Many candidate mycoherbicides have shown promise in the laboratory or greenhouse, but most have been ineffective in the field. Factors limiting mycoherbicide efficiency include temperature and humidity. Results from this thesis indicate that solar radiation has both a damaging effect(reduction in germination)limiting efficacy and a photomorphogenic effect(appressorium induction)increasing efficacy. The study has also shown significant interaction between temperature and solar radiation on the survival of conidia of potential mycoherbistats. Therefore, solar radiation should be considered as third major component of the environment that should be considered when trying to produce mycoherbistats. With the findings presented in this thesis and further research on disease development under different conditions, in combination with the formulation of conidia in suitable UV protectants, a computer simulation modelling the conditions leading to epidemics caused by C.orbiculare, D.avenacea and R.alismatis could be constructed. It may be possible to manipulate fungal application time in order to expose conidia to doses of solar radiation that are not harmful to conidium germination and which stimulate appressorium formation. However, additional protection may be needed. / Doctor of Philosophy (PhD)

Frente à recente detecção em território brasileiro de Monilina laxa, que assim como M. fructicola, é causadora da podridão parda do pessegueiro, e à falta de informações sobre a epidemiologia dos patógenos causadores da doença em regiões subtropicais, surgiu a necessidade deste trabalho, que teve por objetivos determinar as melhores condições de temperatura e molhamento para o desenvolvimento de M. fructicola e M. laxa in vitro e para a infecção e colonização pêssegos por conídios dos patógenos. Quatro isolados de M. fructicola e um isolado de M. laxa, provenientes de plantios do Estado de São Paulo e mantidos no laboratório de Epidemiologia da ESALQ, foram estudados. Foram avaliados os efeitos da temperatura e da duração do molhamento na germinação dos conídios in vitro e o efeito da temperatura no crescimento micelial e na esporulação dos patógenos. Ensaios para determinar a sensibilidade dos patógenos ao fungicida iminoctadina também foram conduzidos. Adicionalmente, pêssegos maduros foram adquiridos, feridos, inoculados com suspensão de conídios e incubados em diferentes temperaturas sob diferentes períodos de câmara úmida. Diariamente incidência e severidade foram avaliadas. A esporulação foi avaliada ao final de cada tratamento. A faixa ótima de temperatura para germinação de conídios de M. laxa, de 5 a 30ºC, é maior que a de M. fructicola, de 10 a 30ºC. O período de molhamento não teve influência na germinação dos conídios. A melhor faixa de temperatura para crescimento micelial tanto de M. fructicola quanto M. laxa de foi de 20 a 25ºC. A esporulação de M. laxa foi inversamente proporcional à temperatura de incubação. Não houve relação entre temperatura e produção de esporos em M. fructicola. Ambas as espécies mostraram-se sensíveis, in vitro, à molécula iminoctadina. A incidência da podridão parda foi superior a 80,9% em todos os tratamentos, para as duas espécies fúngicas. A 10ºC os períodos de incubação e de latência foram menores para M. laxa que para M. fructicola. A faixa ótima de temperatura para o desenvolvimento de lesões variou de 15 a 25ºC para os dois patógenos. A esporulação dos patógenos não mostrou relação com a temperatura nos ensaios in vivo. Diferenças nos sinais da espécie do patógeno foram observados nas lesões. / Due to the recent detection in Brazil of Monilinia laxa, that similar to M. fructicola causes the brown rot of peaches, and the lack of information about the epidemiology of the causal agents of this disease from subtropical regions, raised the need of such a study, which the aims were to determine the best temperature and wetness duration conditions to the development of M. fructicola and M. laxa in vitro and to infection and colonization of peaches by conidia from both pathogens. Four M. fructicola isolates and one M. laxa isolate, collected from infected fruit of São Paulo orchards and maintained at the Epidemiology Laboratory at ESALQ, were studied. Temperature and wetness duration effects on conidia germination in vitro and temperature effects on mycelial growth and sporulation of pathogens were evaluated. Trials to evaluate the sensitivity of isolates to the fungicide iminoctadine were also conducted. Furthermore, mature peaches were wounded on the surface, inoculated with a conidia suspension and incubated at different temperatures during different wet chamber periods. Incidence and severity of the disease were evaluated daily. Sporulation was evaluated at the end of each treatment. The favorable range of temperature to conidia germination of M. laxa, from 5 to 30ºC, was greater than M. fructicola range, from 10 to 30ºC. The wetness duration showed no influence on conidia germination. The best range of temperature for mycelial growth of both M. fructicola and M. laxa was from 20 to 25ºC. Sporulation of M. laxa showed an inverse relationship to the incubation temperature. No relationship between temperature and conidia production was found for M. fructicola. Both species were sensitive to the iminoctadine fungicide in vitro. Incidence of brown rot was greater than 80.9% in all treatments, for both species. At 10ºC incubation and latency periods were shorter for M. laxa than for M. fructicola. The best temperatures for lesion development varied between 15 and 25ºC for both pathogens. Sporulation of the two species showed no relationship to the temperature on the in vivo trials. Visual differences were observed on pathogen symptoms on fruit.

Frente à recente detecção em território brasileiro de Monilina laxa, que assim como M. fructicola, é causadora da podridão parda do pessegueiro, e à falta de informações sobre a epidemiologia dos patógenos causadores da doença em regiões subtropicais, surgiu a necessidade deste trabalho, que teve por objetivos determinar as melhores condições de temperatura e molhamento para o desenvolvimento de M. fructicola e M. laxa in vitro e para a infecção e colonização pêssegos por conídios dos patógenos. Quatro isolados de M. fructicola e um isolado de M. laxa, provenientes de plantios do Estado de São Paulo e mantidos no laboratório de Epidemiologia da ESALQ, foram estudados. Foram avaliados os efeitos da temperatura e da duração do molhamento na germinação dos conídios in vitro e o efeito da temperatura no crescimento micelial e na esporulação dos patógenos. Ensaios para determinar a sensibilidade dos patógenos ao fungicida iminoctadina também foram conduzidos. Adicionalmente, pêssegos maduros foram adquiridos, feridos, inoculados com suspensão de conídios e incubados em diferentes temperaturas sob diferentes períodos de câmara úmida. Diariamente incidência e severidade foram avaliadas. A esporulação foi avaliada ao final de cada tratamento. A faixa ótima de temperatura para germinação de conídios de M. laxa, de 5 a 30ºC, é maior que a de M. fructicola, de 10 a 30ºC. O período de molhamento não teve influência na germinação dos conídios. A melhor faixa de temperatura para crescimento micelial tanto de M. fructicola quanto M. laxa de foi de 20 a 25ºC. A esporulação de M. laxa foi inversamente proporcional à temperatura de incubação. Não houve relação entre temperatura e produção de esporos em M. fructicola. Ambas as espécies mostraram-se sensíveis, in vitro, à molécula iminoctadina. A incidência da podridão parda foi superior a 80,9% em todos os tratamentos, para as duas espécies fúngicas. A 10ºC os períodos de incubação e de latência foram menores para M. laxa que para M. fructicola. A faixa ótima de temperatura para o desenvolvimento de lesões variou de 15 a 25ºC para os dois patógenos. A esporulação dos patógenos não mostrou relação com a temperatura nos ensaios in vivo. Diferenças nos sinais da espécie do patógeno foram observados nas lesões. / Due to the recent detection in Brazil of Monilinia laxa, that similar to M. fructicola causes the brown rot of peaches, and the lack of information about the epidemiology of the causal agents of this disease from subtropical regions, raised the need of such a study, which the aims were to determine the best temperature and wetness duration conditions to the development of M. fructicola and M. laxa in vitro and to infection and colonization of peaches by conidia from both pathogens. Four M. fructicola isolates and one M. laxa isolate, collected from infected fruit of São Paulo orchards and maintained at the Epidemiology Laboratory at ESALQ, were studied. Temperature and wetness duration effects on conidia germination in vitro and temperature effects on mycelial growth and sporulation of pathogens were evaluated. Trials to evaluate the sensitivity of isolates to the fungicide iminoctadine were also conducted. Furthermore, mature peaches were wounded on the surface, inoculated with a conidia suspension and incubated at different temperatures during different wet chamber periods. Incidence and severity of the disease were evaluated daily. Sporulation was evaluated at the end of each treatment. The favorable range of temperature to conidia germination of M. laxa, from 5 to 30ºC, was greater than M. fructicola range, from 10 to 30ºC. The wetness duration showed no influence on conidia germination. The best range of temperature for mycelial growth of both M. fructicola and M. laxa was from 20 to 25ºC. Sporulation of M. laxa showed an inverse relationship to the incubation temperature. No relationship between temperature and conidia production was found for M. fructicola. Both species were sensitive to the iminoctadine fungicide in vitro. Incidence of brown rot was greater than 80.9% in all treatments, for both species. At 10ºC incubation and latency periods were shorter for M. laxa than for M. fructicola. The best temperatures for lesion development varied between 15 and 25ºC for both pathogens. Sporulation of the two species showed no relationship to the temperature on the in vivo trials. Visual differences were observed on pathogen symptoms on fruit.

A bactéria Xylella fastidiosa 9a5c é o agente causal da clorose variegada dos citros (CVC) e responsável por grandes perdas econômicas na citricultura. O genoma de X. fastidiosa 9a5c foi totalmente seqüenciado e a sua análise permitiu identificar vários genes possivelmente envolvidos na patogenicidade/virulência da bactéria. Como os sintomas da CVC desenvolvemse um longo tempo após a infecção da planta pela bactéria e a severidade da doença têm sido associada à altas temperaturas, é possível que a expressão de fatores de patogenicidade/virulência seja dependente de densidade celular e/ou estresses térmicos. Desta forma, o crescimento in vitro da X. fastidiosa foi monitorado através da absorbância de suspensões bacterianas à 600nm (A600), número de unidades formadoras de colônias (UFC) e viabilidade celular, durante 16 dias de cultivo em meio PW modificado líquido, à 28 e 32ºC. Proteínas extracelulares foram extraídas e analisadas através da eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D-PAGE). Bioensaios foram utilizados para verificar a produção de moléculas sinais por X. fastidiosa. Os resultados obtidos mostraram que o crescimento de X. fastidiosa à 32ºC, com base na A600, não diferiu do crescimento à 28ºC. No entanto, com base no número de UFCs e viabilidade celular, o crescimento de X. fastidiosa diferiu em função da temperatura, tempos de incubação e a interação entre esses fatores. X. fastidiosa produziu maior número de proteínas extracelulares à 32 do que à 28ºC, mostrando que a secreção de proteínas em X. fastidiosa é regulada pela temperatura de incubação. Várias proteínas extracelulares produzidas por X. fastidiosa à 28 e 32ºC são moduladas durante o crescimento da bactéria. A maior parte das proteínas extracelulares produzidas por X. fastidiosa são proteínas ácidas e de massa molecular aparente entre 20-60 kDa. X. fastidiosa não sintetizou moléculas de lactonas de homoserina aciladas (LHAs) reconhecidas pelo sistema repórter utilizado, mas sintetizou uma molécula extracelular em meio de cultivo, semelhante ao DSF produzido por X. campestris pv. campestris, capaz de restaurar a atividade da endoglucanase através do sistema repórter utilizado. A concentração desta molécula em meio PW modificado foi dependente da densidade de células de X. fastidiosa no meio. / The bacterium Xylella fastidiosa is the causal agent of the citrus variegated chlorosis (CVC) and is responsible for significant economic losses in citriculture. The genome of X. fastidiosa has been completely sequenced and revealed several genes probably involved in pathogenicity/virulence. Since CVC symptoms are develop a long time after infection of plant by the bacterium and the severity of the disease has been associated with high temperatures, it’s possible that the expression of pathogenicity/virulence factors is dependent on cellular density and/or temperature stresses. Thus, the growth of X. fastidiosa in modified liquid PW medium was measured based on the absorbance of suspensions at (A600), number of colony-forming units (CFU) and cellular viability, during 16 days at 28 and 32ºC. Extracellular proteins were extracted and analysed by two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE). Bioassays were used to determine whether X. fastidiosa produces signal molecules involved in quorum perception. The results showed that temperatures of 28 and 32ºC did not affect the growth of the bacterium, based on A600. Temperatures of 28 and 32ºC, incubation times and the interaction of both factors affected bacterial growth based on CFU numbers and the cellular viability. X. fastidiosa produced higher number of extracellular proteins at 32 than at 28ºC, showing that protein secretion is dependent on growth temperature. Several extracellular proteins produced by X. fastidiosa at 28 and 32ºC were modulated the bacterial growth. Most of the extracellular proteins produced by X. fastidiosa were acidic with apparent molecular mass within 20-60 kDa. X. fastidiosa did not synthesize N-acyl homoserine lactone (AHL) recognizes by the reporter system used. However, it synthesized an extracellular molecule in modified PW medium, similar to DSF produced by X. campestris pv. campestris, which is able to restore endoglucanase activity by the reporter system. The concentration of this extracellular molecule produced by X. fastidiosa was dependent on cellular density.

A bactéria Xylella fastidiosa 9a5c é o agente causal da clorose variegada dos citros (CVC) e responsável por grandes perdas econômicas na citricultura. O genoma de X. fastidiosa 9a5c foi totalmente seqüenciado e a sua análise permitiu identificar vários genes possivelmente envolvidos na patogenicidade/virulência da bactéria. Como os sintomas da CVC desenvolvemse um longo tempo após a infecção da planta pela bactéria e a severidade da doença têm sido associada à altas temperaturas, é possível que a expressão de fatores de patogenicidade/virulência seja dependente de densidade celular e/ou estresses térmicos. Desta forma, o crescimento in vitro da X. fastidiosa foi monitorado através da absorbância de suspensões bacterianas à 600nm (A600), número de unidades formadoras de colônias (UFC) e viabilidade celular, durante 16 dias de cultivo em meio PW modificado líquido, à 28 e 32ºC. Proteínas extracelulares foram extraídas e analisadas através da eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D-PAGE). Bioensaios foram utilizados para verificar a produção de moléculas sinais por X. fastidiosa. Os resultados obtidos mostraram que o crescimento de X. fastidiosa à 32ºC, com base na A600, não diferiu do crescimento à 28ºC. No entanto, com base no número de UFCs e viabilidade celular, o crescimento de X. fastidiosa diferiu em função da temperatura, tempos de incubação e a interação entre esses fatores. X. fastidiosa produziu maior número de proteínas extracelulares à 32 do que à 28ºC, mostrando que a secreção de proteínas em X. fastidiosa é regulada pela temperatura de incubação. Várias proteínas extracelulares produzidas por X. fastidiosa à 28 e 32ºC são moduladas durante o crescimento da bactéria. A maior parte das proteínas extracelulares produzidas por X. fastidiosa são proteínas ácidas e de massa molecular aparente entre 20-60 kDa. X. fastidiosa não sintetizou moléculas de lactonas de homoserina aciladas (LHAs) reconhecidas pelo sistema repórter utilizado, mas sintetizou uma molécula extracelular em meio de cultivo, semelhante ao DSF produzido por X. campestris pv. campestris, capaz de restaurar a atividade da endoglucanase através do sistema repórter utilizado. A concentração desta molécula em meio PW modificado foi dependente da densidade de células de X. fastidiosa no meio. / The bacterium Xylella fastidiosa is the causal agent of the citrus variegated chlorosis (CVC) and is responsible for significant economic losses in citriculture. The genome of X. fastidiosa has been completely sequenced and revealed several genes probably involved in pathogenicity/virulence. Since CVC symptoms are develop a long time after infection of plant by the bacterium and the severity of the disease has been associated with high temperatures, it’s possible that the expression of pathogenicity/virulence factors is dependent on cellular density and/or temperature stresses. Thus, the growth of X. fastidiosa in modified liquid PW medium was measured based on the absorbance of suspensions at (A600), number of colony-forming units (CFU) and cellular viability, during 16 days at 28 and 32ºC. Extracellular proteins were extracted and analysed by two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE). Bioassays were used to determine whether X. fastidiosa produces signal molecules involved in quorum perception. The results showed that temperatures of 28 and 32ºC did not affect the growth of the bacterium, based on A600. Temperatures of 28 and 32ºC, incubation times and the interaction of both factors affected bacterial growth based on CFU numbers and the cellular viability. X. fastidiosa produced higher number of extracellular proteins at 32 than at 28ºC, showing that protein secretion is dependent on growth temperature. Several extracellular proteins produced by X. fastidiosa at 28 and 32ºC were modulated the bacterial growth. Most of the extracellular proteins produced by X. fastidiosa were acidic with apparent molecular mass within 20-60 kDa. X. fastidiosa did not synthesize N-acyl homoserine lactone (AHL) recognizes by the reporter system used. However, it synthesized an extracellular molecule in modified PW medium, similar to DSF produced by X. campestris pv. campestris, which is able to restore endoglucanase activity by the reporter system. The concentration of this extracellular molecule produced by X. fastidiosa was dependent on cellular density.