A astaxantina (AST) é um carotenóide derivado do β-caroteno produzido por algas e cianobactérias, mas que também pode ser encontrada em animais marinhos. Em animais, é reportada como interceptadora de radicais de oxigênio mais eficiente que o β-caroteno. O objetivo central dessa dissertação foi avaliar a capacidade antioxidante da AST em lipossomos enriquecidos com citocromo c (cit c) desafiados com 3-morfolinosidnonimina (SIN-1), um doador de óxido nítrico, em diferentes microambientes (pH e composição das vesículas). Diferenças na interação destas vesículas com o cit c periférico, com reflexos na atividade antioxidante da AST também foram avaliadas. O SIN-1 gera, por termólise, quantidades equimolares de radical superóxido e óxido nítrico, quando há oxigênio no meio. Vesículas unilamelares de fosfatidilcolina (PC), PC contendo 5% ou 10% de fosfatidilglicerol (PG), com ou sem AST, foram incubadas com SIN-1 e/ou cit c. Medidas do índice de lipoperoxidação pelo teste das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) revelaram que SIN-1 não causa aumento de TBARS, enquanto o cit c foi capaz de aumentar significativamente este índice. Este fato pode ser explicado pela atividade peroxidásica do cit c. Apenas em vesículas de PCPG10%, ao realizar a incubação do cit c concomitantemente com SIN-1, o índice de TBARS foi maior ao observado em vesículas incubadas apenas com cit c. É conhecido que a interação entre cit c e membranas aniônicas pode alterar a conformação da proteína, aumentando sua atividade peroxidásica. A presença da AST fez com que os índices de lipoperoxidação chegassem a valores próximos aos do controle. A alteração no pH do meio revelou que a AST possui ação antioxidante mais pronunciada em pHs 7,4 e 8,0, em comparação com pHs levemente ácidos. A presença de PG evidenciou ainda mais esta tendência e em pH 6,2, a AST apresentou inclusive pequena atividade próoxidante. Estes resultados podem ser discutidos à luz de alterações da permeabilidade da membrana e da reatividade de espécies reativas induzidas por mudanças da fluidez e de pH. O efeito dos produtos gerados por SIN-1 sobre o cit c foi estudado em condições de normóxia e hipóxia. Resultados de EPR e de fluorescência demonstram que a presença do radical superóxido previne lesões oxidativas causada por peróxido orgânico (t-butOOH) tanto no cit c quanto nas membranas, pois é capaz de reduzir o ferro hemínico do cit c. Através de CD e espectrofotometria UV-Vis e EPR, foi observado que a incubação com SIN-1 promove alterações estruturais no cit c causando ruptura na sexta coordenação do ferro hemínico, levando à geração de uma espécie de cit c com rombicidade menor em comparação ao cit c nativo e que apresenta maior atividade peroxidásica. Este trabalho contribui com informações para entendimento do mecanismo antioxidante da AST em diferentes microambientes, além de demonstrar o efeito paradoxal do superóxido que é capaz de proteger o cit c, através da redução do ferro hemínico, mas também pode expor a proteína à oxidação promovida por peroxinitrito. / Astaxanthin (AST) is a β-carotene derived carotenoid, produced by algae and cyanobacteria, but can also be found in marine animals. In phytoplankton it has the function to absorb light radiation for photosinthesys occurence. In animals AST acts as a scavenger of oxygen free radicals, even more efficiently than β-carotene itself. The main objective of this work is to evaluate the antioxidant capacity of AST over cytochrome c (cyt c) incorporated in liposomes and challenged with 3-morpholinosidnonimine (SIN-1), a nitric oxide donor, under different experimental conditions, namely vesicles composition and pH. Distinct interactions between cyt c and vesicles affecting the AST antioxidant activity were also evaluated. SIN-1 spontaneously generates equal amount of nitric oxide and superoxide anion when oxygen is present. Unilamellar vesicles made from phosphatidylcholine (PC) or PC with 5% or 10% of phosphatidylglycerol (PG), with or without AST, were incubated with SIN-1 and/or cyt c. The extent of lipid peroxidation was evaluated by the classical method of thiobarbituric reactive substances (TBARS). Control experiments with SIN-1 alone showed no increase in TBARS content, whereas cyt c significantly increased TBARS. Concomitant addition of cyt c, SIN-1 to PCPG10% vesicles led to lipid peroxidation indices even higher than those found when cyt c was incubated with PCPG10% vesicles. A peroxidase activity of cyt c resulting from the interaction between this protein and anionic membranes can explain this result. In this system, the presence of AST inhibited formation of TBARS, whose levels were near the control values. Astaxanthin was found to exhibit a more effective antioxidant capacity under basic pH (7.4 and 8.0), in comparison with pH 6.2 and 6.8. In the presence of PG, this trend became more evident. Interestingly, at pH 6.2, AST showed a slight pro-oxidant activity. These results can be explained by differences in membrane permeability and reactivity of reactive species, caused by pH and membrane fluidity alterations. The effects of products of SIN-1 decomposition on cyt c structure and its peroxidase activity were investigated under hypoxia and normoxia. EPR and fluorescence experiments revealed that superoxide anion radical, due to its ability to reduce heme iron, prevents oxidative damage of cyt c and membrane lipids by peroxide-derived free radicals. By means of CD and UV-Visible spectroscopy, we have found that concomitant incubation of SIN-1 and cyt c promoted structural alterations in the protein which changes the irons sixth axial coordination, leading to generation of a less rhombic cyt c, which is reportedly a better peroxidase than native cyt c. This work contributes with information aiming to better understand the antioxidant mechanism of AST under different membrane microenvironments and unveil a paradoxal effect of superoxide ion, which can protect cyt c from oxidative lesions by transferring electron to ferricyt c, but can also expose cyt c to oxidation by peroxynitrite.

Complexos diimínicos de cobre(II) têm despertado grande interesse como modelos estruturais e funcionais do sítio ativo de diversas proteínas e enzimas dependentes deste metal, particularmente aquelas relacionadas ao oxigênio molecular e seus derivados reduzidos. Embora sejam bons miméticos da SOD, uma enzima antioxidante, estes compostos também podem apresentar atividade peroxidásica considerável, causando danos oxidativos a diversos substratos. Neste trabalho, 3 novos complexos diimínicos de cobre(II), derivados de 2,3-butanodiona e 2-(2-aminofenil)benzimidazol, 2-(aminometil)benzimidazol ou 2-(2-aminoetil)piridina, foram sintetizados e posteriormente caracterizados através de análise elementar, medidas magnéticas e espectroscopia UV/Vis, IR e EPR, com a finalidade de verificar como modificações no ligante podem modular suas propriedades, especialmente frente a oxidantes biológicos, como peróxido de hidrogênio e peroxinitrito. Estes novos complexos preparados tiveram ainda suas propriedades comparadas às de espécies semelhantes, derivadas de piridinaldeído e etilenodiamina ou acetilpirazina e propilenodiamina, estudadas anteriormente. As propriedades antioxidantes dos complexos foram estimadas através da atividade catalítica acentuada na dismutação de radicais superóxidos, em comparação a complexos similares descritos na literatura, indicando que estas espécies são bons miméticos da SOD. Evidências da distorção tetraédrica ao redor do íon cobre, similar à observada na enzima nativa, foram obtidas através de parâmetros espectroscópicos característicos. Os novos complexos também mostraram atividade pró-oxidante, gerando radicais hidroxil em quantidades apreciáveis, em presença de peróxido de hidrogênio, detectados e identificados por EPR com a adição de captador de spin. Danos oxidativos promovidos por estas espécies complexas foram observados através da peroxidação lipídica de lipossomos de fosfatidilcolina de lecitina. Estes danos foram expressivamente aumentados em presença de íons nitrito e/ou bicarbonato. Sua atividade catalítica na decomposição do peroxinitrito, em presença e ausência de dióxido de carbono, bem como na nitração do 4-hidroxifenilacetato, mediada por peroxinitrito, foi também estudada através de medidas de cinética rápida (stopped-flow). Evidências de intermediários de reação foram obtidas através de mudanças significativas no espectro EPR. As propriedades eletroquímicas e a estabilidade termodinâmica relativa dessas espécies, estimada pela técnica de dicroismo circular, usando a albumina bovina como quelante fisiológico, foram também verificadas. Todos os estudos relatados foram desenvolvidos para melhor correlacionar a reatividade observada com determinadas características estruturais dos complexos de cobre preparados. / Many investigations on diimine copper(II) complexes have been carried out in order to mimic functional and structural properties of the active sites in proteins and enzymes dependent on this metal. Special interest has been focused on their reactivity toward molecular oxygen and its reduced derivatives, and more recently toward peroxynitrite. These diimine copper(II) complexes exhibited SOD-like activities, but have also shown considerable peroxidase activity, causing oxidative damage to different targets. In this work, some new diimine copper(II) complexes were prepared, derived from 2,3-butanedione and 2-(2-aminophenyl)benzimidazole, 2-(aminomethyl) benzimidazole or 2-(2-aminoethyl)pyridine, and characterized using UV/Vis, IR and EPR spectroscopy, elemental analysis and determination of the effective magnetic moment. Those complexes have also been compared to similar species, derived from pyridinaldehyde and ethylenediamine, or acetylpyrazine and propylenediamine, previously prepared. The studied complexes showed significant SOD activity, indicative of antioxidant properties, and a pronounced tetrahedral distortion around the copper ion, estimated by characteristic spectroscopic parameters. On the other hand, the new compounds also exhibited pro-oxidant activities, by generating hydroxyl radicals in the presence of hydrogen peroxide, detected by the spin-trapping EPR method. The extension of lipid peroxidation promoted by these diimine copper(II) complexes was also investigated, using liposomes of lecithin L-α-phosphatidylcholine as membrane mimics. An enhancement of their peroxidase activity in the presence of bicarbonate and/or nitrite anion was also observed. Further, the decomposition of peroxynitrite, in the presence and absence of carbon dioxide, and the peroxynitrite-mediated nitration of 4-hydroxyphenylacetate, catalyzed by these copper compounds, was measured by stopped-flow kinetic runs. Evidence of intermediary species was provided by significant changes in the EPR spectra. Finally, their electrochemical properties were estimated by cyclic voltammetry and their relative thermodynamic stability was verified through the technique of circular dicroism, using a competitive reaction with albumin, a physiological Cu(II) chelator. All those studies were performed at the aim of correlating some structural characteristics to the observed reactivity of the diimine copper(II) complexes.

Complexos diimínicos de cobre(II) têm despertado grande interesse como modelos estruturais e funcionais do sítio ativo de diversas proteínas e enzimas dependentes deste metal, particularmente aquelas relacionadas ao oxigênio molecular e seus derivados reduzidos. Embora sejam bons miméticos da SOD, uma enzima antioxidante, estes compostos também podem apresentar atividade peroxidásica considerável, causando danos oxidativos a diversos substratos. Neste trabalho, 3 novos complexos diimínicos de cobre(II), derivados de 2,3-butanodiona e 2-(2-aminofenil)benzimidazol, 2-(aminometil)benzimidazol ou 2-(2-aminoetil)piridina, foram sintetizados e posteriormente caracterizados através de análise elementar, medidas magnéticas e espectroscopia UV/Vis, IR e EPR, com a finalidade de verificar como modificações no ligante podem modular suas propriedades, especialmente frente a oxidantes biológicos, como peróxido de hidrogênio e peroxinitrito. Estes novos complexos preparados tiveram ainda suas propriedades comparadas às de espécies semelhantes, derivadas de piridinaldeído e etilenodiamina ou acetilpirazina e propilenodiamina, estudadas anteriormente. As propriedades antioxidantes dos complexos foram estimadas através da atividade catalítica acentuada na dismutação de radicais superóxidos, em comparação a complexos similares descritos na literatura, indicando que estas espécies são bons miméticos da SOD. Evidências da distorção tetraédrica ao redor do íon cobre, similar à observada na enzima nativa, foram obtidas através de parâmetros espectroscópicos característicos. Os novos complexos também mostraram atividade pró-oxidante, gerando radicais hidroxil em quantidades apreciáveis, em presença de peróxido de hidrogênio, detectados e identificados por EPR com a adição de captador de spin. Danos oxidativos promovidos por estas espécies complexas foram observados através da peroxidação lipídica de lipossomos de fosfatidilcolina de lecitina. Estes danos foram expressivamente aumentados em presença de íons nitrito e/ou bicarbonato. Sua atividade catalítica na decomposição do peroxinitrito, em presença e ausência de dióxido de carbono, bem como na nitração do 4-hidroxifenilacetato, mediada por peroxinitrito, foi também estudada através de medidas de cinética rápida (stopped-flow). Evidências de intermediários de reação foram obtidas através de mudanças significativas no espectro EPR. As propriedades eletroquímicas e a estabilidade termodinâmica relativa dessas espécies, estimada pela técnica de dicroismo circular, usando a albumina bovina como quelante fisiológico, foram também verificadas. Todos os estudos relatados foram desenvolvidos para melhor correlacionar a reatividade observada com determinadas características estruturais dos complexos de cobre preparados. / Many investigations on diimine copper(II) complexes have been carried out in order to mimic functional and structural properties of the active sites in proteins and enzymes dependent on this metal. Special interest has been focused on their reactivity toward molecular oxygen and its reduced derivatives, and more recently toward peroxynitrite. These diimine copper(II) complexes exhibited SOD-like activities, but have also shown considerable peroxidase activity, causing oxidative damage to different targets. In this work, some new diimine copper(II) complexes were prepared, derived from 2,3-butanedione and 2-(2-aminophenyl)benzimidazole, 2-(aminomethyl) benzimidazole or 2-(2-aminoethyl)pyridine, and characterized using UV/Vis, IR and EPR spectroscopy, elemental analysis and determination of the effective magnetic moment. Those complexes have also been compared to similar species, derived from pyridinaldehyde and ethylenediamine, or acetylpyrazine and propylenediamine, previously prepared. The studied complexes showed significant SOD activity, indicative of antioxidant properties, and a pronounced tetrahedral distortion around the copper ion, estimated by characteristic spectroscopic parameters. On the other hand, the new compounds also exhibited pro-oxidant activities, by generating hydroxyl radicals in the presence of hydrogen peroxide, detected by the spin-trapping EPR method. The extension of lipid peroxidation promoted by these diimine copper(II) complexes was also investigated, using liposomes of lecithin L-α-phosphatidylcholine as membrane mimics. An enhancement of their peroxidase activity in the presence of bicarbonate and/or nitrite anion was also observed. Further, the decomposition of peroxynitrite, in the presence and absence of carbon dioxide, and the peroxynitrite-mediated nitration of 4-hydroxyphenylacetate, catalyzed by these copper compounds, was measured by stopped-flow kinetic runs. Evidence of intermediary species was provided by significant changes in the EPR spectra. Finally, their electrochemical properties were estimated by cyclic voltammetry and their relative thermodynamic stability was verified through the technique of circular dicroism, using a competitive reaction with albumin, a physiological Cu(II) chelator. All those studies were performed at the aim of correlating some structural characteristics to the observed reactivity of the diimine copper(II) complexes.