de Na+foi significativamente mais elevado nas mitocôndrias cardíacas (~4nmol/mg/min) em relação às taxas observadas nos outros tecidos, contrariando a concepção de que o efluxo de Ca2+de mitocôndrias de coração é dependente, quase que exclusivamente, de um trocador que requer Na+. A especificidade em relação ao sexo só foi observada em dois índices relacionados a homeostase mitocondrial de Ca2+(i.e. cinética geral normalizada da captação de Ca2+ e a concentração de estado estável do Ca2+ externo a mitocôndria) em mitocôndrias isoladas de coração (mais lentos ou maiores na fêmea) e na respiração estimulada por ADP em mitocôndrias de fígado (~20% maior na fêmea). O presente estudo demonstrou a importância metodológica de se prevenir a abertura do PTP para a análise das propriedades e da variabilidade fisiológica do transporte de Ca2+por mitocôndrias isoladas. Adicionalmente, concluímos que sob as condições experimentais aqui utilizadas, o efluxo de Ca2+ mitocondrial apresenta grandes especificidades teciduais e que alguns achados desafiam conceitos estabelecidos em estudos anteriores sob condições arguivelmente menos controladas / Abstract: The characteristics of mitochondria, including their Ca2+ transport functions, may exhibit tissue specificity and sex dimorphism. Because the measurements of the Ca2+ handling by isolated mitochondria may be biased by dysfunction secondary to Ca2+-induced mitochondrial permeability transition (MPT) pore opening, this study evaluates the extent to which MPT inhibition by cyclosporine-A affects the measurement of Ca2+ transport in isolated rat liver mitochondria. The results indicate that the steady-state levels of external Ca2+ and the rates of mitochondrial Ca2+ efflux through the selective pathways can be overestimated by up to 4-fold if MPT pore opening is not prevented. Then, we analyzed the Ca2+ transport in isolated mitochondria from the liver, skeletal muscle, heart and brain of male and female rats under incubation conditions containing MPT inhibitors, NAD-linked substrates and relevant levels of free Ca2+, Mg2+ and Na+. Except for the liver mitochondria displaying values4-fold higher, the Ca2+ influx rates were similar among the other tissues. In contrast, the Ca2+ efflux rates exhibited more tissue diversity, especially in the presence of Na+. Interestingly, the Na+-independent Ca2+ efflux was highest in the heart mitochondria (~4 nmol/mg/min), thus challenging the view that heart mitochondrial Ca2+ efflux relies almost exclusively on a Na+-dependent pathway. Sex specificity was only observed in two kinetic indexes (i.e. the normalized overall kinetics of Ca2+ uptake and the steady-state levels of external Ca2+) of heart mitochondrial Ca2+ homeostasis (slower or higher in female)and in the ADP-stimulated respiration of liver mitochondria (~20% higher in females). The present study shows the methodological importance of preventing MPT when measuring the properties and the physiological variability of the Ca2+ handling by isolated mitochondria. Moreover, we conclude that mitochondrial Ca2+ efflux exhibits great tissue specificity under our conditions, which may challenge some concepts raised in previous studies that employed experimental conditions that are arguably not well controlled / Mestrado / Fisiopatologia Médica / Mestra em Ciências