Le sélénium est un élément trace connu pour son caractère essentiel au développement de nombreux organismes vivants mais également pour ses effets bénéfiques sur la santé humaine. Les recherches effectuées ces cinq dernières années ont renforcé l'idée que ces propriétés seraient dues à la synthèse de sélénoprotéines chez les êtres vivants. Les méthodes classiques d'analyse protéomique ne sont pas adaptées à l'identification ciblée de ces sélénoprotéines très minoritaires. Les travaux de cette thèse ont consisté à développer des méthodes complémentaires plus spécifiques et sensibles en vue de leur détection et de leur identification. Un étalon protéique sélénié stable a été produit pour développer ces méthodes. Le couplage de l'ablation laser et de la spectrométrie de masse couplée à un plasma induit (LA-ICP-MS) a été mis en oeuvre pour la détection des sélénoprotéines après une séparation par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE). Le dispositif d'ablation laser conventionnel a ici été amélioré avec un laser femtoseconde à balayage très rapide permettant une détection plus sensible des sélénoprotéines dans les échantillons biologiques. Une fois détectées, les sélénoprotéines ont été identifiées en spectrométrie de masse moléculaire. Pour cela les sélénopeptides issus de la digestion enzymatique des sélénoprotéines sont d'abord repérés en nanochromatographie couplée à l'ICP-MS puis séquencés en nanochromatographie couplée à la spectrométrie de masse en tandem à ionisation électrospray (nanoHPLC-ESI-MS/MS). La procédure en LA-ICP-MS développée a notamment permis la détection de nouvelles sélénoprotéines chez la bactérie Desulfococcus multivorans. La procédure d'identification a été validée sur deux sélénoprotéines purifiées thiorédoxine réductase et glutathione peroxydase carboxyméthylée. La méthodologie développée contribuera à l'identification de nouvelles sélénoprotéines pour une meilleure compréhension des rôles physiologiques de ces molécules chez de nombreux êtres vivants.