Fotossensibilizadores são moléculas capazes de interagir com a luz de modo a gerar espécies altamente reativas de oxigênio como o oxigênio singlete e outras formas radicalares. Esta propriedade pode ser utilizada para o tratamento de câncer, remoção de contaminantes ambientais, inativação de agentes patogênicos no sangue e hemoderivados, bem como na esterilização alimentos. A técnica que utiliza o efeito fotodinâmico para o tratamento de câncer recebe o de nome Terapia Fotodinâmica (do termo em inglês: Photodynamic Therapy - PDT).Photofrin®, Photogem® e Photosan® são fármacos de primeira geração, derivados da hematoporfirina, que constituem o principal grupo de medicamentos com aplicação clínica em PDT. Photodithazine® é um fármaco de 2ª geração, derivado de clorina-e-6, que encontra-se em fase de testes clínicos e apresenta resultados promissores como fotossensibilizador (FS). Este trabalho tem o objetivo de investigar a eficiência fotodinâmica destes fármacos através de experimentos que envolvem a utilização da albumina de soro bovino (BSA) e o ácido úrico (AU) como dosímetros químicos; eritrócitos como modelo de membrana celular e a determinação do coeficiente de partição (P ou Log P) para se investigar lipofilicidade e a interação dos FS com as membranas celulares. Soluções contendo BSA e FS, preparadas em tampão fosfato, foram iluminadas com LED (630nm) e o decréscimo na fluorescência do BSA em 340nm foi utilizado para se calcular constante da velocidade de fotoxidação (kC, min-1). No teste do AU, a mistura AU e FS foi iluminada com LED e o coeficiente de atividade fotodinâmica (AF, m2.J-1) foi determinado através do decréscimo da banda do AU em 293nm. Os resultados convergem para a seguinte ordem de eficiência fotodinâmica: Photodithazine® >> Photogem® > Photofrin® > Photosan®, baseada nos valores de kC (14,8±0,3); (9,8±0,5); (3,2±0,7) e (2,9±0,5)min-1 e AF (64±14), (37±9), (9±2) e (4±1)m2J-1, respectivamente. Com objetivo de determinar o tempo necessário para causar 50% de hemólise (t50), amostras de eritrócitos (hematócrito=2%) foram irradiadas por 10 minutos e o dano causado à membrana pelo efeito fotodinâmico foi monitorado através da variação na absorbância característica da oxihemoglobina em 540 e 577nm. O mecanismo preferencial envolvido na fotoxidação da membrana celular foi investigado por meio de experimentos que avaliaram a influência de água deuterada, azida de sódio e manitol na velocidade de fotoxidação dos eritrócitos. Os resultados dos experimentos de hemólise apontam para a seguinte ordem de eficiência fotodinâmica: Photodithazine® >> Photofrin® > Photogem® > Photosan®, baseada nos valores de t50 : (1,2±0,3), (3,4±0,1), (3,8±0,2), (5,2±0,1)min e logP (0,21); (0,15); (0,11); (-0,21); respectivamente. A hemólise com Photogem® em meio deuterado foi cerca de 25% mais rápida e a presença de azida de sódio causou diminuição na hemólise, expressa pela diminuição dos valores de porcentagem máxima de hemólise (%HMÁX) e aumento nos valores de t50.. A presença de manitol nos ensaios de hemólise não apresentou influência nos valores de t50 e %HMÁX, indicando que a hemólise não ocorre via mecanismo radicalar, mas aponta para o mecanismo do tipo II, via oxigênio singlete, como sendo o mecanismo predominante na fotoxidação da membrana plasmática dos eritrócitos pelos fotossensibilizadores estudados. As diferenças encontradas entre os fármacos HpD são atribuídas as suas diferentes constituições, uma vez que tratam-se de misturas de monômeros, dímeros e oligomeros em diferentes frações. Experimentos realizados em solução homogênea, tais como os experimentos de fotoxidação de BSA e o teste do ácido úrico, fornecem importantes informações a respeito da estrutura-atividade dos fármacos, mas negligenciam os efeitos de interação dos FS com o meio biológico. Em ambiente biológico, os FS participam de inúmeras interações adicionais, constituindo sistemas únicos, com diferentes propriedades fotofísicas e fotoquímicas. Estudos anteriores, realizados no nosso grupo de pesquisa, envolvendo a determinação da citotoxicidade destes FS em culturas de células normais e tumorais, bem como estudos de separação cromatográfica dos constituintes de fármacos HpD estão de acordo com os resultados apresentados neste trabalho. / Photodynamic Therapy (PDT) is a developing technology that has been used for cancer treatment and recognized to have a huge potential for microorganisms inactivation and detoxication. It is based on light irradiation of a photosensitizer (PS) in order to produce reactive oxygen species. Many kinds of compounds are known to have photosensitizing properties. Photofrin®, Photogem® and Photosan® consist of mixtures of monomers, dimmers, and oligomers from hematoporphyrin treated chemically being the most clinically used PS. Photodithazine® is a water soluble clorin-e6-derivative, a second-generation drug. The present work provides a comparative study between these PS, using bovine serum albumin (BSA) and uric acid (UA) as chemical dosimeters as well as human red blood cells (RBC) as a cell membrane model and octanol/phosphate buffer partition coefficient (logP) to access the lipophilicity of the compounds. BSA and PS solutions in phosphate buffer were illuminated with LED ( =630nm) and the decrease in the BSA fluorescence at 340nm was used to calculate the photoxidation rate constant (kC, min-1). In UA test, a mixture of UA and photosensitizer was illuminated with LED ( =630nm) and the photodynamic activity coefficient (PA, m2.J-1) was determined by the decrease in the 293nm absorbance of UA. The results from these methodologies suggest that the photodynamic efficiency order is: Photodithazine® > Photogem® > Photofrin® > Photosan®, based on PA values (64±14), (37±9), (9±2) and (4±1)m2J-1 and kC values (14.8±0.3); (9.8±0.5); (3.2±0.7) and (2.9±0.5)min-1, respectively. In order to determine the t50 (time for 50% of hemolysis) the samples of RBC (hematocrit=2,0%) were irradiated for 10min and the absorbance characteristic of oxyhemoglobin (540 e 577nm) released due to the damage and consequent membrane lysis by the action of the PS was obtained. The mechanism involved in the photoxidation of the membrane was also studied determining how sodium azide, deuterium oxide and manitol affect the t50 values. The hemolysis experiments and logP values suggest the following order: Photodithazine® > Photofrin® > Photogem® > Photosan®, based on t50 values (1.2±0.3), (3.4±0.1), (3.8±0.2), (5.2±0.1)min and logP (0.21); x (0.15); (0.11); (-0.21), respectively. The rate of the hemolysis is increased about 25% in the deuterium oxide presence, and decreased in the sodium azide presence. Moreover, the experiments performed in the manitol presence not show any diference on t50 values. These results showed that the preponderant mechanism in the photohemolisys is of the type II. The differences in the photoxidative action of the HpD should be due to the diverse content of monomers, dimmers and oligomers of the PS components. The results of hemolysis experiments suggest that these differences should result in singular interactions of HpD with the membrane constituents. Photofrin seems to be the more effective HpD concerning the hemolysis of erythrocytes and logP values. Therefore the results of all used methodologies suggest that clorin-e6-derivative seems to be a much more efficient PS, followed by the three HpD. Photooxidation experiments performed in simple solution provide valuable information on structure-activity relationships, but neglect the effects due to of membrane interactions; the PS molecule can bind with the membrane of RBC and this PS-RBC complex is a unique system with different photophysical and photochemical properties. These results have been confirmed in our group by cytotoxic studies with tumor and non-tumor cells as well as by chromatographic separation of the HpDs showing that the correlation between the parameters still holds.

A terapia fotodinâmica é uma técnica que vem sendo aprimorada para o tratamento de cânceres e infecções e seu efeito terapêutico consiste na geração de espécies reativas de oxigênio que causam danos irreversíveis às células, levando-as a morte. Ela é considerada menos invasiva que outros tratamentos, podendo ser repetida diversas vezes e utilizada em conjunto com outros tratamentos sem o comprometimento do paciente. Um dos focos da terapia fotodinâmica é o tratamento de cânceres de pele melanoma devido a localização superficial das lesões e a elevada taxa de letalidade que a doença ocasiona, esta alta taxa esta relacionada a formação de tumores secundários em outras regiões do corpo que dificulta a cura. Neste trabalho buscou-se entender a interação do fotossensibilizador de segunda geração, Photodithazine, com as células de melanoma murino de linhagem B16F10. Foram analisadas a captação celular e a co-localização intracelular deste fotossensibilizador através da marcação de componentes celulares em microscopia confocal. Ensaios de viabilidade celular foram realizados para obtenção das concentrações menos citotóxicas sem e com luz, utilizando o teste de MTT. Foi realizada a caracterização do tempo de vida médio fluorescência do fotossensibilzador durante a terapia fotodinâmica em microscópio FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy). Os resultados indicaram que um maior tempo de incubação no escuro causa maior citotoxicidade para as concentrações acima de 0,1 mg/mL de Photodithazine. Os ensaios de terapia fotodinâmica apresentaram redução de mais de 90% de viabilidade celular para baixas concentrações de Photodithazine®, utilizando fluências acima de 2J/cm2. O tempo de vida médio de fluorescência do Photodithazine livre em solução apresentou tempo de 3,75 ns e quando ligado às células de 4,63 ns, durante a terapia fotodinâmica o tempo de vida médio de fluorescência apresentou alteração de aproximadamente 0,2 ns. Através do cálculo de coeficientes de correlação, foi observado a alta co-localização em mitocôndrias. / Photodynamic therapy is a technique manly applied in the treatment of cancers and infections. The principal compound of this therapy is the reactive oxygen species generated that react and damage various cellular components, causing cell death. Photodynamic therapy is considered minimally invasive and can be repeated several times without compromising the patient. One of the main focuses of photodynamic therapy is threatment of melanoma skin cancer due to it is superficial location of the lesions and also because the disease has a high rate of mortality, caused by the formation of secondary tumors elsewhere in the body that makes it difficult to cure. In this study, murine melanoma cells were studied in monolayer model using Photodithazine, a photosensitizer of second generation. Cellular uptake and intracellular co-localization of the photosensitizer was observed by labeling cellular components that were analyzed by confocal microscopy. Cell viability assays were performed to obtain the cytotoxic concentrations in the dark, using the MTT test. Using the less cytotoxic concentrations, photodynamic therapy trials was performed to obtain the cytotoxic fluences. Finally, the average lifetime fluorescence of photosensitizer was measured to characterize the photodynamic therapy in FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy). The results indicated that longer dark incubation cause greater cytotoxicity at the concentrations above 0.1 mg/mL of Photodithazine. Thereby the results of photodynamic therapy experiments observed the decreasing from over 90% cell viability at low concentrations of Photodithazine using fluences above 2 J/cm2. The average fluorescence lifetime of the free Photodithazine solution was 3.75 ns and cell-bound 4.63 ns, during the photodynamic therapy the average lifetime fluorescence changed approximately 0.2 ns. By calculating correlation coefficients, the high colocalization was observed in mitochondria.

A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade de tratamento para o câncer baseado na interação da luz com um agente fotossensibilizador (FS) e o oxigênio molecular presente na célula alvo. A TFD apresenta vantagens sobre os métodos tradicionais de tratamentos como o dano seletivo às células neoplásicas, ausência de intervenção cirúrgica, possibilidade de repetição do procedimento e efeitos colaterais controlados. Uma das limitações da técnica é a profundidade de pouca penetração da luz no tecido biológico e consequentemente o volume tecidual tratado. Uma alternativa para superar esta limitação é o emprego de fonte de luz pulsada que comparativamente a irradiação com luz contínua (CW), apresenta maior potência de pico levando a uma maior profundidade de penetração e maior formação de espécies reativas de oxigênio. O objetivo deste trabalho é a avaliação da TFD utilizando fonte de luz pulsada no regime de femtossegundos através de ensaios in vitro da fotodegradação de dois tipos de FSs e da necrose induzida em fígado sadio de ratos (estudos in vivo). Nos estudos in vitro foram avaliadas a fotodegradação do Photogem (PG - 8μg/mL) e do Photodithazine (PDZ - 6μg/mL), para as irradiâncias de 280, 340 e 400 mW/cm2 com PG, e 15, 56 e 112 mW/cm2 para o PDZ. Nos estudos in vivo foram avaliados o perfil de necrose induzida com as fontes de luz CW e pulsado em modelo animal, que receberam PG e PDZ nas concentrações de 1,5 mg/kg e 1,0 mg/kg, respectivamente. Foram irradiados com 74 mW/cm2 (PG) e 102 mW/cm2(PDZ) e dose total de energia de 150 J/cm2. Posteriormente foi avaliada a dependência de profundidade de necrose com a irradiância (60, 80, 107, 127, 138, 188 e 229 mW/cm2) utilizando PG e com dose total entregue de 150 J/cm2. As fontes de luz empregadas foram um laser de diodo 630 nm (PG), um laser de diodo emitindo em 660 nm (PDZ) e um laser de Ti:Safira, taxa de repetição de 1 kHz, comprimento de onda 800 nm e largura de pulso de 75 fs em associação com amplificador paramétrico óptico (APO) para conversão de comprimentos de onda na região de 400 - 1150 nm. Os experimentos in vitro mostraram que taxa de fotodegradação para o PG foi maior utilizando o laser pulsado do que para o laser CW. Quando utilizado o PDZ, o laser CW promoveu uma taxa de fotodegradação maior do que o pulsado. Nos estudos in vivo, foi observada a necrose induzida com laser pulsado cerca de duas vezes mais profunda do que a induzida pelo laser CW, enquanto necrose induzida pelo laser pulsado com PDZ foi maior do que a do laser CW. No estudo da dependência da profundidade de necrose em função da irradiância, o laser pulsado induziu profundidade de necrose maior do que o laser CW para irradiâncias abaixo de 80 mW/cm2, acima desta irradiância, o laser CW e o pulsado não mostraram diferença significativa. Estes resultados mostram que a combinação da fonte de luz pulsada e PG podem ser consideradas como alternativa para aumentar o volume tecidual tratado, porém, devem-se observar os parâmetros empregados para se obter o maior volume tecidual tratado. O mesmo resultado não foi observado para o PDZ como fotossensibilizador, o que indica uma forte dependência dos mecanismos da TFD com o FS e o regime de iluminação empregado. / Photodynamic therapy (PDT) is a therapeutic modality for cancer based on light, a photosensitizer agent (PS) and molecular oxygen into the target cells. PDT has advantages over traditional treatments, such as, selective damage to tumor cells, absence of surgical intervention, possibility of repeated procedures and controlled side effects. One of the limitations of PDT is the low light penetration in biological tissues and hence the treated tissue volume. An alternative to overcome this limitation is the use of pulsed light sources that compared to continuous (CW) irradiation, present higher peak power leading to a greater penetration depth and enhancing the reactive oxygen species production. The aim of this study is to evaluate PDT using pulsed light source at femtosecond regime through in vitro photodegradation of two PSs types and in vivo induced necrosis in healthy rat liver. In the in vitro study we evaluated the photodegradation of Photogem (PG - 8μg/mL) and Photodithazine (PDZ - 6μg/mL), at different irradiances (280, 340, and 400 mW/cm2 for PG and 15, 56 and 112 mW/cm2 for PDZ). In the in vivo studies the induced necrosis profile with CW laser and Pulsed Laser were evaluated in animal model which received PG (1,5 mg/kg) and PDZ (1,0 mg/kg) and were irradiated with 74 mW/cm2 and 102 mW/cm2, respectively, and the fluence was 150 J/cm2. After that, the dependence of depth of necrosis with irradiance (60, 80, 107, 127, 138, 188 and 229 mW/cm2) with PG and 150 J/cm2 of fluence was evaluated. The light source used in those studies were a 630 and 660 nm diode laser (PG and PDZ excitation light, respectively) and a Ti:Sapphire Regenerative Amplifier laser, 1 kHz repetition rate, 800 nm wavelength and 75 fs pulse width in association with an optical parametric amplifier (OPA) to convert 400-1150 wavelengths. The in vitro results showed that the PG photodegratation rates were greater to pulsed laser when compared with CW laser. When PDZ was used, the photodegradarion rates with pulsed laser were lower than CW laser. In the in vivo studies, the induced necrosis with pulsed laser was twice the induced by CW laser with PG as photosensitizer. When PDZ was used, the induced necrosis was greater for CW laser than for pulsed laser. For different irradiances, the depth of necrosis induced by CW laser was greater than for pulsed laser below 80 mW/cm2, above this, the pulsed and CW laser did not show difference. These results demonstrated that pulsed light and PG can be considered an alternative to enhance the treated tissue volume. The same was not observed to PDZ, which indicate the strong dependence of PDT mechanisms with PS and the light regime applied.

Fotossensibilizadores são moléculas capazes de interagir com a luz de modo a gerar espécies altamente reativas de oxigênio como o oxigênio singlete e outras formas radicalares. Esta propriedade pode ser utilizada para o tratamento de câncer, remoção de contaminantes ambientais, inativação de agentes patogênicos no sangue e hemoderivados, bem como na esterilização alimentos. A técnica que utiliza o efeito fotodinâmico para o tratamento de câncer recebe o de nome Terapia Fotodinâmica (do termo em inglês: Photodynamic Therapy - PDT).Photofrin®, Photogem® e Photosan® são fármacos de primeira geração, derivados da hematoporfirina, que constituem o principal grupo de medicamentos com aplicação clínica em PDT. Photodithazine® é um fármaco de 2ª geração, derivado de clorina-e-6, que encontra-se em fase de testes clínicos e apresenta resultados promissores como fotossensibilizador (FS). Este trabalho tem o objetivo de investigar a eficiência fotodinâmica destes fármacos através de experimentos que envolvem a utilização da albumina de soro bovino (BSA) e o ácido úrico (AU) como dosímetros químicos; eritrócitos como modelo de membrana celular e a determinação do coeficiente de partição (P ou Log P) para se investigar lipofilicidade e a interação dos FS com as membranas celulares. Soluções contendo BSA e FS, preparadas em tampão fosfato, foram iluminadas com LED (630nm) e o decréscimo na fluorescência do BSA em 340nm foi utilizado para se calcular constante da velocidade de fotoxidação (kC, min-1). No teste do AU, a mistura AU e FS foi iluminada com LED e o coeficiente de atividade fotodinâmica (AF, m2.J-1) foi determinado através do decréscimo da banda do AU em 293nm. Os resultados convergem para a seguinte ordem de eficiência fotodinâmica: Photodithazine® >> Photogem® > Photofrin® > Photosan®, baseada nos valores de kC (14,8±0,3); (9,8±0,5); (3,2±0,7) e (2,9±0,5)min-1 e AF (64±14), (37±9), (9±2) e (4±1)m2J-1, respectivamente. Com objetivo de determinar o tempo necessário para causar 50% de hemólise (t50), amostras de eritrócitos (hematócrito=2%) foram irradiadas por 10 minutos e o dano causado à membrana pelo efeito fotodinâmico foi monitorado através da variação na absorbância característica da oxihemoglobina em 540 e 577nm. O mecanismo preferencial envolvido na fotoxidação da membrana celular foi investigado por meio de experimentos que avaliaram a influência de água deuterada, azida de sódio e manitol na velocidade de fotoxidação dos eritrócitos. Os resultados dos experimentos de hemólise apontam para a seguinte ordem de eficiência fotodinâmica: Photodithazine® >> Photofrin® > Photogem® > Photosan®, baseada nos valores de t50 : (1,2±0,3), (3,4±0,1), (3,8±0,2), (5,2±0,1)min e logP (0,21); (0,15); (0,11); (-0,21); respectivamente. A hemólise com Photogem® em meio deuterado foi cerca de 25% mais rápida e a presença de azida de sódio causou diminuição na hemólise, expressa pela diminuição dos valores de porcentagem máxima de hemólise (%HMÁX) e aumento nos valores de t50.. A presença de manitol nos ensaios de hemólise não apresentou influência nos valores de t50 e %HMÁX, indicando que a hemólise não ocorre via mecanismo radicalar, mas aponta para o mecanismo do tipo II, via oxigênio singlete, como sendo o mecanismo predominante na fotoxidação da membrana plasmática dos eritrócitos pelos fotossensibilizadores estudados. As diferenças encontradas entre os fármacos HpD são atribuídas as suas diferentes constituições, uma vez que tratam-se de misturas de monômeros, dímeros e oligomeros em diferentes frações. Experimentos realizados em solução homogênea, tais como os experimentos de fotoxidação de BSA e o teste do ácido úrico, fornecem importantes informações a respeito da estrutura-atividade dos fármacos, mas negligenciam os efeitos de interação dos FS com o meio biológico. Em ambiente biológico, os FS participam de inúmeras interações adicionais, constituindo sistemas únicos, com diferentes propriedades fotofísicas e fotoquímicas. Estudos anteriores, realizados no nosso grupo de pesquisa, envolvendo a determinação da citotoxicidade destes FS em culturas de células normais e tumorais, bem como estudos de separação cromatográfica dos constituintes de fármacos HpD estão de acordo com os resultados apresentados neste trabalho. / Photodynamic Therapy (PDT) is a developing technology that has been used for cancer treatment and recognized to have a huge potential for microorganisms inactivation and detoxication. It is based on light irradiation of a photosensitizer (PS) in order to produce reactive oxygen species. Many kinds of compounds are known to have photosensitizing properties. Photofrin®, Photogem® and Photosan® consist of mixtures of monomers, dimmers, and oligomers from hematoporphyrin treated chemically being the most clinically used PS. Photodithazine® is a water soluble clorin-e6-derivative, a second-generation drug. The present work provides a comparative study between these PS, using bovine serum albumin (BSA) and uric acid (UA) as chemical dosimeters as well as human red blood cells (RBC) as a cell membrane model and octanol/phosphate buffer partition coefficient (logP) to access the lipophilicity of the compounds. BSA and PS solutions in phosphate buffer were illuminated with LED ( =630nm) and the decrease in the BSA fluorescence at 340nm was used to calculate the photoxidation rate constant (kC, min-1). In UA test, a mixture of UA and photosensitizer was illuminated with LED ( =630nm) and the photodynamic activity coefficient (PA, m2.J-1) was determined by the decrease in the 293nm absorbance of UA. The results from these methodologies suggest that the photodynamic efficiency order is: Photodithazine® > Photogem® > Photofrin® > Photosan®, based on PA values (64±14), (37±9), (9±2) and (4±1)m2J-1 and kC values (14.8±0.3); (9.8±0.5); (3.2±0.7) and (2.9±0.5)min-1, respectively. In order to determine the t50 (time for 50% of hemolysis) the samples of RBC (hematocrit=2,0%) were irradiated for 10min and the absorbance characteristic of oxyhemoglobin (540 e 577nm) released due to the damage and consequent membrane lysis by the action of the PS was obtained. The mechanism involved in the photoxidation of the membrane was also studied determining how sodium azide, deuterium oxide and manitol affect the t50 values. The hemolysis experiments and logP values suggest the following order: Photodithazine® > Photofrin® > Photogem® > Photosan®, based on t50 values (1.2±0.3), (3.4±0.1), (3.8±0.2), (5.2±0.1)min and logP (0.21); x (0.15); (0.11); (-0.21), respectively. The rate of the hemolysis is increased about 25% in the deuterium oxide presence, and decreased in the sodium azide presence. Moreover, the experiments performed in the manitol presence not show any diference on t50 values. These results showed that the preponderant mechanism in the photohemolisys is of the type II. The differences in the photoxidative action of the HpD should be due to the diverse content of monomers, dimmers and oligomers of the PS components. The results of hemolysis experiments suggest that these differences should result in singular interactions of HpD with the membrane constituents. Photofrin seems to be the more effective HpD concerning the hemolysis of erythrocytes and logP values. Therefore the results of all used methodologies suggest that clorin-e6-derivative seems to be a much more efficient PS, followed by the three HpD. Photooxidation experiments performed in simple solution provide valuable information on structure-activity relationships, but neglect the effects due to of membrane interactions; the PS molecule can bind with the membrane of RBC and this PS-RBC complex is a unique system with different photophysical and photochemical properties. These results have been confirmed in our group by cytotoxic studies with tumor and non-tumor cells as well as by chromatographic separation of the HpDs showing that the correlation between the parameters still holds.

A terapia fotodinâmica é uma técnica que vem sendo aprimorada para o tratamento de cânceres e infecções e seu efeito terapêutico consiste na geração de espécies reativas de oxigênio que causam danos irreversíveis às células, levando-as a morte. Ela é considerada menos invasiva que outros tratamentos, podendo ser repetida diversas vezes e utilizada em conjunto com outros tratamentos sem o comprometimento do paciente. Um dos focos da terapia fotodinâmica é o tratamento de cânceres de pele melanoma devido a localização superficial das lesões e a elevada taxa de letalidade que a doença ocasiona, esta alta taxa esta relacionada a formação de tumores secundários em outras regiões do corpo que dificulta a cura. Neste trabalho buscou-se entender a interação do fotossensibilizador de segunda geração, Photodithazine, com as células de melanoma murino de linhagem B16F10. Foram analisadas a captação celular e a co-localização intracelular deste fotossensibilizador através da marcação de componentes celulares em microscopia confocal. Ensaios de viabilidade celular foram realizados para obtenção das concentrações menos citotóxicas sem e com luz, utilizando o teste de MTT. Foi realizada a caracterização do tempo de vida médio fluorescência do fotossensibilzador durante a terapia fotodinâmica em microscópio FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy). Os resultados indicaram que um maior tempo de incubação no escuro causa maior citotoxicidade para as concentrações acima de 0,1 mg/mL de Photodithazine. Os ensaios de terapia fotodinâmica apresentaram redução de mais de 90% de viabilidade celular para baixas concentrações de Photodithazine®, utilizando fluências acima de 2J/cm2. O tempo de vida médio de fluorescência do Photodithazine livre em solução apresentou tempo de 3,75 ns e quando ligado às células de 4,63 ns, durante a terapia fotodinâmica o tempo de vida médio de fluorescência apresentou alteração de aproximadamente 0,2 ns. Através do cálculo de coeficientes de correlação, foi observado a alta co-localização em mitocôndrias. / Photodynamic therapy is a technique manly applied in the treatment of cancers and infections. The principal compound of this therapy is the reactive oxygen species generated that react and damage various cellular components, causing cell death. Photodynamic therapy is considered minimally invasive and can be repeated several times without compromising the patient. One of the main focuses of photodynamic therapy is threatment of melanoma skin cancer due to it is superficial location of the lesions and also because the disease has a high rate of mortality, caused by the formation of secondary tumors elsewhere in the body that makes it difficult to cure. In this study, murine melanoma cells were studied in monolayer model using Photodithazine, a photosensitizer of second generation. Cellular uptake and intracellular co-localization of the photosensitizer was observed by labeling cellular components that were analyzed by confocal microscopy. Cell viability assays were performed to obtain the cytotoxic concentrations in the dark, using the MTT test. Using the less cytotoxic concentrations, photodynamic therapy trials was performed to obtain the cytotoxic fluences. Finally, the average lifetime fluorescence of photosensitizer was measured to characterize the photodynamic therapy in FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy). The results indicated that longer dark incubation cause greater cytotoxicity at the concentrations above 0.1 mg/mL of Photodithazine. Thereby the results of photodynamic therapy experiments observed the decreasing from over 90% cell viability at low concentrations of Photodithazine using fluences above 2 J/cm2. The average fluorescence lifetime of the free Photodithazine solution was 3.75 ns and cell-bound 4.63 ns, during the photodynamic therapy the average lifetime fluorescence changed approximately 0.2 ns. By calculating correlation coefficients, the high colocalization was observed in mitochondria.

A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade de tratamento para o câncer baseado na interação da luz com um agente fotossensibilizador (FS) e o oxigênio molecular presente na célula alvo. A TFD apresenta vantagens sobre os métodos tradicionais de tratamentos como o dano seletivo às células neoplásicas, ausência de intervenção cirúrgica, possibilidade de repetição do procedimento e efeitos colaterais controlados. Uma das limitações da técnica é a profundidade de pouca penetração da luz no tecido biológico e consequentemente o volume tecidual tratado. Uma alternativa para superar esta limitação é o emprego de fonte de luz pulsada que comparativamente a irradiação com luz contínua (CW), apresenta maior potência de pico levando a uma maior profundidade de penetração e maior formação de espécies reativas de oxigênio. O objetivo deste trabalho é a avaliação da TFD utilizando fonte de luz pulsada no regime de femtossegundos através de ensaios in vitro da fotodegradação de dois tipos de FSs e da necrose induzida em fígado sadio de ratos (estudos in vivo). Nos estudos in vitro foram avaliadas a fotodegradação do Photogem (PG - 8μg/mL) e do Photodithazine (PDZ - 6μg/mL), para as irradiâncias de 280, 340 e 400 mW/cm2 com PG, e 15, 56 e 112 mW/cm2 para o PDZ. Nos estudos in vivo foram avaliados o perfil de necrose induzida com as fontes de luz CW e pulsado em modelo animal, que receberam PG e PDZ nas concentrações de 1,5 mg/kg e 1,0 mg/kg, respectivamente. Foram irradiados com 74 mW/cm2 (PG) e 102 mW/cm2(PDZ) e dose total de energia de 150 J/cm2. Posteriormente foi avaliada a dependência de profundidade de necrose com a irradiância (60, 80, 107, 127, 138, 188 e 229 mW/cm2) utilizando PG e com dose total entregue de 150 J/cm2. As fontes de luz empregadas foram um laser de diodo 630 nm (PG), um laser de diodo emitindo em 660 nm (PDZ) e um laser de Ti:Safira, taxa de repetição de 1 kHz, comprimento de onda 800 nm e largura de pulso de 75 fs em associação com amplificador paramétrico óptico (APO) para conversão de comprimentos de onda na região de 400 - 1150 nm. Os experimentos in vitro mostraram que taxa de fotodegradação para o PG foi maior utilizando o laser pulsado do que para o laser CW. Quando utilizado o PDZ, o laser CW promoveu uma taxa de fotodegradação maior do que o pulsado. Nos estudos in vivo, foi observada a necrose induzida com laser pulsado cerca de duas vezes mais profunda do que a induzida pelo laser CW, enquanto necrose induzida pelo laser pulsado com PDZ foi maior do que a do laser CW. No estudo da dependência da profundidade de necrose em função da irradiância, o laser pulsado induziu profundidade de necrose maior do que o laser CW para irradiâncias abaixo de 80 mW/cm2, acima desta irradiância, o laser CW e o pulsado não mostraram diferença significativa. Estes resultados mostram que a combinação da fonte de luz pulsada e PG podem ser consideradas como alternativa para aumentar o volume tecidual tratado, porém, devem-se observar os parâmetros empregados para se obter o maior volume tecidual tratado. O mesmo resultado não foi observado para o PDZ como fotossensibilizador, o que indica uma forte dependência dos mecanismos da TFD com o FS e o regime de iluminação empregado. / Photodynamic therapy (PDT) is a therapeutic modality for cancer based on light, a photosensitizer agent (PS) and molecular oxygen into the target cells. PDT has advantages over traditional treatments, such as, selective damage to tumor cells, absence of surgical intervention, possibility of repeated procedures and controlled side effects. One of the limitations of PDT is the low light penetration in biological tissues and hence the treated tissue volume. An alternative to overcome this limitation is the use of pulsed light sources that compared to continuous (CW) irradiation, present higher peak power leading to a greater penetration depth and enhancing the reactive oxygen species production. The aim of this study is to evaluate PDT using pulsed light source at femtosecond regime through in vitro photodegradation of two PSs types and in vivo induced necrosis in healthy rat liver. In the in vitro study we evaluated the photodegradation of Photogem (PG - 8μg/mL) and Photodithazine (PDZ - 6μg/mL), at different irradiances (280, 340, and 400 mW/cm2 for PG and 15, 56 and 112 mW/cm2 for PDZ). In the in vivo studies the induced necrosis profile with CW laser and Pulsed Laser were evaluated in animal model which received PG (1,5 mg/kg) and PDZ (1,0 mg/kg) and were irradiated with 74 mW/cm2 and 102 mW/cm2, respectively, and the fluence was 150 J/cm2. After that, the dependence of depth of necrosis with irradiance (60, 80, 107, 127, 138, 188 and 229 mW/cm2) with PG and 150 J/cm2 of fluence was evaluated. The light source used in those studies were a 630 and 660 nm diode laser (PG and PDZ excitation light, respectively) and a Ti:Sapphire Regenerative Amplifier laser, 1 kHz repetition rate, 800 nm wavelength and 75 fs pulse width in association with an optical parametric amplifier (OPA) to convert 400-1150 wavelengths. The in vitro results showed that the PG photodegratation rates were greater to pulsed laser when compared with CW laser. When PDZ was used, the photodegradarion rates with pulsed laser were lower than CW laser. In the in vivo studies, the induced necrosis with pulsed laser was twice the induced by CW laser with PG as photosensitizer. When PDZ was used, the induced necrosis was greater for CW laser than for pulsed laser. For different irradiances, the depth of necrosis induced by CW laser was greater than for pulsed laser below 80 mW/cm2, above this, the pulsed and CW laser did not show difference. These results demonstrated that pulsed light and PG can be considered an alternative to enhance the treated tissue volume. The same was not observed to PDZ, which indicate the strong dependence of PDT mechanisms with PS and the light regime applied.