Resumo: Seis cultivares de laranjeiras doces (Sanguínea, Olivelands, Vaccaro Blood, Folha Murcha, São Miguel e Finike) foram avaliadas no campo em quatro experimentos e cada experimento sobre um porta-enxerto (limoeiro 'Cravo', citrumeleiro 'Swingle', tangerineiras 'Sunki' e 'Cleópatra'). Durante a safra 2005/2006, foram avaliadas quanto às características que convencionalmente são atribuídas à qualidade dos frutos (massa, altura, diâmetro, rendimento de suco, teor de sólidos solúveis, acidez titulável e ratio). Na safra 2006/2007, foram quantificados os danos provocados pela Clorose Variegada dos Citros e, em ambas, quanto à produção de frutos e de sólidos solúveis por árvore. Na ocasião da colheita de cada cultivar, seus frutos mostraram-se semelhantes quanto às características químicas. As cultivares Olivelands e Finike destacaram-se em relação à produção de frutos, porém a 'Olivelands' se destacou também pela maior produção de sólidos solúveis por planta. Quanto a reação à CVC, houve diferenças entre as cultivares quanto à intensidade de doença e na produção de frutos de plantas sadias em comparação com as doentes, nos dois anos de avaliação. 'Olivelands' e 'Finike' apresentaram baixos índices de doença e pequena diferença na produção de frutos e sólidos entre suas plantas sadias e doentes, mostrando maior tolerância à infecção por Xilella fastidiosa. / Abstract: Six sweet orange cultivars (Sanguínea, Olivelands, Vaccaro Blood, Folha Murcha, San Miguel and Finike) were evaluated in four experiments. Each budded on a rootstock (Rangpur lime, 'Cleopatra' and 'Sunki' mandarins and 'Swingle' citrumelo). Over 2005/2006 season, the characteristics that are conventionally attributed to the fruits quality (weight, height, diameter, yield of juice, soluble solids, acidity and ratio) were evaluated. In the 2006/2007, the damage caused by Citrus Variegated Chlorosis, and in both, as the fruit and soluble solids yield per tree were quantified. At the each cultivar harvest, its fruits have shown similar chemical characteristics. 'Olivelands' and 'Finike' highlighted up to the fruit yield, but the 'Olivelands' stood out also by the increased production of soluble solids per tree. In reaction to Xilella fastidiosa infection, there were differences to the cultivars on the disease intensity and the fruit yield by healthy trees compared with patients in two years of evaluation. 'Olivelands' and 'Finike' showed low rates of disease and small difference in the fruit and soluble solids yield to their plants healthy and sick, showing greater tolerance to Xilella fastidiosa infection. / Orientador: Antonio Baldo Geraldo Martins / Coorientador: Eduardo Sanches Stuchi / Banca: Antonio de Goes / Banca: Francisco de Assis Alves Mourão Filho / Mestre

A clorose variegada dos citros (CVC) é um dos principais problemas que assolam a citricultura brasileira nos últimos dez anos. Essa doença, causada pela bactéria Xylella fastidiosa, determina menor produção das plantas infectadas e tem estreita relação com as condições climáticas, sendo sua severidade agravada em regiões com baixa disponibilidade hídrica, alta demanda atmosférica e elevadas temperaturas. A fotossíntese, que possue relação direta com a produtividade das plantas, é um dos processos fisiológicos afetados pela CVC. Esse trabalho visou investigar os efeitos da temperatura na fotossíntese de plantas infectadas pela X. fastidiosa e determinar como o processo fotossintético é afetado pela presença da bactéria. Para tanto, foram utilizadas mudas de laranjeira 'Pêra' (Citrus sinensis (L.) Osbeck), com aproximadamente 9 meses de idade, cultivadas em vasos plásticos de 3L. Foram realizados dois experimentos. No experimento I, mudas sadias e doentes foram dispostas em câmara de crescimento e submetidas por 7 dias a regimes de temperatura de 25/20 e 35/20ºC (dia/noite), com concentrações de CO2 e O2 atmosféricas, 14h de fotoperíodo, densidade de fluxo de fótons fotossintéticos (DFFF) de 600umol m -2 s -1 e déficit de pressão de vapor do ar de 1kPa. Foram realizadas medidas simultâneas de trocas gasosas [assimilação de CO2 (A); transpiração (E) e condutância estomática (gs)] e fluorescência da clorofila a [eficiência quântica potencial (Fv/Fm) e efetiva ( F/Fm')do fotossistema II, taxa aparente de transporte de elétrons (ETR) e coeficientes de extinção fotoquímica (qP) e não-fotoquímica (NPQ) da fluorescência] em tecidos intactos, nas temperaturas de 25, 30, 35 e 40ºC. No experimento II, foram realizadas curvas de resposta da produção de oxigênio fotossintético (Ao) em função de DFFF e curvas de indução de Ao, com medidas simultâneas de Ao, DF/Fm', ETR, qP e NPQ, em discos foliares, nas temperaturas de 35 e 45ºC. No experimento I, as plantas com CVC apresentaram valores inferiores de A, E e gs, sendo que as diferenças entre plantas sadias e doentes foram maiores no regime de temperatura de 35/20ºC, onde foram registrados os maiores valores de A, E e gs. Essas variáveis tenderam a decrescer com o aumento da temperatura (de 25 para 40ºC), alcançando valores mínimos a 40ºC em ambos regimes de temperatura. No experimento I, a CVC não influenciou DF/Fm', ETR, qP e NPQ, porém, Fv/Fm das plantas com CVC foi superior em todas as medidas. As variáveis mais influenciadas pela temperatura foram DF/Fm', ETR e qP, as duas primeiras decrescendo e a última aumentando com o aumento da temperatura de medida. Os maiores valores de Fv/Fm , DF/Fm', ETR, qP e NPQ foram registrados no regime de 35/20ºC, confirmando que essas condições foram mais favoráveis à atividade fotossintética das plantas. No experimento II, as plantas sadias apresentaram os maiores valores de Ao, DF/Fm', ETR, qP e NPQ nas medidas efetuadas a 35ºC. A presença da bactéria afetou a indução de Ao em ambas temperaturas, porém as diferenças em DF/Fm', ETR, qP e NPQ foram encontradas apenas a 35ºC. Esses resultados indicaram que o aumento da temperatura afetou o sistema planta-patógeno agravando as disfunções no metabolismo fotossintético das plantas com CVC. A menor fotossíntese de laranjeira 'Pêra' infectada pela X. fastidiosa é atribuída a menor condutância estomática, comprometimento de reações bioquímicas e aumento da atividade fotorrespiratória. / The citrus variegated chlorosis (CVC) has became a great problem for the Brazilian citriculture during the last ten years. CVC, caused by the bacterium Xylella fastidiosa, causes a strong decrease in production of infected plants. Higher severities of the disease have been reported in areas with water deficit, high atmospheric demand and high temperatures. Photosynthesis, which has direct relationship with plant productivity, is a physiological process affected by CVC. The objectives of this study were to determine the effects of temperature upon photosynthesis of infected plants and to evaluate how the photosynthetic apparatus is affected by the presence of the bacterium. In order to achieve these objectives, two experiments (I and II) were carried out, using 9 months-old seedlings of sweet orange 'Pêra' (Citrus sinensis (L.) Osbeck), grown in 3L plastic pots under greenhouse conditions. In experiment I, prior to measurements, healthy and infected plants were moved to a plant growth chamber and exposed to temperature regimes of 25/20 and 35/20ºC (day/night) during 7 days each, CO2 and O2 atmospheric concentrations, 14h photoperiod, photosynthetically active radiation (PAR) of 600mmol m-2 s-1 and air vapor pressure difference of about 1 kPa. Simultaneous measurements of leaf gas exchange [CO2 assimilation (A); transpiration (E) and stomatal conductance (gs)] and chlorophyll fluorescence [potential (Fv/Fm) and effective (DF/Fm') quantum yield of photosystem II, apparent electron transport rate (ETR) and photochemical (qP) and non-photochemical (NPQ) fluorescence quenching] were taken in intact leaves, at 25, 30, 35 and 40ºC. In experiment II, light curves of photosynthetic oxygen evolution (Ao), and curves of photosynthesis induction were carried out, with simultaneous measurements of Ao, DF/Fm', ETR, qP and NPQ in leaf discs, at 35 and 45ºC. In experiment I, infected plants shown decrease in A, E and gs, and the differences between healthy and infected plants were greater at 35/20ºC, where the largest values of A, E and gs were observed. These variables decreased with increasing temperature, reaching minimum values at 40ºC for both temperature regimes. In experiment I, no differences between healthy and infected plants regarding chlorophyll fluorescence variables were observed. However, Fv/Fm of infected plants was higher in all conditions. The three most influenced variables by temperature were DF/Fm', ETR and qP, whereas the two first decreased while the last increased with increasing temperature. Largest values of Fv/Fm, DF/Fm', ETR, qP and NPQ were registered at 35/20ºC, confirming that this temperature regime was more adequate to plant photosynthetic activity. In experiment II, healthy plants showed the largest values of Ao, DF/Fm', ETR, qP and NPQ at 35ºC. The presence of the bacterium affected Ao induction in both temperatures, however, differences in DF/Fm', ETR, qP and NPQ for healthy and infected plants were only found at 35ºC. Results from this study indicated that increase in temperature affected the plant-pathogen system, amplifying the malfunction of the photosynthetic metabolism of infected plants. The smallest photosynthetic rates of sweet orange 'Pêra' infected by X. fastidiosa were caused by low stomatal conductance, biochemical injuries and photorespiratory activity.

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A clorose variegada dos citros (CVC) é um dos principais problemas que assolam a citricultura brasileira nos últimos dez anos. Essa doença, causada pela bactéria Xylella fastidiosa, determina menor produção das plantas infectadas e tem estreita relação com as condições climáticas, sendo sua severidade agravada em regiões com baixa disponibilidade hídrica, alta demanda atmosférica e elevadas temperaturas. A fotossíntese, que possue relação direta com a produtividade das plantas, é um dos processos fisiológicos afetados pela CVC. Esse trabalho visou investigar os efeitos da temperatura na fotossíntese de plantas infectadas pela X. fastidiosa e determinar como o processo fotossintético é afetado pela presença da bactéria. Para tanto, foram utilizadas mudas de laranjeira 'Pêra' (Citrus sinensis (L.) Osbeck), com aproximadamente 9 meses de idade, cultivadas em vasos plásticos de 3L. Foram realizados dois experimentos. No experimento I, mudas sadias e doentes foram dispostas em câmara de crescimento e submetidas por 7 dias a regimes de temperatura de 25/20 e 35/20ºC (dia/noite), com concentrações de CO2 e O2 atmosféricas, 14h de fotoperíodo, densidade de fluxo de fótons fotossintéticos (DFFF) de 600umol m -2 s -1 e déficit de pressão de vapor do ar de 1kPa. Foram realizadas medidas simultâneas de trocas gasosas [assimilação de CO2 (A); transpiração (E) e condutância estomática (gs)] e fluorescência da clorofila a [eficiência quântica potencial (Fv/Fm) e efetiva ( F/Fm')do fotossistema II, taxa aparente de transporte de elétrons (ETR) e coeficientes de extinção fotoquímica (qP) e não-fotoquímica (NPQ) da fluorescência] em tecidos intactos, nas temperaturas de 25, 30, 35 e 40ºC. No experimento II, foram realizadas curvas de resposta da produção de oxigênio fotossintético (Ao) em função de DFFF e curvas de indução de Ao, com medidas simultâneas de Ao, DF/Fm', ETR, qP e NPQ, em discos foliares, nas temperaturas de 35 e 45ºC. No experimento I, as plantas com CVC apresentaram valores inferiores de A, E e gs, sendo que as diferenças entre plantas sadias e doentes foram maiores no regime de temperatura de 35/20ºC, onde foram registrados os maiores valores de A, E e gs. Essas variáveis tenderam a decrescer com o aumento da temperatura (de 25 para 40ºC), alcançando valores mínimos a 40ºC em ambos regimes de temperatura. No experimento I, a CVC não influenciou DF/Fm', ETR, qP e NPQ, porém, Fv/Fm das plantas com CVC foi superior em todas as medidas. As variáveis mais influenciadas pela temperatura foram DF/Fm', ETR e qP, as duas primeiras decrescendo e a última aumentando com o aumento da temperatura de medida. Os maiores valores de Fv/Fm , DF/Fm', ETR, qP e NPQ foram registrados no regime de 35/20ºC, confirmando que essas condições foram mais favoráveis à atividade fotossintética das plantas. No experimento II, as plantas sadias apresentaram os maiores valores de Ao, DF/Fm', ETR, qP e NPQ nas medidas efetuadas a 35ºC. A presença da bactéria afetou a indução de Ao em ambas temperaturas, porém as diferenças em DF/Fm', ETR, qP e NPQ foram encontradas apenas a 35ºC. Esses resultados indicaram que o aumento da temperatura afetou o sistema planta-patógeno agravando as disfunções no metabolismo fotossintético das plantas com CVC. A menor fotossíntese de laranjeira 'Pêra' infectada pela X. fastidiosa é atribuída a menor condutância estomática, comprometimento de reações bioquímicas e aumento da atividade fotorrespiratória. / The citrus variegated chlorosis (CVC) has became a great problem for the Brazilian citriculture during the last ten years. CVC, caused by the bacterium Xylella fastidiosa, causes a strong decrease in production of infected plants. Higher severities of the disease have been reported in areas with water deficit, high atmospheric demand and high temperatures. Photosynthesis, which has direct relationship with plant productivity, is a physiological process affected by CVC. The objectives of this study were to determine the effects of temperature upon photosynthesis of infected plants and to evaluate how the photosynthetic apparatus is affected by the presence of the bacterium. In order to achieve these objectives, two experiments (I and II) were carried out, using 9 months-old seedlings of sweet orange 'Pêra' (Citrus sinensis (L.) Osbeck), grown in 3L plastic pots under greenhouse conditions. In experiment I, prior to measurements, healthy and infected plants were moved to a plant growth chamber and exposed to temperature regimes of 25/20 and 35/20ºC (day/night) during 7 days each, CO2 and O2 atmospheric concentrations, 14h photoperiod, photosynthetically active radiation (PAR) of 600mmol m-2 s-1 and air vapor pressure difference of about 1 kPa. Simultaneous measurements of leaf gas exchange [CO2 assimilation (A); transpiration (E) and stomatal conductance (gs)] and chlorophyll fluorescence [potential (Fv/Fm) and effective (DF/Fm') quantum yield of photosystem II, apparent electron transport rate (ETR) and photochemical (qP) and non-photochemical (NPQ) fluorescence quenching] were taken in intact leaves, at 25, 30, 35 and 40ºC. In experiment II, light curves of photosynthetic oxygen evolution (Ao), and curves of photosynthesis induction were carried out, with simultaneous measurements of Ao, DF/Fm', ETR, qP and NPQ in leaf discs, at 35 and 45ºC. In experiment I, infected plants shown decrease in A, E and gs, and the differences between healthy and infected plants were greater at 35/20ºC, where the largest values of A, E and gs were observed. These variables decreased with increasing temperature, reaching minimum values at 40ºC for both temperature regimes. In experiment I, no differences between healthy and infected plants regarding chlorophyll fluorescence variables were observed. However, Fv/Fm of infected plants was higher in all conditions. The three most influenced variables by temperature were DF/Fm', ETR and qP, whereas the two first decreased while the last increased with increasing temperature. Largest values of Fv/Fm, DF/Fm', ETR, qP and NPQ were registered at 35/20ºC, confirming that this temperature regime was more adequate to plant photosynthetic activity. In experiment II, healthy plants showed the largest values of Ao, DF/Fm', ETR, qP and NPQ at 35ºC. The presence of the bacterium affected Ao induction in both temperatures, however, differences in DF/Fm', ETR, qP and NPQ for healthy and infected plants were only found at 35ºC. Results from this study indicated that increase in temperature affected the plant-pathogen system, amplifying the malfunction of the photosynthetic metabolism of infected plants. The smallest photosynthetic rates of sweet orange 'Pêra' infected by X. fastidiosa were caused by low stomatal conductance, biochemical injuries and photorespiratory activity.

Xylella fastidiosa é uma bactéria com alta diversidade genética, sendo responsável por várias doenças, com destaque para a clorose variegada dos citros (CVC) e Pierce\'s disease (PD) em videira. O sucesso da transmissão dessa bactéria depende da colonização em biofilme no xilema da planta e no estomodeu de vetores, que são cigarrinhas (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). O conhecimento sobre o mecanismo de transmissão desta bactéria vem de estudos com a subespécie fastidiosa de videira. Com relação à CVC, que tem a subespécie pauca como agente causal, observa-se eficiência de transmissão mais baixa que em videira, indicando que os mecanismos envolvidos no processo de transmissão podem variar entre subespécies da bactéria. Neste sentido, os objetivos desse trabalho foram: i) adaptar e validar um sistema de alimentação em dieta artificial para a aquisição e transmissão de estirpes de X. fastidiosa subsp. pauca por cigarrinhas; ii) aplicar a técnica estabelecida para investigar a eficiência de transmissão variando-se os sequence types (STs) de X. fastidiosa subsp. pauca e as espécies de cigarrinhas e iii) avaliar a importância da adesina XadA2 para a formação de biofilme por X. fastidiosa em superfície de polissacarídeos, bem como na aquisição e transmissão dessa bactéria pelos insetos. Verificou-se que o protocolo de aquisição usado para a entrega de células bacterianas da estirpe Temecula (subsp. fastidiosa) é transferível para estirpes da subsp. pauca. No entanto, diferentemente de fastidiosa, as estirpes de pauca testadas não necessitam interagir com o monômero de pectina (ácido galacturônico) para serem transmitidas para plantas. Com o sistema de aquisição in vitro, observou-se que todas as combinações STs de pauca e espécies de cigarrinhas resultaram na transmissão para plantas, indicando a ausência de especificidade de vetores. Todavia observaram-se diferenças nas taxas de aquisição e transmissão, que podem estar relacionadas com a interação inseto-ST. Em ensaios utilizando X. fastidiosa modificada com green fluorescent protein, incubada em meio de cultivo sem fonte de carbono e contendo asas como única fonte de carboidratos, verificou-se que a bactéria utiliza a quitina das asas para garantir a sobrevivência da colônia. Por meio de ensaios de bloqueio em asas, utilizando a adesina XadA2 e seu anticorpo específico como moléculas competidoras, foi possível observar que quando a adesina é bloqueada, há a redução significativa da formação de biofilme nas asas. Utilizando-se o sistema in vitro para a entrega de células de X. fastidiosa e do anticorpo para as cigarrinhas, observou-se diminuição da taxa de insetos infectivos, porém não houve diferença estatística nas taxas de transmissão. Esses resultados mostram que a adesina XadA2 é importante no início da colonização bacteriana no inseto e, juntamente com o método de aquisição in vitro adaptado nesse trabalho, estabelecem bases para estudos com outras estirpes ou subespécies de X. fastidiosa, e avaliação de outras proteínas-alvo visando o bloqueio da interação bactéria-vetor e, possivelmente, o controle das doenças. / Xylella fastidiosa is a bacterium with high genetic diversity, being responsible for several diseases, with emphasis on citrus variegated chlorosis (CVC) and Pierce\'s disease (PD) on grapevines. The success of the transmission of this bacterium depends on the biofilm colonization in the plant xylem and in the foregut of vectors, the sharpshooters (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). The knowledge about the transmission mechanism of this bacterium comes from studies with the fastidiosa subspecies of grapevine. With regard to CVC, which has the subspecies pauca as causal agent, transmission efficiency is lower than in vine, indicating that the mechanisms involved in the transmission process may vary between subspecies of the bacterium. In this sense, the objectives of this work were: i) to adapt and validate an artificial diet feeding system for the acquisition and transmission of strains of X. fastidiosa subsp. pauca by sharpshooters; ii) apply the established technique to investigate the efficiency of transmission by varying the sequence types (STs) of X. fastidiosa subsp. pauca and sharpshooters and iii) to evaluate the importance of XadA2 adhesin for X. fastidiosa biofilm formation on the surface of polysaccharides, as well as on the acquisition and transmission of this bacterium by the insects. The acquisition protocol used for the delivery of Temecula strain bacterial cells (subspecies fastidiosa) was transferable to strains of the subspecies pauca. However, unlike fastidiosa, the tested pauca strains do not need to interact with the pectin monomer (galacturonic acid) to be transmitted to plants. With the in vitro acquisition system, it was observed that all STs pauca and sharpshooter species combinations resulted in the transmission to plants, indicating the absence of vector specificity. However, there were differences in acquisition and transmission rates, which may be related to the insect-ST interaction. In tests using X. fastidiosa modified with green fluorescent protein, incubated in culture medium without carbon source and containing wings as only source of carbohydrates, it was verified that the bacterium uses the chitin of the wings to guarantee the survival of the colony. With wing-blocking assays, using XadA2 adhesin and its specific antibody as competing molecules, it was possible to observe that when adhesin is blocked, there is a significant reduction of biofilm formation in the wings. Using the in vitro system for the delivery of X. fastidiosa cells and the antibody to the sharpshooters, a decrease in the rate of infective insects was observed, but there was no statistical difference in the rates of transmission. These results show that XadA2 adhesin is important at the beginning of bacterial colonization in the insect and, together with the in vitro acquisition method adapted in this work, establishes bases for studies with other strains or subspecies of X. fastidiosa, and evaluation of other target proteins to block bacterial-vector interaction and, possibly, to control of the diseases.

Xylella fastidiosa (Xf) é o agente causal de doenças em várias culturas economicamente importantes. Recentemente foi identificada como sendo o agente causal da clorose variegada dos citros (CVC), doença que representa um grande problema para os citricultores paulistas, pois vem causando perdas econômicas significativas. Trata-se de uma bactéria gram-negativa, fastidiosa e restrita ao xilema das plantas hospedeiras. Um fato observado na interação Xf - citros, é que plantas infectadas por Xf podem demonstrar sintomas da doença um longo tempo após a infecção. Isto faz supor que a expressão de fatores de patogenicidade e/ou virulência ocorre somente após a população de Xf na planta atingir altas densidades celulares. Como fatores de patogenicidade/virulência de algumas bactérias são regulados por sensores de quorum, seria interessante determinar se esse mecanismo de regulação gênica ocorre em Xf, e quais genes bacterianos são regulados por densidade celular. O objetivo deste trabalho foi verificar se genes de patogenicidade putativos de Xf são modulados pela densidade celular em meio de cultura. Para tal, Xf foi cultivada em PW líquido, células no início da fase exponencial (baixa densidade celular) e na fase estacionária (alta densidade celular) foram coletadas, e RNA total foi extraído. Fragmentos de 20 genes de Xf relacionados à patogenicidade putativos foram transferidos em arranjos ordenados para membranas de náilon, e hibridizados, sob condições de alta estringência, com sondas complexas de primeiras fitas de cDNA marcadas com fosfatase alcalina. A detecção foi feita por quimioluminescência. Sob as condições experimentais utilizadas, os genes fur (XF-2344), gumC (XF-2369), protease-serina (XF-1851) e rsmA (XF-0125) tiveram sua expressão significativamente suprimida sob condições de alta densidade celular (p < 0,05). Já a expressão de rpfF (XF-1115) foi induzida significativamente (p < 0,06) sob condições de alta densidade celular. Os genes gumD (XF-2367), gumJ (XF-2362) e rpfA (XF-0290) tiveram a expressão detectada somente sob condições de alta densidade celular, enquanto a expressão de rpfB (XF-0287) foi detectada somente sob condições de baixa densidade celular. A expressão de celulase (XF0818), mdoH (XF-1623), pluxR (XF-0972), protease-RE (XF-1823), rpoN (XF-1408), xpsK (XF-1523) e xpsL (XF-1524) não foi afetada significativamente pela densidade populacional em meio PW, enquanto a expressão dos genes luxR/UHPA (XF-2608), poligalacturonase (XF-2466), rpfC (XF-1114) e rsmB (XF-0928) não foi detectada em ambas as condições. Usando RT-PCR, os transcritos de todos os genes, exceto gumC, foram detectados sob condições de baixa e alta densidade celular, indicando que a expressão de alguns genes relacionados à patogenicidade putativos em meio de cultura é muito baixa. Os resultados obtidos sugerem que os EPS são sintetizados por Xf predominantemente em condições de alta densidade celular em meio PW. Adicionalmente, os dados sugerem que Xf sintetiza uma molécula sinal similar à de Xcc em meio PW sob condições de alta densidade celular, e que a disponibilidade de ferro pode ser importante para a regulação gênica em condições de alta densidade celular. É possível que o padrão de expressão gênica observado possa ser alterado em função do meio de cultivo ou in planta. / Xylella fastidiosa (Xf) is the causal agent of several economically important plant diseases. Recently, Xf has been identified as the causal agent of citrus variegated chlorosis (CVC), a disease that represents a major economic problem for citrus growers in the São Paulo State. Xf is a gram-negative, fastidious and xylem-limited bacterium. Based on the fact that plants may show disease symptoms a long time after infection in Xf-citrus interaction, we hypothesize that the expression of pathogenicity/virulence factors in Xf occurs after the bacterial population reach high cell densities. Since pathogenicity/virulence factors of some bacteria are quorum-sensing regulated, it would be interesting to determine whether this mechanism of genetic regulation occurs in Xf, and which genes are regulated by cell-density. In order to determine whether Xf putative pathogenesis-related genes are modulated by cell-density in culture media, Xf was grown in liquid PW and cells were sampled at early log (low cell density) and stationary phase (high cell density) and total RNA was extracted. Fragmentos of 20 putative pathogenicity-related genes from Xf were hybridized on ordered arrays nylon membranes to alkaline phosphatase-labeled first strand cDNA from low and high celldensity conditions as probes, at high stringency conditions. Detection was performed using chemiluminescence. Our results indicate that the following putative pathogenicity-related genes are significantly suppressed (p < 0.05) at high cell-density conditions: fur (XF-2344), gumC (XF-2369), serine-protease (XF-1851) and rsmA (XF-0125). The expression of rpfF (XF-1115) was significantly induced (p < 0.06) at high cell-density conditions. Expression of gumD (XF-2367), gumJ (XF-2362) and rpfA (XF-0290) was detected only at high cell-density conditions, whereas expression of rpfB (XF-0287) was detected only at low cell-density conditions. The expression of cellulase (XF0818), mdoH (XF-1623), pluxR (XF-0972), protease-RE (XF-1823), rpoN (XF-1408), xpsK (XF-1523) and xpsL (XF-1524) was not affected by the Xf population density in PW medium, whereas expression of luxR/UHPA (XF-2608), polygalacturonase (XF-2466), rpfC (XF-1114) and rsmB (XF-0928) was not detected under our experimental conditions. Using RT-PCR, transcripts for all genes, except gumC, were detected under low or high cell densities, indicating that the expression of some putative pathogenesis-related genes in culture medium is very low. Our results suggest that EPS may be synthesized by Xf mainly at high cell density conditions in PW medium. Additionally, our data suggest that Xf may synthesize a signal molecule similar to the Xcc in PW medium at high cell density conditions, and that iron availability may be important for gene regulation at high cell density conditions. It is possible that gene expression patterns observed under our experimental conditions may be altered with the culture medium used or when Xf grows in planta.

Xylella fastidiosa é o agente causal de uma série de doenças que ocorrem em plantas economicamente importantes como laranjeiras, videiras e cafeeiros, causando no Estado de São Paulo prejuízos relevantes à indústria citrícola. Esta bactéria Gram-negativa é restrita ao xilema das plantas e à porção anterior do trato digestório dos insetos vetores das famílias Cicadellidae e Cercopidae, conhecidos como cigarrinhas. Tentativas de elucidar os mecanismos de virulência e patogenicidade adotados por esta bactéria apontam a formação do biofilme como etapa fundamental para o estabelecimento da infecção e o consequente desenvolvimento da doença na planta, mas fatores adicionais parecem contribuir, tais como a produção de toxinas. As bacteriocinas são proteínas com atividade antibiótica contra cepas próximas à espécie produtora e que já foram associadas à virulência e patogenicidade de outras bactérias. Uma varredura in silico no genoma de X. fastidiosa 9a5c revelou 13 sequências codificadoras de microcinas putativas no cromossomo. Transcritos de todos esses genes foram detectados por RT-qPCR em culturas de X. fastidiosa 9a5c, e análises comparativas com genomas públicos (cepas Temecula1, Dixon, Ann-1, M23, M12, EB92-1 e GB514) e recém sequenciados por nosso grupo de pesquisa (cepas U24d, J1a12, 3124, Hib4, Pr8x e Fb7) revelaram que cada cepa possui seu próprio arsenal de bacteriocinas. Diferenças encontradas in silico entre os loci de bacteriocinas nas cepas foram demonstradas experimentalmente. Nossos resultados comprovam a variabilidade predita nos quatro clusters de bacteriocinas que identificamos, o que é esperado para genes relacionados à adaptação e patogenicidade. Destes loci, três foram detectados por RT-PCR como transcritos policistrônicos. Nossa tentativa de detectar essas proteínas em culturas de X. fastidiosa (através de sequenciamento de polipeptídeos por HPLC-MS/MS) foi capaz de identificar uma das bacteriocinas putativas e, portanto, o conjunto de nossas observações apóia a continuidade dos estudos para elucidar o papel das bacteriocinas na fisiopatologia de X. fastidiosa. / Xylella fastidiosa is the causal agent of diseases that affect several economically important crops such as sweet orange trees, grapevines and coffee trees, causing in the State of São Paulo considerable losses mainly to the citrus industry. This Gram-negative bacterium is restricted to the plant xylem and to the upper gastrointestinal tract of its insect vectors, the sharpshooters from the Cicadellidae and Cercopidae families. Attempts to elucidate the virulence and pathogenicity pathways employed by this bacterium point the biofilm formation as a fundamental step for the establishment of the infection and the consequent development of the plant disease, but additional factors seem to contribute to these processes, such as the production of toxins. Bacteriocins are proteinaceous antibiotics that act against closely-related species and have been previously associated with virulence and pathogenicity in other bacteria. An in silico screening of the X. fastidiosa 9a5c genome revealed 13 coding sequences as putative microcins in the chromosome. Transcripts from all those genes were detected through RT-qPCR in X. fastidiosa 9a5c cultures, and comparative analyses on the public genomes (Temecula1, Dixon, Ann-1, M23, M12, EB92-1 and GB514) plus the ones recently sequenced by our group (U24d, J1a12, 3124, Hib4, Pr8x and Fb7) revealed that each strain possesses its own arsenal of bacteriocins. Differences found in silico among the loci in all strains were experimentally confirmed. Our results demonstrated the predicted variability in the four bacteriocins clusters as expected for adaptation and pathogenicity-related genes. Three out of the four bacteriocins loci were detected by RT-PCR as polycistronic transcripts. Our attempt to detect these proteins in X. fastidiosa cultures (using HPLC-MS/MS polypeptide sequencing) identified one of the putative bacteriocins, and therefore our observations warrant further efforts to elucidate the role of bacteriocins in the X. fastidiosa physiopathology.

Clorose Variegada dos Citros (CVC), causada pela bactéria Xylella fastidiosa Wells et al., tem causado grandes perdas na citricultura do estado de São Paulo, afetando cerca de 40% das plantas de laranja doce. A bactéria é transmitida por 12 espécies de cigarrinhas sugadoras de xilema (Hemiptera: Cicadellidae) da subfamília Cicadellinae. O manejo da CVC é baseado no plantio de mudas sadias, poda ou eliminação de árvores infectadas no campo, assim como o controle químico dos vetores. No entanto, as cigarrinhas vetoras possuem hábitats e hospedeiros alternativos que servem como refúgio, particularmente na vegetação adjacente aos pomares cítricos. Esta característica ecológica explica a rápida reinfestação dos pomares de laranja pelas cigarrinhas após a aplicação de inseticidas. O uso de plantas hospedeiras atrativas às cigarrinhas em uma estratégia de plantio-isca poderia reduzir a imigração de vetores da vegetação adjacente. O objetivo deste trabalho foi selecionar plantas hospedeiras adequadas para serem usadas neste tipo de estratégia, assim como testar a eficácia do plantio-isca em reduzir a população de cigarrinhas em um pomar de laranja. Experimentos de livre escolha foram conduzidos sob condições de casa-de-vegetação para avaliar a preferência de dois importantes vetores, Bucephalogonia xanthophis (Berg.) e Oncometopia facialis (Signoret) por plantas hospedeiras alternativas em relação à Citrus sinensis (L.) Osbeck (laranja doce). As espécies vegetais preferidas por B. xanthophis foram Baccharis dracunculifolia DC., Duranta repens L., Eupatorium maximiliani Shrad., E. laevigatum Lam. e Vernonia condensata Baker, enquanto que O. facialis apresentou preferência por D. repens e Lantana camara L. Um segundo estudo em casa-de-vegetação foi conduzido para avaliar o efeito da fertilização com níveis variados de nitrogênio sobre a preferência de B. xanthophis por uma das plantas hospedeiras selecionadas, V. condensata. Maiores porcentagens de adultos de B. xanthophis selecionaram plantas que haviam sido tratadas com doses mais elevadas de nitrogênio, até um limiar máximo. Em condições de campo (Fazenda Oxford, Gavião Peixoto, SP), 14 espécies de hospedeiros alternativos de cigarrinhas, incluindo plantas preferidas nos testes de livre escolha, foram avaliadas com respeito ao desenvolvimento vegetativo e incidência natural de cigarrinhas. Essas espécies foram plantadas em cinco linhas de 50 m (com espaçamento de 1 m entre linhas e 1 m entre plantas) entre um pomar de laranja doce e uma área de brejo (fonte de vetores) de maneira a formar um plantio-isca. Para avaliar o efeito do plantio-isca na migração de cigarrinhas de cigarrinhas da área de brejo, a população de vetores foi monitorada por armadilhas adesivas amarelas no interior de dois subtalhões no mesmo pomar de laranja, um separado do brejo pelo plantio-isca e outro sem esta barreira. Este monitoramento foi conduzido por vários meses antes e depois que o plantio-isca foi tratado com inseticidas sistêmicos. A população de vetores foi significantemente reduzida no subtalhão adjacente ao plantio-isca, após as plantas hospedeiras serem tratadas com inseticidas. Durante o período de amostragem antes do tratamento com inseticidas, observou-se uma queda na população de cigarrinhas da borda para o interior do subtalhão vizinho ao plantio-isca. Aloysia virgata (Ruiz & Pav.) Juss., Croton urucurana Baill., L. camara, e V. condensata foram consideradas as espécies mais adequadas para uso em plantio-isca porque são plantas atrativas às cigarrinhas e possuem rápido desenvolvimento e emissão de brotos após plantio ou poda. / Citrus variegated chlorosis (CVC), caused by Xylella fastidiosa Wells et al. has caused great losses in the citriculture of São Paulo State, affecting over 40% of the citrus plants. The bacterium is transmitted by 12 species of xylem-feeding leafhoppers (Hemiptera: Cicadellidae) in the subfamily Cicadellinae, commonly known as sharpshooters. CVC management is based on planting of healthy nursery trees, pruning or roguing of infected trees in the field as well as vector control. However, the sharpshooter vectors have alternative hosts and habitats that serve as refuge, particularly woody vegetation adjacent to the citrus groves. This ecological characteristic explains the rapid reinfestation of citrus groves by vectors after insecticide applications. The use of attractive alternative hosts plants of sharpshooters in a dead-end trap cropping strategy could reduce immigration of vectors from adjacent vegetation. The goal of this research was to select adequate host plants to be used in such strategy, as well as to test the efficacy of trap cropping for reducing sharpshooter populations in a citrus grove. Choice experiments were carried out under greenhouse conditions to evaluate the preference of two important vectors, Bucephalogonia xanthophis (Berg.) and Oncometopia facialis (Signoret), for alternative host plants in relation to Citrus sinensis (L.) Osbeck (sweet orange). Preferred plant species by B. xanthophis were Baccharis dracunculifolia DC., Duranta repens L., Eupatorium maximiliani Shrad., E. laevigatum Lam. and Vernonia condensata Baker, whereas O. facialis showed strong preference for D. repens e Lantana camara L. A second greenhouse study was conducted to evaluate the effect of fertilization with variable nitrogen levels on the preference of B. xanthophis for one of the selected host plants, V. condensata. Higher percentages of B. xanthophis adults selected plants that had been treated with higher doses of nitrogen, up to a threshold. Under field conditions (Fazenda Oxford, Gavião Peixoto, SP), 14 alternative hosts of the sharpshooters, including preferred host plants in the choice experiments, were evaluated with respect to vegetative growth and natural incidence of sharpshooters. These species were planted in five rows of 50 m (spaced 1 m in a row and 1 m between plants) between a sweet orange grove and a swamp (source of vectors), in order to form a trap crop. In order to assess the effect of the trap crop against immigration of sharpshooters from the swamp area, vector population was monitored by yellow sticky cards inside two adjacent plots in the same citrus grove, one separated from the swamp by the trap crop and the other without this barrier. Populations in the two citrus plots were monitored for several months before and after the trap crop was treated with a insecticide. Vector population was significantly reduced in the citrus plot adjacent the trap crop, after the alternative host plants were treated with insecticide. During the period of sampling before the insecticide treatments, a pattern of lower vector populations in rows of citrus trees closer to the trap crop was observed. Aloysia virgata (Ruiz & Pav.) Juss., Croton urucurana Baill., L. camara, and V. condensata were considered the most adequate species for trap cropping because of their attractiveness to the sharpshooters and rapid flushing and growth after planting or pruning.

O presente trabalho objetivou estudar tanto o progresso da Clorose Variegada dos Citros no tempo, quanto o arranjo espacial das plantas afetadas, visando caracterizar a dinâmica da doença em três regiões do Estado de São Paulo (Noroeste, Centro e Sul). Por meio de avaliação de sintomas visuais, foram mapeados, bimensalmente, três talhões de laranja-doce Pêra enxertada em limão Cravo, em três regiões do Estado de São Paulo, desde julho de 1998 até dezembro de 2000. O progresso no tempo foi avaliado por meio de ajuste a modelos matemáticos e análise das curvas de derivada. As curvas de progresso da CVC não puderam ser ajustadas a modelos conhecidos. O progresso da CVC apresentou diversos picos de derivada, em sua maioria coincidindo com a primavera e o verão. Para o estudo da dinâmica espacial, foram aplicadas as seguintes análises: seqüências ordinárias; áreas isópatas; lei de Taylor modificada; índice de dispersão e análise de dinâmica e estrutura de focos. Essas análises demonstraram pouca diferença no padrão espacial da doença entre as regiões, que pode ser considerado levemente agregado. Por meio de análise de autocorrelação, de densidade espectral, análise discriminante, e correlação de lags, procurou-se também estabelecer padrões na evolução de emissão de brotações pelas plantas, expressão de sintomas e detecção de infecções assintomáticas e a correlação dessas variáveis entre si e com o clima. Também foi feita a comparação entre estações do ano e regiões por meio de testes não-paramétricos. Número de novas brotações foi a variável que mais distinguiu entre as três regiões. As variáveis relacionadas à doença (infecções assintomáticas, infecções totais, sintomas e concentração bacteriana) apresentaram padrões sazonais, mas não foi observada diferença estatística entre as estações do ano. O pomar da região Noroeste apresentou maior quantidade de brotações novas e maior quantidade de sintomas. O pomar da região Sul apresentou maior quantidade de infecção assintomática. Não houve diferença de concentração bacteriana entre os pomares das três regiões. / This work aimed to evaluate the progress and spatial pattern of Citrus Variegated Chlorosis (CVC) in three regions in the state of São Paulo, Brazil. By bimonthly visual assessments three Pêra sweet orange/ Rangpur lime orchards in three regions (Northwest, Center and South) were mapped from july 1998 to december 2000. Progress was evaluated by fitting nine models do disease progress curves and by analysis of derivative curves. No model could be fitted to disease progress curves. Derivative curves showed peaks concentrated in spring and summer. To characterize spatial pattern the following analysis were used: ordinary runs, isopath areas;binary Taylor law; dispersion index and foci dynamics and structure analysis. All techniques showed small differences between regions and characterized CVC spatial pattern as slightly aggregated. By means of autocorrelation, spectral density analysis, discriminant analysis and lag correlation was tried to establish temporal patterns for vegatative flush emission, symptom expression, detection of assymptomatic infections. Also, was tried to establish correlations among variables and between them and weather variebles. A comparison by non-parametric tests was made between seasons and regions. Number of new vegetative flushes was the most distinctive variables for regions. The disease related variables (assymptomatic infections, total infection, symptoms and relative bacteria concentration) showed seasonal patterns but no statistical difference was found between seasons. Northwest orchard showed higher number of vegetative flushes. South orchard assymptomatic infections were higher than for the other orchards. There was no difference in relative bacteria concentration between regions.

O trabalho teve por objetivo avaliar a capacidade de infecção e multiplicação de estirpes de Xylella fastidiosa de citros [Citrus sinensis (L.) Osbeck] e de cafeeiro (Coffea arabica L.) em inoculações cruzadas, para investigar a possibilidade de disseminação deste patógeno de pomares cítricos infectados para cafezais ou vice versa. As inoculações foram realizadas mecanicamente com um isolado (CCT6570) de X. fastidiosa proveniente de árvore cítrica com clorose variegada dos citros (CVC) e um isolado (CCT6756) de planta de café com sintomas de atrofia dos ramos do cafeeiro (ARC). Quatro concentrações de células de cada isolado, variando de 10 3 a 10 9 unidades formadoras de colônias (UFC) por mL, foram inoculadas por agulha em citros e cafeeiro, para determinação de curvas de titulação e doses efetivas para infecção em cada combinação estirpe/hospedeiro. As plantas foram avaliadas por "polymerase chain reaction" (PCR) e isolamento em meio de cultura quanto à infecção por X. fastidiosa e população bacteriana, após 0,5; 2; 4 e 8 meses da inoculação. A estirpe de cafeeiro (ARC) de X. fastidiosa não colonizou citros nas concentrações de inóculo testadas. A inoculação da estirpe de citros (CVC) em cafeeiro resultou em baixas taxas de infecção, exigindo uma concentração de inóculo cerca de 10 vezes mais alta do que a necessária para a mesma taxa de infecção (25%) em citros. A dose efetiva para infecção de 25% das plantas (DE25) foi de 0,29 x 10 6 e 0,35 x 10 7 UFC/mL para as combinações (estirpe/hospedeiro) ARC/cafeeiro e CVC/citros, respectivamente. Já para a combinação heteróloga CVC/cafeeiro, a DE25 foi de 0,85 x 10 8 UFC/mL, evidenciando a dificuldade de colonização de plantas de café pela estirpe de citros. A população bacteriana da estirpe de citros foi mais elevada em citros que em cafeeiro em todas as épocas de avaliação, embora a diferença tenha sido significativa apenas aos 2 meses após a inoculação. Um teste preliminar demonstrou que o método de isolamento primário envolvendo maceração de pecíolo foliar de cafeeiro infectado não inibe o crescimento de X. fastidiosa em meio de cultura, propiciando assim, uma estimativa confiável da população de células cultiváveis da bactéria em cafeeiro. Em caráter complementar, realizou-se um estudo de comparação morfológica de seis isolados de X. fastidiosa de citros com CVC e de seis isolados de cafeeiro com ARC, provenientes de diferentes localidades dos Estados de São Paulo e Minas Gerais. Não houve relação entre período de incubação ou diâmetro médio das colônias e o hospedeiro de origem dos isolados. Entretanto, as colônias dos isolados de cafeeiro apresentaram coloração opalescente e margens lisas, enquanto que as de citros mostraram-se mais convexas e escuras, com o centro áspero e margens onduladas, apresentando numerosos filamentos semelhantes a exopolissacarídeos. / The goal of this research was to evaluate infection efficiency and multiplication of citrus [Citrus sinensis (L.) Osbeck] and coffee (Coffea arabica L.) strains of Xylella fastidiosa after cross inoculations, in order to assess the potential for spread of this pathogen from infected citrus groves to coffee plantations and vice versa. Mechanical inoculations were carried out with a X. fastidiosa isolate (CCT6570) from a citrus tree showing citrus variegated chlorosis (CVC) and an isolate (CCT6756) from a coffee tree with coffee stem atrophy (CSA). Four cell concentrations of each isolate, ranging between 10 3 a 10 9 colony forming units (CFU) per mL, were needle-inoculated in citrus and coffee plants, in order to determine titration curves and effective doses for infection in each strain/host combination. The rate of infected plants and the viable bacterial population were determined by polymerase chain reaction (PCR) and primary isolation in culture at 0.5, 2, 4 and 8 months after inoculation. The coffee (CSA) strain of X. fastidiosa did not colonize citrus in any of the inoculum concentrations tested. Cross inoculation of the citrus (CVC) strain in coffee resulted in low rates of infection and required an inoculum concentration 10 times higher than that necessary to obtain a similar (25%) rate of infection in citrus. The effective dose for 25% infection (ED25) was 0,29 x 10 6 and 0,35 x 10 7 CFU/mL for the homologous strain/host combinations, CSA/coffee and CVC/citrus, respectively. For the heterologous CVC/coffee combination, ED25 was higher (0,85 x 10 8 CFU/mL), showing the difficulty of colonizatin of coffee plants by the citrus strain. Bacterial population of the citrus strain was higher in citrus than in coffee plants at all evaluation dates, although statistical differences were found only at 2 months after inoculation. A preliminary test showed that the primary isolation method used, which includes maceration of infected coffee leaf petioles, does not inhibit bacterial grow in culture, thus allowing reliable estimates of X. fastidiosa populations in coffee. Another study was carried out to compare colony morphology of six isolates of X. fastidiosa from citrus with CVC and six isolates from coffee with CSA, obtained from different localities in the States of São Paulo and Minas Gerais. There was no relationship between incubation period or average colony diameter and the original host of the isolates. However, colonies of the coffee isolates showed opalescent colour and flat margins, whereas the colonies of all citrus isolates were darker and more convex, with rugous center and ondulated margins presenting numerous filaments.