Fotossensibilizadores são moléculas capazes de interagir com a luz de modo a gerar espécies altamente reativas de oxigênio como o oxigênio singlete e outras formas radicalares. Esta propriedade pode ser utilizada para o tratamento de câncer, remoção de contaminantes ambientais, inativação de agentes patogênicos no sangue e hemoderivados, bem como na esterilização alimentos. A técnica que utiliza o efeito fotodinâmico para o tratamento de câncer recebe o de nome Terapia Fotodinâmica (do termo em inglês: Photodynamic Therapy - PDT).Photofrin®, Photogem® e Photosan® são fármacos de primeira geração, derivados da hematoporfirina, que constituem o principal grupo de medicamentos com aplicação clínica em PDT. Photodithazine® é um fármaco de 2ª geração, derivado de clorina-e-6, que encontra-se em fase de testes clínicos e apresenta resultados promissores como fotossensibilizador (FS). Este trabalho tem o objetivo de investigar a eficiência fotodinâmica destes fármacos através de experimentos que envolvem a utilização da albumina de soro bovino (BSA) e o ácido úrico (AU) como dosímetros químicos; eritrócitos como modelo de membrana celular e a determinação do coeficiente de partição (P ou Log P) para se investigar lipofilicidade e a interação dos FS com as membranas celulares. Soluções contendo BSA e FS, preparadas em tampão fosfato, foram iluminadas com LED (630nm) e o decréscimo na fluorescência do BSA em 340nm foi utilizado para se calcular constante da velocidade de fotoxidação (kC, min-1). No teste do AU, a mistura AU e FS foi iluminada com LED e o coeficiente de atividade fotodinâmica (AF, m2.J-1) foi determinado através do decréscimo da banda do AU em 293nm. Os resultados convergem para a seguinte ordem de eficiência fotodinâmica: Photodithazine® >> Photogem® > Photofrin® > Photosan®, baseada nos valores de kC (14,8±0,3); (9,8±0,5); (3,2±0,7) e (2,9±0,5)min-1 e AF (64±14), (37±9), (9±2) e (4±1)m2J-1, respectivamente. Com objetivo de determinar o tempo necessário para causar 50% de hemólise (t50), amostras de eritrócitos (hematócrito=2%) foram irradiadas por 10 minutos e o dano causado à membrana pelo efeito fotodinâmico foi monitorado através da variação na absorbância característica da oxihemoglobina em 540 e 577nm. O mecanismo preferencial envolvido na fotoxidação da membrana celular foi investigado por meio de experimentos que avaliaram a influência de água deuterada, azida de sódio e manitol na velocidade de fotoxidação dos eritrócitos. Os resultados dos experimentos de hemólise apontam para a seguinte ordem de eficiência fotodinâmica: Photodithazine® >> Photofrin® > Photogem® > Photosan®, baseada nos valores de t50 : (1,2±0,3), (3,4±0,1), (3,8±0,2), (5,2±0,1)min e logP (0,21); (0,15); (0,11); (-0,21); respectivamente. A hemólise com Photogem® em meio deuterado foi cerca de 25% mais rápida e a presença de azida de sódio causou diminuição na hemólise, expressa pela diminuição dos valores de porcentagem máxima de hemólise (%HMÁX) e aumento nos valores de t50.. A presença de manitol nos ensaios de hemólise não apresentou influência nos valores de t50 e %HMÁX, indicando que a hemólise não ocorre via mecanismo radicalar, mas aponta para o mecanismo do tipo II, via oxigênio singlete, como sendo o mecanismo predominante na fotoxidação da membrana plasmática dos eritrócitos pelos fotossensibilizadores estudados. As diferenças encontradas entre os fármacos HpD são atribuídas as suas diferentes constituições, uma vez que tratam-se de misturas de monômeros, dímeros e oligomeros em diferentes frações. Experimentos realizados em solução homogênea, tais como os experimentos de fotoxidação de BSA e o teste do ácido úrico, fornecem importantes informações a respeito da estrutura-atividade dos fármacos, mas negligenciam os efeitos de interação dos FS com o meio biológico. Em ambiente biológico, os FS participam de inúmeras interações adicionais, constituindo sistemas únicos, com diferentes propriedades fotofísicas e fotoquímicas. Estudos anteriores, realizados no nosso grupo de pesquisa, envolvendo a determinação da citotoxicidade destes FS em culturas de células normais e tumorais, bem como estudos de separação cromatográfica dos constituintes de fármacos HpD estão de acordo com os resultados apresentados neste trabalho. / Photodynamic Therapy (PDT) is a developing technology that has been used for cancer treatment and recognized to have a huge potential for microorganisms inactivation and detoxication. It is based on light irradiation of a photosensitizer (PS) in order to produce reactive oxygen species. Many kinds of compounds are known to have photosensitizing properties. Photofrin®, Photogem® and Photosan® consist of mixtures of monomers, dimmers, and oligomers from hematoporphyrin treated chemically being the most clinically used PS. Photodithazine® is a water soluble clorin-e6-derivative, a second-generation drug. The present work provides a comparative study between these PS, using bovine serum albumin (BSA) and uric acid (UA) as chemical dosimeters as well as human red blood cells (RBC) as a cell membrane model and octanol/phosphate buffer partition coefficient (logP) to access the lipophilicity of the compounds. BSA and PS solutions in phosphate buffer were illuminated with LED ( =630nm) and the decrease in the BSA fluorescence at 340nm was used to calculate the photoxidation rate constant (kC, min-1). In UA test, a mixture of UA and photosensitizer was illuminated with LED ( =630nm) and the photodynamic activity coefficient (PA, m2.J-1) was determined by the decrease in the 293nm absorbance of UA. The results from these methodologies suggest that the photodynamic efficiency order is: Photodithazine® > Photogem® > Photofrin® > Photosan®, based on PA values (64±14), (37±9), (9±2) and (4±1)m2J-1 and kC values (14.8±0.3); (9.8±0.5); (3.2±0.7) and (2.9±0.5)min-1, respectively. In order to determine the t50 (time for 50% of hemolysis) the samples of RBC (hematocrit=2,0%) were irradiated for 10min and the absorbance characteristic of oxyhemoglobin (540 e 577nm) released due to the damage and consequent membrane lysis by the action of the PS was obtained. The mechanism involved in the photoxidation of the membrane was also studied determining how sodium azide, deuterium oxide and manitol affect the t50 values. The hemolysis experiments and logP values suggest the following order: Photodithazine® > Photofrin® > Photogem® > Photosan®, based on t50 values (1.2±0.3), (3.4±0.1), (3.8±0.2), (5.2±0.1)min and logP (0.21); x (0.15); (0.11); (-0.21), respectively. The rate of the hemolysis is increased about 25% in the deuterium oxide presence, and decreased in the sodium azide presence. Moreover, the experiments performed in the manitol presence not show any diference on t50 values. These results showed that the preponderant mechanism in the photohemolisys is of the type II. The differences in the photoxidative action of the HpD should be due to the diverse content of monomers, dimmers and oligomers of the PS components. The results of hemolysis experiments suggest that these differences should result in singular interactions of HpD with the membrane constituents. Photofrin seems to be the more effective HpD concerning the hemolysis of erythrocytes and logP values. Therefore the results of all used methodologies suggest that clorin-e6-derivative seems to be a much more efficient PS, followed by the three HpD. Photooxidation experiments performed in simple solution provide valuable information on structure-activity relationships, but neglect the effects due to of membrane interactions; the PS molecule can bind with the membrane of RBC and this PS-RBC complex is a unique system with different photophysical and photochemical properties. These results have been confirmed in our group by cytotoxic studies with tumor and non-tumor cells as well as by chromatographic separation of the HpDs showing that the correlation between the parameters still holds.

O efeito do fotossensibilizador na estrutura biológica não é apenas influenciado por suas propriedades fotofísicas, mas também por sua interação específica com biosistemas.Além disso, a localização do fotossensibilizador no tecido tumoral é um importante fator que resulta em diferentes mecanismos de destruição do tumor. Muitos fotossensibilizadores, após administração sistêmica, se ligam às proteínas plasmáticas e com isso são distribuídos em diferentes sítios no organismo. Os fotossensibilizadores hidrofílicos são largamente transportados por albuminas e globilinas e se acumulam preferencialmente no estroma vascular dos tumores. Entretanto, fotossensibilizadores mais hidrofóbicos se ligam às lipoproteínas, principalmente LDL, que promove a entrada do FS na célula através de endocitose mediado por receptor. Sendo assim, a localização do FS depende de sua ligação com as deferentes proteínas plasmáticas, sua farmacocinética e também é influenciada pela diferença entre o tecido normal e tumoral. O tecido tumoral tem pH mais baixo e maior expressão de receptores de LDL do que os tecidos normais, aumentando a seletividade dos FSs as células tumorais. A incorporação de FS hidrofóbicos em lipossomas para a administração sistêmica pode realçar ao transporte deste pelas lipoproteínas. No presente trabalho estudou-se a influência do pH na interação de fotossensibilizadores com lipossomas de DMPC e LDL. Os fotossensibilizadores utilizados nesse estudo foram Photofrin®, Photogem® e Photosan® que são derivados de hematoporfirinas. A metodologia empregada constitui de variação das concentrações de DMPC e LDL para os seguintes valores de pHs 5,0; 7,4 e 9,0, esse último pH utilizou-se somente para DMPC. O complexo FS - DMPC foi obtido por incubação dos FSs na concentração de 10 micro g.mL-1 com diferentes concentrações de DMPC (0 a 400 micro M) por trinta minutos no escuro. Isolou-se o LDL do plasma humano por ultracentrifugação por gradiente de densidade. Após a separação, o complexo FS - LDL foi obtido por incubação (12 horas no escuro) do FS na concentração 10 micro g.mL-1 com diferentes concentrações de LDL (0 a 0,04 micro M). O comportamento desses complexos foi analisado por espectroscopia de absorção ótica e por espectroscopia de fluorescência. / The effect of a photosensitizing compound on biological structures is governed not only by its photophysical properties but also by the specificity of its interaction with biosystems. Moreover, localization of the photosensitizer in the tumor tissue is an important factor affecting the outcome as well as mechanism leading to tumor destruction. Following administration, most photosensitizers are bound to blood components and delivered to different sites in the organism. It is generally accepted that hydrophilic photosensitizers are largely transported by albumins and globulins and mainly accumulate in the vascular stroma of tumors. More hydrophobic sensitizers are bound to lipoproteins, which promote drug internalization by cells through endocytosis of the lipoprotein carrier. In this way, uptake and localization depend on the initial plasma binding and the plasma pharmacokinetics of the drug. However, the selective localization of some photosensitizers are influence for the difference between malignant and normal tissues. Notably, the lower pH of the microenvironment usually found in the tumor tissue and the expression of greater number of LDL receptors on the surface of the tumor cells might influence cellular uptake. Delivery to lipoproteins or target tissues may be facilitated and enhanced by the incorporation of lipophilic photosensitizers into liposomes for systemic administration. In the present work we have studied the pH-dependence of the interaction of photosensitizers with DMPC liposomes and low density lipoprotein (LDL). The photosensitizers used in this study are Photofrin®, Photogem® and Photosan®, which are hematoporphyrin derivates. The methodology used to this work, constitute of various concentrations of DMPC liposomes and LDL at different pH values. It were used the 5,0; 7,4 and 9,0 pH values. The DMPC-drug complexes were obtained by incubation of the photosensitizers 10 _g.mL-1 with differents DMPC concentrations for 30 min in the dark. The LDL was isolated from human plasma by sequential density gradient ultracentrifugation. The LDL-drug complexes were obtained by incubation of the photosensitizers 10 _g.mL-1 with differents LDL concentrations. The incubation was performed in a water bath at 20_C for 12 hours in the dark. The comportment of the complexes was analyzed by fluorescence spectroscopy and UV-visible spectroscopy.

Fotossensibilizadores são moléculas capazes de interagir com a luz de modo a gerar espécies altamente reativas de oxigênio como o oxigênio singlete e outras formas radicalares. Esta propriedade pode ser utilizada para o tratamento de câncer, remoção de contaminantes ambientais, inativação de agentes patogênicos no sangue e hemoderivados, bem como na esterilização alimentos. A técnica que utiliza o efeito fotodinâmico para o tratamento de câncer recebe o de nome Terapia Fotodinâmica (do termo em inglês: Photodynamic Therapy - PDT).Photofrin®, Photogem® e Photosan® são fármacos de primeira geração, derivados da hematoporfirina, que constituem o principal grupo de medicamentos com aplicação clínica em PDT. Photodithazine® é um fármaco de 2ª geração, derivado de clorina-e-6, que encontra-se em fase de testes clínicos e apresenta resultados promissores como fotossensibilizador (FS). Este trabalho tem o objetivo de investigar a eficiência fotodinâmica destes fármacos através de experimentos que envolvem a utilização da albumina de soro bovino (BSA) e o ácido úrico (AU) como dosímetros químicos; eritrócitos como modelo de membrana celular e a determinação do coeficiente de partição (P ou Log P) para se investigar lipofilicidade e a interação dos FS com as membranas celulares. Soluções contendo BSA e FS, preparadas em tampão fosfato, foram iluminadas com LED (630nm) e o decréscimo na fluorescência do BSA em 340nm foi utilizado para se calcular constante da velocidade de fotoxidação (kC, min-1). No teste do AU, a mistura AU e FS foi iluminada com LED e o coeficiente de atividade fotodinâmica (AF, m2.J-1) foi determinado através do decréscimo da banda do AU em 293nm. Os resultados convergem para a seguinte ordem de eficiência fotodinâmica: Photodithazine® >> Photogem® > Photofrin® > Photosan®, baseada nos valores de kC (14,8±0,3); (9,8±0,5); (3,2±0,7) e (2,9±0,5)min-1 e AF (64±14), (37±9), (9±2) e (4±1)m2J-1, respectivamente. Com objetivo de determinar o tempo necessário para causar 50% de hemólise (t50), amostras de eritrócitos (hematócrito=2%) foram irradiadas por 10 minutos e o dano causado à membrana pelo efeito fotodinâmico foi monitorado através da variação na absorbância característica da oxihemoglobina em 540 e 577nm. O mecanismo preferencial envolvido na fotoxidação da membrana celular foi investigado por meio de experimentos que avaliaram a influência de água deuterada, azida de sódio e manitol na velocidade de fotoxidação dos eritrócitos. Os resultados dos experimentos de hemólise apontam para a seguinte ordem de eficiência fotodinâmica: Photodithazine® >> Photofrin® > Photogem® > Photosan®, baseada nos valores de t50 : (1,2±0,3), (3,4±0,1), (3,8±0,2), (5,2±0,1)min e logP (0,21); (0,15); (0,11); (-0,21); respectivamente. A hemólise com Photogem® em meio deuterado foi cerca de 25% mais rápida e a presença de azida de sódio causou diminuição na hemólise, expressa pela diminuição dos valores de porcentagem máxima de hemólise (%HMÁX) e aumento nos valores de t50.. A presença de manitol nos ensaios de hemólise não apresentou influência nos valores de t50 e %HMÁX, indicando que a hemólise não ocorre via mecanismo radicalar, mas aponta para o mecanismo do tipo II, via oxigênio singlete, como sendo o mecanismo predominante na fotoxidação da membrana plasmática dos eritrócitos pelos fotossensibilizadores estudados. As diferenças encontradas entre os fármacos HpD são atribuídas as suas diferentes constituições, uma vez que tratam-se de misturas de monômeros, dímeros e oligomeros em diferentes frações. Experimentos realizados em solução homogênea, tais como os experimentos de fotoxidação de BSA e o teste do ácido úrico, fornecem importantes informações a respeito da estrutura-atividade dos fármacos, mas negligenciam os efeitos de interação dos FS com o meio biológico. Em ambiente biológico, os FS participam de inúmeras interações adicionais, constituindo sistemas únicos, com diferentes propriedades fotofísicas e fotoquímicas. Estudos anteriores, realizados no nosso grupo de pesquisa, envolvendo a determinação da citotoxicidade destes FS em culturas de células normais e tumorais, bem como estudos de separação cromatográfica dos constituintes de fármacos HpD estão de acordo com os resultados apresentados neste trabalho. / Photodynamic Therapy (PDT) is a developing technology that has been used for cancer treatment and recognized to have a huge potential for microorganisms inactivation and detoxication. It is based on light irradiation of a photosensitizer (PS) in order to produce reactive oxygen species. Many kinds of compounds are known to have photosensitizing properties. Photofrin®, Photogem® and Photosan® consist of mixtures of monomers, dimmers, and oligomers from hematoporphyrin treated chemically being the most clinically used PS. Photodithazine® is a water soluble clorin-e6-derivative, a second-generation drug. The present work provides a comparative study between these PS, using bovine serum albumin (BSA) and uric acid (UA) as chemical dosimeters as well as human red blood cells (RBC) as a cell membrane model and octanol/phosphate buffer partition coefficient (logP) to access the lipophilicity of the compounds. BSA and PS solutions in phosphate buffer were illuminated with LED ( =630nm) and the decrease in the BSA fluorescence at 340nm was used to calculate the photoxidation rate constant (kC, min-1). In UA test, a mixture of UA and photosensitizer was illuminated with LED ( =630nm) and the photodynamic activity coefficient (PA, m2.J-1) was determined by the decrease in the 293nm absorbance of UA. The results from these methodologies suggest that the photodynamic efficiency order is: Photodithazine® > Photogem® > Photofrin® > Photosan®, based on PA values (64±14), (37±9), (9±2) and (4±1)m2J-1 and kC values (14.8±0.3); (9.8±0.5); (3.2±0.7) and (2.9±0.5)min-1, respectively. In order to determine the t50 (time for 50% of hemolysis) the samples of RBC (hematocrit=2,0%) were irradiated for 10min and the absorbance characteristic of oxyhemoglobin (540 e 577nm) released due to the damage and consequent membrane lysis by the action of the PS was obtained. The mechanism involved in the photoxidation of the membrane was also studied determining how sodium azide, deuterium oxide and manitol affect the t50 values. The hemolysis experiments and logP values suggest the following order: Photodithazine® > Photofrin® > Photogem® > Photosan®, based on t50 values (1.2±0.3), (3.4±0.1), (3.8±0.2), (5.2±0.1)min and logP (0.21); x (0.15); (0.11); (-0.21), respectively. The rate of the hemolysis is increased about 25% in the deuterium oxide presence, and decreased in the sodium azide presence. Moreover, the experiments performed in the manitol presence not show any diference on t50 values. These results showed that the preponderant mechanism in the photohemolisys is of the type II. The differences in the photoxidative action of the HpD should be due to the diverse content of monomers, dimmers and oligomers of the PS components. The results of hemolysis experiments suggest that these differences should result in singular interactions of HpD with the membrane constituents. Photofrin seems to be the more effective HpD concerning the hemolysis of erythrocytes and logP values. Therefore the results of all used methodologies suggest that clorin-e6-derivative seems to be a much more efficient PS, followed by the three HpD. Photooxidation experiments performed in simple solution provide valuable information on structure-activity relationships, but neglect the effects due to of membrane interactions; the PS molecule can bind with the membrane of RBC and this PS-RBC complex is a unique system with different photophysical and photochemical properties. These results have been confirmed in our group by cytotoxic studies with tumor and non-tumor cells as well as by chromatographic separation of the HpDs showing that the correlation between the parameters still holds.

O efeito do fotossensibilizador na estrutura biológica não é apenas influenciado por suas propriedades fotofísicas, mas também por sua interação específica com biosistemas.Além disso, a localização do fotossensibilizador no tecido tumoral é um importante fator que resulta em diferentes mecanismos de destruição do tumor. Muitos fotossensibilizadores, após administração sistêmica, se ligam às proteínas plasmáticas e com isso são distribuídos em diferentes sítios no organismo. Os fotossensibilizadores hidrofílicos são largamente transportados por albuminas e globilinas e se acumulam preferencialmente no estroma vascular dos tumores. Entretanto, fotossensibilizadores mais hidrofóbicos se ligam às lipoproteínas, principalmente LDL, que promove a entrada do FS na célula através de endocitose mediado por receptor. Sendo assim, a localização do FS depende de sua ligação com as deferentes proteínas plasmáticas, sua farmacocinética e também é influenciada pela diferença entre o tecido normal e tumoral. O tecido tumoral tem pH mais baixo e maior expressão de receptores de LDL do que os tecidos normais, aumentando a seletividade dos FSs as células tumorais. A incorporação de FS hidrofóbicos em lipossomas para a administração sistêmica pode realçar ao transporte deste pelas lipoproteínas. No presente trabalho estudou-se a influência do pH na interação de fotossensibilizadores com lipossomas de DMPC e LDL. Os fotossensibilizadores utilizados nesse estudo foram Photofrin®, Photogem® e Photosan® que são derivados de hematoporfirinas. A metodologia empregada constitui de variação das concentrações de DMPC e LDL para os seguintes valores de pHs 5,0; 7,4 e 9,0, esse último pH utilizou-se somente para DMPC. O complexo FS - DMPC foi obtido por incubação dos FSs na concentração de 10 micro g.mL-1 com diferentes concentrações de DMPC (0 a 400 micro M) por trinta minutos no escuro. Isolou-se o LDL do plasma humano por ultracentrifugação por gradiente de densidade. Após a separação, o complexo FS - LDL foi obtido por incubação (12 horas no escuro) do FS na concentração 10 micro g.mL-1 com diferentes concentrações de LDL (0 a 0,04 micro M). O comportamento desses complexos foi analisado por espectroscopia de absorção ótica e por espectroscopia de fluorescência. / The effect of a photosensitizing compound on biological structures is governed not only by its photophysical properties but also by the specificity of its interaction with biosystems. Moreover, localization of the photosensitizer in the tumor tissue is an important factor affecting the outcome as well as mechanism leading to tumor destruction. Following administration, most photosensitizers are bound to blood components and delivered to different sites in the organism. It is generally accepted that hydrophilic photosensitizers are largely transported by albumins and globulins and mainly accumulate in the vascular stroma of tumors. More hydrophobic sensitizers are bound to lipoproteins, which promote drug internalization by cells through endocytosis of the lipoprotein carrier. In this way, uptake and localization depend on the initial plasma binding and the plasma pharmacokinetics of the drug. However, the selective localization of some photosensitizers are influence for the difference between malignant and normal tissues. Notably, the lower pH of the microenvironment usually found in the tumor tissue and the expression of greater number of LDL receptors on the surface of the tumor cells might influence cellular uptake. Delivery to lipoproteins or target tissues may be facilitated and enhanced by the incorporation of lipophilic photosensitizers into liposomes for systemic administration. In the present work we have studied the pH-dependence of the interaction of photosensitizers with DMPC liposomes and low density lipoprotein (LDL). The photosensitizers used in this study are Photofrin®, Photogem® and Photosan®, which are hematoporphyrin derivates. The methodology used to this work, constitute of various concentrations of DMPC liposomes and LDL at different pH values. It were used the 5,0; 7,4 and 9,0 pH values. The DMPC-drug complexes were obtained by incubation of the photosensitizers 10 _g.mL-1 with differents DMPC concentrations for 30 min in the dark. The LDL was isolated from human plasma by sequential density gradient ultracentrifugation. The LDL-drug complexes were obtained by incubation of the photosensitizers 10 _g.mL-1 with differents LDL concentrations. The incubation was performed in a water bath at 20_C for 12 hours in the dark. The comportment of the complexes was analyzed by fluorescence spectroscopy and UV-visible spectroscopy.