A bactéria Xylella fastidiosa causa a clorose variegada dos citros, também conhecida como amarelinho. Em 2000, foi concluído o seqüenciamento do genoma deste organismo, o primeiro de uma bactéria fitopatogênica, um fato que estimulou o estudo dos possíveis mecanismos de patogenicidade empregados pela bactéria para causar a doença em citros. X. fastidiosa é uma bactéria limitada ao xilema, sendo transmitida de planta a planta através de insetos vetores. Especula-se que a bactéria produza enzimas que degradem a membrana da pontuação, permitindo a colonização de novos vasos do xilema. A identificação de genes com similaridade de seqüência a genes de celulases, xilanases, pectinases e proteases, fomentou o presente estudo visando caracterizar os genes Xf - 810, Xf - 818 e Xf - 2708, similares a endoglicanases. Estes genes foram clonados em vetores de expressão e as respectivas proteínas foram produzidas em Escherichia coli. Através de ensaios enzimáticos as proteínas foram caracterizadas como endoglicanases (EC 3.2.1.4), que são celulases com mecanismo endoglicolítico de ataque às moléculas de celulose. Estas celulases hidrolisam carboximetil celulose, Avicel e xilana, enquanto as enzimas Xf - 810 e Xf - 818 hidrolisam a celulose amolecida com ácido. Estas celulases degradam mais eficientemente a carboximetil celulose em pH ácido (entre 5,2 e 5,6) e na temperatura de 65 °C. Coletivamente, estas celulases são capazes de degradar polímeros solúveis e insolúveis, enquanto a enzima Xf - 818, é capaz de degradar oligossacarídeos derivados da celulose, como celotetraose e celopentaose, apresentando ampla variação catalítica. Esta celulase possui capacidade de ligação à celulose microcristalina, denotando a funcionalidade de seu domínio ligador de celulose. Desenvolvemos um protocolo, empregando cromatografia de troca aniônica, afinidade por metal (níquel) e filtração em gel, eficiente na purificação da proteína Xf - 818 expressa heterologamente em E. coli com fusão hexahistidina à extremidade N-terminal. A caracterização enzimática destas proteínas, com a confirmação da atividade celulásica, fornece subsídios para uma eventual função das celulases durante a colonização do hospedeiro pela bactéria, pois são cataliticamente funcionais. Ademais, corrobora a similaridade destes genes, verificada durante o seqüenciamento do genoma de X. fastidiosa. / Xylella fastidiosa is the causal agent of citrus variegated chlorosis, also known as "amarelinho". The recent sequencing of its genome, achieved in 2000, was the first of a plant pathogen, a fact that stimulated the search for putative pathogenicity factors employed by this bacterium while infecting citrus trees. X. fastidiosa inhabits exclusively the xylem vessels, being transmitted by sharpshooter vectors. Several authors argue that the bacterium produces enzymes to degrade plant cell, as a way to colonize new xylem vessels through pit membrane degradation. The identification of putative cellulases, xylanases, pectinases and proteases on X. fastidiosa genome, led us to carry out the present work to characterize the putative products of the endoglucanase genes Xf - 810, Xf - 818 and Xf - 2708. These genes were cloned into expression vectors and the proteins were produced in Escherichia coli. Based upon enzymatic assays, those proteins were characterized as endoglucanases (EC 3.2.1.4), which are cellulases able to promote the endo-hydrolysis of cellulose chains. These cellulases degraded carboxymethylcellulose, Avicel and xylan, while only Xf - 810 and Xf - 818 degraded acid swollen cellulose. The hydrolysis of carboxymethylcellulose was higher at acidic pH between 5.2 and 5.6) and at a temperature of 65 °C. As a group, these enzymes were able to degrade soluble and insoluble cellulose derivatives, while only the cellulase Xf - 818 could hydrolyze the cello-oligosaccharides cellotetrose and cellopentose, thus showing a high catalytic diversity. This protein also has the capacity to bind microcristalline cellulose, confirming the presence of a functional cellulose-binding domain. We set a protocol, employing anion exchange, metal affinity and gel filtration chromatography, to purify the Xf - 818 enzyme expressed in E. coli as a N-hexahistine fusion tag. The endoglucanase activity studied gives support for an eventual role of such cellulases during host colonization by the bacterium. Besides that, it agrees with similarities searches observed on the sequencing of X. fastidiosa genome.

A citricultura brasileira vem sendo constantemente ameaçada por doenças que causam sérios prejuízos à produção e a qualidade dos frutos, a exemplo da clorose variegada dos citros e do cancro cítrico. A transformação genética de plantas tem sido considerada uma importante ferramenta para os programas de melhoramento de citros, principalmente com relação à resistência a doenças. Este trabalho teve como objetivo avaliar a resistência a Xylella fastidiosa e Xanthomonas axonopodis pv. citri em plantas de Citrus sinensis transformadas com os genes atacina A (attA) ou Xa21. Plantas transgênicas de laranja doce, cvs. \'Hamlin\', \'Natal\', \'Pêra\' e \'Valência\', contendo o gene attA ou Xa21 foram propagadas por enxertia em limão \'Cravo\' para avaliação de resistência aos patógenos. A resistência a X. fastidiosa foi avaliada com a inoculação mecânica com alfinete da suspensão de bactéria nas plantas transgênicas contento o gene attA. As plantas foram avaliadas em quatro experimentos distintos, sendo oito plantas de laranja \'Hamlin\' (H), sete de laranja \'Natal\' (N), cinco de laranja \'Pêra\' (P) e nove de laranja \'Valência\' (V). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 10 repetições e cada experimento foi repetido duas vezes. Aos quatro e oito meses da inoculação foram determinadas as populações bacterianas de todas as plantas por isolamento em meio de cultura e sete plantas (Hat8, Nat1, Nat2, Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) foram selecionadas pelo isolamento para serem analisadas por PCR quantitativo (qPCR), visando quantificar a população bacteriana em relação às plantas testemunhas. A resistência a X. axonopodis pv. citri foi avaliada nas plantas transgênicas contendo os genes attA ou Xa21. As mudas, apresentando folhas novas e sem ferimentos, foram inoculadas por aspersão, para penetração via estômatos, com suspensão bacteriana e encubadas em câmara de crescimento. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 7 a 10 repetições e cada experimento foi repetido três vezes. A severidade da doença foi determinada 30 dias após inoculação, avaliando-se duas folhas por planta com lesões de cancro cítrico, utilizando um software de quantificação de doença (QUANT v.1.0). Dentre as plantas transgênicas contendo o gene attA, quatro (Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) apresentaram menores populações bacterianas de X. fastidiosa e 16 apresentaram redução na severidade de cancro cítrico em relação à testemunha. Entre as plantas transgênicas contendo o gene Xa21, 11 apresentaram redução na severidade de cancro cítrico em comparação a testemunha. / The Brazilian citrus industry is constantly threatened by diseases that cause severe damage to production and fruit quality such as the citrus variegated chlorosis and citrus canker. Genetic transformation has been considered an important tool in citrus breeding programs especially regarding disease resistance. This research objective was to evaluate the resistance to Xylella fastidiosa and Xanthomonas axonopodis pv. citri in Citrus sinensis plants, transformed with the genes attacin A (attA) or Xa21. Transgenic sweet orange plants from cultivars \'Hamlin\', \'Valencia\', \'Natal\' and \'Pera\' containing the attA or Xa21 genes were graft propagated on Rangpur lime for pathogen resistance evaluation. The resistance to X. fastidiosa was evaluated by mechanic inoculation of the transgenic plants containing the attA gene, using bacterial suspension and pin perforation of plant tissue. The plants were evaluated in four different experiments including, eight \'Hamlin\' sweet orange plants (H), seven \'Natal\' sweet orange plants (N), five \'Pera\' sweet orange plants (P) and nine \'Valencia\' sweet orange plants (V). The experimental design was fully randomized with ten replications and each experiment was repeated twice. After four and eight months from inoculation, the bacterial population of all plants was determined by isolation in culture medium and seven plants (Hat8, Nat1, Nat2, Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) were selected to be analyzed by quantitative PCR (qPCR) aiming to estimate the bacterial population in relation to control plants. The resistance to X. axonopodis pv. citri was evaluated in transgenic plants containing the attA or Xa21 genes. Seedlings showing new leaves and free from wounds, were spray-inoculated with bacterial suspension for stomatal penetration, and incubated in growth chamber. The experimental design was fully randomized with seven to ten repetitions and each experiment was repeated three times. The symptom severity of citrus canker was determined 30 days after inoculation, by evaluating two leaves per plant with citrus canker lesions, using a disease quantification software (Quant v.1.0). Within the transgenic plants containing the attA gene, four (Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) showed smaller bacterial populations of X. fastidiosa and 16 had reduction in the severity of citrus canker in relation to control plants. Within the transgenic plants containing the Xa21 gene, 11 presented reduction in symptom severity of citrus canker related to control plants.

Dentre os diversos fatores que afetam a produção e qualidade de frutos em plantas cítricas, os fatores fitossanitários destacam-se pela grande importância. Entre as diversas doenças que afetam a cultura dos citros, a Clorose Variegada dos Citros (CVC) é uma das mais severas e destrutivas, provocando tanto perdas em produção quanto em qualidade. Pelo fato desta doença ser causada por uma bactéria que se aloja no xilema, toda a dinâmica da água e nutrientes é afetada, resultando em uma série de sintomas visuais em diferentes graus. Buscou-se avaliar o estado nutricional de plantas cítricas sem sintomas vis uais de CVC e, com sintomas em diferentes níveis, através do Critério de Faixas de Suficiência, tradicionalmente utilizado na Citricultura Paulista e, através do Sistema Integrado de Diagnose e Recomendação, denominado pela sigla DRIS. O estudo foi realizado em pomares comerciais de laranjeira 'Pera' enxertada em limão 'Cravo', com sete anos de idade, no município de Araraquara - SP. Foram selecionadas em dois talhões, plantas com três níveis de CVC e plantas sem sintomas visuais, determinando-se os teores dos macronutrientes (N, P, K, Ca, Mg, S) e dos micronutrientes (B, Cu, Fe, Mn e Zn) em folhas de ramos frutíferos, bem como produção de frutos de cada planta. A interpretação através do método DRIS, envolveu a utilização de um "software" aplicado especialmente para a cultura dos citros pelo Instituto Agronômico de Campinas - IAC, onde foi utilizado o método de cálculo proposto por Jones (1981). O DRIS foi eficiente, possibilitando a ordenação dos nutrientes, e, indicando deficiência nutricional para alguns nutrientes considerados adequados ou excessivos pelo Critério de Faixas de Suficiência. Independentemente da presença de sintomas de CVC, todas as plantas apresentaram baixos teores de Ca, resultando em diagnose de deficiência pelos dois critérios de interpretação; de modo geral, houve uma redução nos teores foliares de N e P, em plantas com sintomas mais severos. Com relação aos teores dos demais nutrientes não houve um padrão de decréscimo ou aumento em função da CVC. O "software" DRIS aplicado especialmente para a cultura dos citros pelo IAC, com a população de referência por ele utilizada, deve ainda sofrer ajustes, de acordo com as condições e objetivos do trabalho para melhor correlação com produtividade. / Among all factors which affect the yield and fruit quality from citric plants, pests and diseases are of outstanding importance. There are several pests and diseases wich affect the citrus crop. The citrus variegated chlorosis (CVC) is one of the most severe and destructive diseases affecting both yield and quality. Because this disease is caused by a xylem bacteria, the water and nutrients dinamics is affected resulting in a series of visual simptons of different intensities. There objective of this work was to evaluate the nutritional status os citrus plants without visual simptons of CVC and, with different levels of simptons of this disease. The Sufficiency Range Criteria, traditionally used in the state of São Paulo and the Diagnosis and Recommendation Integrated System (DRIS) were the methods used for leaf analysis interpretation. The study was carried out in commercial orchards of 'Pêra' sweet orange budded on 'Cravo' lemom, seven years old, in the region of Araraquara - SP. Plants with three levels of CVC and plants without visual simptons were selected from two plots. Concentrations of macronutrients (N, P, K, Ca, Mg, S) and micronutrients (B, Cu, Fe, Mn, Zn) were determined on leaves of fruit branches. Fruit production from each plant was measured. The analysis through the DRIS method involved the utilization of a software developed specially for the citrus crop by the Instituto Agronômico de Campinas - IAC, where the method proposed by Jones (1981) was used. The results showed that the DRIS was efficient in ranking the nutrients and indicating the nutritional defficiency for some nutrients considered adequate or excessive by the Sufficiency Range Criteria. Regardless the presence of CVC simptons, all plants show low foliar concentrations of Ca, wich resulted in a diagnose of defficiency by the two criteria of interpretation. There was a foliar concentration reduction of N and P, in plants with more severe simptoms. With respect to the foliar concentration of the other nutrients there was not observed a standard decrease or increase due to CVC. The local DRIS-Citros IAC software norms utilized should be adjusted according to the work conditions and objectives to a improve yield correlation with plant nutrition.

A bactéria Xylella fastidiosa 9a5c é o agente causal da clorose variegada dos citros (CVC) e responsável por grandes perdas econômicas na citricultura. O genoma de X. fastidiosa 9a5c foi totalmente seqüenciado e a sua análise permitiu identificar vários genes possivelmente envolvidos na patogenicidade/virulência da bactéria. Como os sintomas da CVC desenvolvemse um longo tempo após a infecção da planta pela bactéria e a severidade da doença têm sido associada à altas temperaturas, é possível que a expressão de fatores de patogenicidade/virulência seja dependente de densidade celular e/ou estresses térmicos. Desta forma, o crescimento in vitro da X. fastidiosa foi monitorado através da absorbância de suspensões bacterianas à 600nm (A600), número de unidades formadoras de colônias (UFC) e viabilidade celular, durante 16 dias de cultivo em meio PW modificado líquido, à 28 e 32ºC. Proteínas extracelulares foram extraídas e analisadas através da eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D-PAGE). Bioensaios foram utilizados para verificar a produção de moléculas sinais por X. fastidiosa. Os resultados obtidos mostraram que o crescimento de X. fastidiosa à 32ºC, com base na A600, não diferiu do crescimento à 28ºC. No entanto, com base no número de UFCs e viabilidade celular, o crescimento de X. fastidiosa diferiu em função da temperatura, tempos de incubação e a interação entre esses fatores. X. fastidiosa produziu maior número de proteínas extracelulares à 32 do que à 28ºC, mostrando que a secreção de proteínas em X. fastidiosa é regulada pela temperatura de incubação. Várias proteínas extracelulares produzidas por X. fastidiosa à 28 e 32ºC são moduladas durante o crescimento da bactéria. A maior parte das proteínas extracelulares produzidas por X. fastidiosa são proteínas ácidas e de massa molecular aparente entre 20-60 kDa. X. fastidiosa não sintetizou moléculas de lactonas de homoserina aciladas (LHAs) reconhecidas pelo sistema repórter utilizado, mas sintetizou uma molécula extracelular em meio de cultivo, semelhante ao DSF produzido por X. campestris pv. campestris, capaz de restaurar a atividade da endoglucanase através do sistema repórter utilizado. A concentração desta molécula em meio PW modificado foi dependente da densidade de células de X. fastidiosa no meio. / The bacterium Xylella fastidiosa is the causal agent of the citrus variegated chlorosis (CVC) and is responsible for significant economic losses in citriculture. The genome of X. fastidiosa has been completely sequenced and revealed several genes probably involved in pathogenicity/virulence. Since CVC symptoms are develop a long time after infection of plant by the bacterium and the severity of the disease has been associated with high temperatures, it’s possible that the expression of pathogenicity/virulence factors is dependent on cellular density and/or temperature stresses. Thus, the growth of X. fastidiosa in modified liquid PW medium was measured based on the absorbance of suspensions at (A600), number of colony-forming units (CFU) and cellular viability, during 16 days at 28 and 32ºC. Extracellular proteins were extracted and analysed by two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE). Bioassays were used to determine whether X. fastidiosa produces signal molecules involved in quorum perception. The results showed that temperatures of 28 and 32ºC did not affect the growth of the bacterium, based on A600. Temperatures of 28 and 32ºC, incubation times and the interaction of both factors affected bacterial growth based on CFU numbers and the cellular viability. X. fastidiosa produced higher number of extracellular proteins at 32 than at 28ºC, showing that protein secretion is dependent on growth temperature. Several extracellular proteins produced by X. fastidiosa at 28 and 32ºC were modulated the bacterial growth. Most of the extracellular proteins produced by X. fastidiosa were acidic with apparent molecular mass within 20-60 kDa. X. fastidiosa did not synthesize N-acyl homoserine lactone (AHL) recognizes by the reporter system used. However, it synthesized an extracellular molecule in modified PW medium, similar to DSF produced by X. campestris pv. campestris, which is able to restore endoglucanase activity by the reporter system. The concentration of this extracellular molecule produced by X. fastidiosa was dependent on cellular density.

Em concentrações subletais, agentes antimicrobianos modulam a expressão gênica bacteriana, sendo que o conjunto de genes que é modulado depende tanto da cepa bacteriana, como da natureza do agente antimicrobiano. Neste trabalho, avaliamos o perfil de expressão gênica de Xylella fastidiosa cepa 9a5c em resposta ao tratamento por até 60 minutos com dose subletal do antibiótico estreptomicina. Esta é uma cepa virulenta, originalmente isolada de laranjeiras com sintomas de clorose variegada dos citros. A hibridização de microarranjos de DNA representando 2608 das 2848 sequências codificadoras (CDS) previamente anotadas no genoma desta cepa, revelou que 136 CDS apresentaram expressão gênica diferencial em resposta à exposição à estreptomicina, sendo que destas 109 foram negativamente moduladas e 27 positivamente moduladas. Realizamos, também, ensaios de PCR quantitativo precedido de transcrição reversa (RTqPCR) de 21 CDS para confirmar a modulação observada na análise global da expressão gênica. O perfil de expressão gênica de X. fastidiosa em resposta à estreptomicina foi analisado de forma integrada com outros perfis de expressão gênica desta bactéria. Entre as CDS positivamente moduladas, destacamos aquelas codificadoras das chaperoninas GroEL e GroES, que estão associadas a resposta de choque térmico, e CDS associadas à tradução, tais como proteínas ribossomais e fatores de tradução. Interessantemente, a exposição à estreptomicina induz a expressão da CDS que codifica poligalacturonase, que é um fator de virulência em algumas cepas de X. fastidiosa. Por outro lado, o tratamento com estreptomicina promoveu a modulação negativa de CDS relacionadas à formação e manutenção de biofilme ao contrário do observado quando estas bactérias foram submetidas ao tratamento com gomesina, um peptídeo antimicrobiano. O conjunto destas observações sugere que a exposição à dose subletal de estreptomicina possa promover um fenótipo de maior virulência, contrariamente ao efeito previamente observado com a gomesina. Neste trabalho, também descrevemos o pirosequenciamento do genoma da cepa J1a12 de Xylella fastidiosa, que exibe fenótipo menos virulento em citros e tabaco em relação à cepa 9a5c. A comparação da sequência genômica destas duas cepas confirma diferenças anteriormente observadas utilizando-se microarranjos de DNA e destaca genes potencialmente importantes para virulência de Xylella fastidiosa. / At sublethal concentrations, antimicrobials compounds modulate bacterial gene expression and the gene set that is modulated depends not only on the bacterial strain but also on the nature of antimicrobial agent. In this study, we evaluated changes in gene expression profile of Xylella fastidiosa strain 9a5c exposed up to 60 min to sublethal concentration of streptomycin. This a virulent strain originally isolated from orange trees with symptoms of citrus variegated chlorosis. Hybridization of DNA microarrays representing 2,608 out of 2848 coding sequences (CDS) previously annotated in strain 9a5c genome revealed 136 CDS differentially expressed upon streptomycin treatment. Of which 109 were down-regulated and 27 up-regulated. Differential expression for a subset of 21 CDS was further evaluated by reverse transcriptionquantitative PCR (RT-qPCR). In addition, we performed an integrated analysis of the gene expression profile of X. fastidiosa in response to streptomycin along with other gene expression profiles available for this bacterium. Among the up-regulated CDS, we highlight those encoding chaperonins GroEL and GroES, which are associated with heat shock response, and those CDS related to translation, such as ribosomal proteins and translation factors. Interestingly, exposure to streptomycin induces the expression of a CDS encoding polygalacturonase, which is a virulence factor for some X. fastidiosa strains. Furthermore, treatment with streptomycin down-regulates some CDS related to biofilm formation oppositely to treatment with gomesin, an antimicrobial peptide. Together, these observations suggest that exposure to sublethal dose of streptomycin might promote a higher virulent phenotype, in contrast to the effect previously observed with gomesin. In the present work, we also describe the pyrosequencing of J1a12 genome, a X. fastidiosa strain that exhibits a less virulent phenotype in citrus and tobacco if compared to strain 9a5c. A comparison of genome sequences of these two strains confirms differences previously observed using DNA microarrays and highlights important genes for virulence of X. fastidiosa.

O gênero Xylella é composto de uma única espécie, Xylella fastidiosa, bactéria Gram-negativa, não flagelada, que coloniza o xilema de uma diversidade de plantas cultivadas e silvestres em várias partes do mundo. Em algumas dessas plantas, a bactéria é considerada agente causal de doenças, como a Clorose Variegada do Citros em laranjeiras, a Doença de Pierce das videiras e escaldadura da folha de cafeeiro. Onze diferentes cepas de X. fastidiosa, isoladas de distintos hospedeiros, já tiveram seus genomas sequenciados, entre essas, as cepas 9a5c, isolada de laranjeira, e Temecula 1, isolada de videira. Análises desses genomas indicam uma razoável variabilidade entre suas respectivas sequências e evidenciam vários genes associados a mecanismos de virulência e patogenicidade desta bactéria. No presente trabalho descrevemos o sequenciamento, a montagem e a anotação dos genomas das cepas U24d e Fb7, isoladas de laranjeiras, e da cepa 3124 isolada de cafeeiro, os quais apresentam, respectivamente 2.681.334 pb, 2.733.974 pb e 2.748.594 pb. Destas, apenas a cepa U24d apresenta um plasmídeo, o qual é idêntico ao pXF51 previamente identificado na cepa 9a5c. O genoma da cepa U24d é praticamente colinear ao genoma da cepa 9a5c enquanto que os genomas das cepas Fb7 e 3124 apresentaram maior colinearidade com a cepa Temecula1. Entre as diversas alterações encontradas nas análises comparativas destes genomas, destacamos a inserção no gene pilQ verificada no genoma da cepa U24d. Essa mutação causa ausência do pilus do tipo IV com consequente deficiência na motilidade twitching, sendo que plantas infectadas com a cepa U24d apresentam sintomas localizados restritos ao ponto de inoculação. Na cepa Fb7, detectamos a ausência de formação de biofilme no cultivo in vitro possivelmente devido ausência da expressão dos transcritos de mrkD e pspA, que codificam respectivamente adesina do pilus curto e adesina similar à hemaglutinina. Postulamos que estes genes não são expressos em decorrência de um defeito na via de sinalização de DSF (Fator de Sinalização Difusível) reflexo de uma mutação em rpfC no genoma de Fb7. Assim como as demais cepas de X. fastidiosa, também os genomas de U24d, Fb7 e 3124 apresentaram elevado conteúdo de Elementos Genéticos Móveis (EGM), que aparecem em maior número nas cepas sul-americanas. Os estudos do pangenoma de X. fastidiosa mostraram que essa espécie tem um genoma aberto e grande parte dos genes de EGMs correspondem a genes acessórios. A grande quantidade de EGMs em X. fastidiosa pode estar relacionada a falta do sistema CRISPR/cas completo, um provável resultado de eventos de erosão do genoma desta espécie. A inferência filogenética por MSLA mostrou uma clara distinção dos grupos de cepas da América do Norte em relação às do Sul, sugerindo a ocorrência de mais eventos de recombinações genéticas nas cepas sul-americanas, provavelmente pela falta de isolamento geográfico. Assim, é possível que as cepas norte e sul-americanas sofreram divergência alopátrica e simpátrica, respectivamente. / The genus Xylella consists of a single species, Xylella fastidiosa, a Gram-negative and non-flagellated bacterium that colonizes the xylem of a diversity of cultivated and wild plants in several parts of the world. In some of these plants, this bacterium is considered causal agent of diseases such as the Citrus Variegated Cholorosis in orange trees, Pierce\'s Disease of grapevines and coffee leaf scald. Eleven different strains of X. fastidiosa isolated from different hosts had their genomes sequenced, including 9a5c and Temecula1 strains, respectively isolated from orange tree and grapevine. Analyses of these genomes indicate a reasonable variability in their sequences and showed several genes associated with pathogenicity and virulence mechanisms of this bacterium. In this work we describe the genome sequencing, assembly and annotation of the strains U24d and Fb7, isolated from orange trees, and 3124 isolated from coffee, which have, respectively, 2,681,334 bp, 2,733,974 bp and 2,748,594 bp. Of these, only strain U24d has a plasmid, identical to pXF51 from strain 9a5c. The genome of U24d strain is almost collinear to the genome of strain 9a5c while the genomes of strains Fb7 and 3124 had higher collinearity to Temecula1 strain. Among many changes found in the comparative analysis of these genomes, we highlight an on insertion in pilQ gene that was found in U24d strain genome. This mutation causes lack of type IV pilus with a consequent deficiency in twitching motility. Moreover orange trees infected with U24d strain showed localized symptoms near to the inoculation point. We verified that Fb7 strain does not form biofilm in vitro possibly due to the absence of expression of mrkD and pspA transcripts, which encode, respectively, a short pilus adhesin and a hemagglutinin-like adhesin. We postulate that these genes are not expressed due to a defect in the signaling pathway of DSF (Diffusible Signal Factor) reflecting a mutation on rpfC in the Fb7 genome. Similarly to other X. fastidiosa strains, the genomes of U24d, Fb7 and 3124 also showed high content of mobile genetic elements (MGE), which appear in larger numbers in South American strains. Pan genome studies of X. fastidiosa showed that this species has a open genome and that most of MGE genes correspond to accessory genes. The large number of MGE in X. fastidiosa may be related to the lack of a complete system CRISPR/cas, likely a result of erosion events of the genome of this species. The phylogenetic reconstruction by MLSA showed a clear distinction between groups of strains from North and South America, suggesting the occurrence of more recombination events in South American strains, probably due to lack of geographical isolation. Thus it is possible that North and South American strains underwent allopatric and sympatric divergence, respectively.

A clorose variegada dos citros (CVC) é uma das principais doenças que afeta a citricultura brasileira, causada pela bactéria Xylella fastidiosa (Wells), que coloniza o xilema de culturas de interesse econômico, além de plantas ornamentais e daninhas, sendo transmitida por cigarrinhas (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). A compreensão do patossistema CVC é fundamental para planejar táticas eficazes de controle da doença. Entretanto, as pesquisas sobre interações patógeno-planta-vetores são escassas, devido à falta de plantas hospedeiras adequadas para ensaios de transmissão da bactéria, visto que citros não é um bom hospedeiro experimental. Assim, nesta pesquisa objetivou-se identificar espécies herbáceas que permitam a colonização sistêmica da estirpe de X. fastidiosa de citros, e avaliar seu uso como plantas-fonte e plantas-teste (indicadoras) em testes de transmissão por Bucephalogonia xanthophis (Berg). Para tal foram escolhidas as plantas Bidens pilosa L., Catharanthus roseus L., Citrus sinensis (L.) Osbeck, Medicago sativa L., Nicotiana tabacum L., Ocimum basilicum L., Parthenium hysterophorus L., Phaseolus vulgaris L., Sida rhombifolia L. e Solanum americanum Mill, que foram inoculadas mecanicamente com isolados de X. fastidiosa de citros e posteriormente avaliadas quanto à infecção por isolamento primário e reação de cadeia da polimerase (PCR). As espécies que permitiram colonização bacteriana foram posteriormente avaliadas em experimentos de transmissão por B. xanthophis, sendo divididos em duas etapas. Na primeira delas, variaram-se as espécies de plantas-fonte para aquisição da bactéria e fixou-se C. roseus como planta-teste para inoculação. Na segunda etapa, fixou-se C. roseus como planta-fonte e variaram-se as espécies de planta-teste. Durante os experimentos de transmissão, foram avaliados dois parâmetros biológicos de B. xanthophis: mortalidade (%) e volume de honeydew excretado (medida indireta de ingestão). Entre 30 a 90 dias após a inoculação, as plantas-testes foram analisadas quanto à infecção bacteriana por meio de PCR e isolamento. As inoculações mecânicas mostraram colonização sistêmica e multiplicação de X. fastidiosa em sete espécies vegetais (B. pilosa, C. roseus, C. sinensis, M. sativa, N. tabacum, O. basilicum e S. americanum), com maiores taxas de infecção e populações bacterianas em C. roseus e N. tabacum. As espécies C. roseus, M. sativa e O. basilicum, quando usadas como plantas-fonte de X. fastidiosa, propiciaram maiores volumes de excreção e menores taxas de mortalidade (15, 20 e 20%) da cigarrinha após 48 h de acesso à aquisição da bactéria. No experimento de transmissão com variação de espécies de plantas-teste, detectou-se a inoculação pelo vetor em C. roseus, M. sativa, O. basilicum e S. americanum, com maior proporção de plantas positivas (cerca de 20%) para as duas primeiras. Dentre essas espécies, C. roseus e M. sativa são as indicadoras mais adequadas para ensaios de transmissão de X. fastidiosa por B. xanthophis, sendo a primeira também adequada como planta-fonte. / Citrus variegated chlorosis (CVC) is a major disease that affects the Brazilian citrus industry, caused by the xylem-limited bacterium Xylella fastidiosa (Wells), which colonizes several crop plants, ornamentals and weeds, and is transmitted by sharpshooter leafhoppers (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). A better understanding of the CVC pathossystem is critical for developing effective tactics to control the disease. However, research on the relationships among pathogen strains, host plants and insect vectors associated with CVC is scarce, partly because of the lack of adequate host plants for transmission assays, since citrus is not a suitable experimental host for this purpose. Thus, the present study aimed to identify herbaceous plants that allow systemic colonization of citrus strains of X. fastidiosa, and evaluate them as source and test (indicator) plants in transmission assays by the sharpshooter Bucephalogonia xanthophis (Berg). Ten plant species, Bidens pilosa L., Catharanthus roseus L., Citrus sinensis (L.) Osbeck, Medicago sativa L., Nicotiana tabacum L., Ocimum basilicum L., Parthenium hysterophorus L., Phaseolus vulgaris L., Sida rhombifolia L. and Solanum americanum Mill were mechanically inoculated with citrus isolates of X. fastidiosa and then evaluated for bacterial infection by primary isolation in culture medium and polymerase chain reaction (PCR). Those plant species that allowed bacterial colonization were later evaluated in two transmission experiments by B. xanthophis, In the first experiment, different plant species were tested as source plants for bacterial acquisition and transmission to C. roseus (test plant). In the second one, C. roseus was used as a source plant and different plant species were evaluated as test (indicator) plants for bacterial inoculation. During the transmission experiments, two biological parameters of B. xanthophis were evaluated: mortality rate (%) and honeydew excretion (as an indirect measure of ingestion). Between 30 and 90 days after inoculation, the test plants were analyzed for X. fastidiosa infection by PCR and culturing. The mechanical inoculation experiments showed systemic colonization and multiplication of X. fastidiosa in seven plant species (B. pilosa, C. roseus, C. sinensis, M. sativa, N. tabacum, O. basilicum and S. americanum), with higher rates of infection and bacterial populations of C. roseus and N. tabacum. The species C. roseus, M. sativa and O. basilicum, when used as source plants of X. fastidiosa, allowed higher ingestion (honeydew excretion) rates and lower mortality (15, 20 and 20%) of B. xanthophis during the 48-h acquisition access period. In the transmission experiment with different species of test plants, X. fastidiosa inoculation by the vector was detected in C. roseus, M. sativa, O. basilicum and S. americanum, with a higher rate of infected plants (about 20%) in the former two species. Among the herbaceous plant species evaluated in this research, C. roseus and M. sativa are the most appropriate indicator hosts of X. fastidiosa infection for transmission assays by B. xanthophis, whereas the former species is also suitable as a source plant.

Este trabalho foi realizado com o objetivo de identificar cigarrinhas vetoras ou potenciais vetoras de Xylella fastidiosa Wells et al. em pomares cítricos do litoral norte da Bahia, determinando-se as espécies predominantes com ênfase na subfamília Cicadellinae. Os levantamentos foram conduzidos no período de março/2002 a fevereiro/2003, em cinco propriedades do litoral norte do Estado da Bahia, nos municípios de Alagoinhas, Inhambupe e Rio Real, em pomares de laranja doce [Citrus sinensis (L.) Osbeck] cv. Pêra, enxertada sobre limão cravo (Citrus limonia Osbeck) com idade de 7 a 9 anos. Em cada pomar, foram instalados 15 cartões adesivos amarelos de 8,5 X 11,5 cm, dispostos em um espaçamento de 40x40 m. Os cartões foram amarrados a 1,5 m de altura em ramos da face norte, na periferia da copa, sendo substituídos periodicamente. Também foram realizadas avaliações periódicas na vegetação rasteira presente nas entrelinhas dos pomares através de rede de varredura, amostrando-se, em cada avaliação, cinco pontos escolhidos aleatoriamente e efetuando-se 30 redadas por ponto. Os dados de coleta foram submetidos a uma análise faunística, calculando-se os índices de constância, freqüência, abundância, dominância, diversidade, eqüitabilidade e similaridade. Coletaram-se 1860 espécimes pertencentes a 54 espécies de sete famílias da subordem Auchenorrhyncha, sendo a maioria deles das famílias Cicadellidae (84,3%) e Membracidae (14,2%). Um maior número de espécies de Auchenorrhynca foi observado em pomar vizinho a mata nativa pouco degradada. A subfamília Cicadellinae, que inclui os vetores de X. fastidiosa, foi a mais representativa em número de espécies (15) e de indivíduos coletados (63,92%). Observou-se variação na composição de espécies de Cicadellinae dependendo do método e local de amostragem, evidenciando-se a existência de dois grupos de potenciais vetores habitando a copa das laranjeiras e a vegetação rasteira. Acrogonia flagellata Young, A. citrina Marucci & Cavichioli, Homalodica sp. e Cicadellini sp.1 predominaram nos cartões adesivos amarelos (árvores cítricas), enquanto que Hortensia similis (Walker) e Erythrogonia dubia (Medler) foram dominantes na rede de varredura (vegetação rasteira). Entre as espécies de Cicadellinae já conhecidas como vetoras de X. fastidiosa em citros, apenas A. citrina, Bucephalogonia xanthophis (Berg) e Ferrariana trivittata (Signoret) foram observadas, sendo que as duas últimas foram de ocorrência acidental na vegetação rasteira. Entre os novos potenciais vetores, A. flagellata, Homalodisca sp. e Cicadellini sp.1 são espécies predominantes nos pomares cítricos do litoral norte da Bahia, devendo ser investigadas quanto à capacidade de transmissão de X. fastidiosa para citros. / This study was carried out to identify vectors or potential vectors of Xylella fastidiosa Wells et al. in citrus groves of the north coast of Bahia State, Brazil, based on a faunistic survey and determination of predominant sharpshooter leafhoppers (subfamily Cicadellinae). The survey was carried out from March/2002 to February/2003 in five old sweet orange [Citrus sinensis (L.) Osbeck, cv. Pêra, grafted on rangpur lime (Citrus limonia Osbeck); 7-9 years old] groves of northeastern Bahia State, located in Alagoinhas, Inhambupe and Rio Real. Fifteen yellow sticky cards (8,5 X 11,5 cm) were installed 40x40 m apart in each grove, hanged at the height of 1.5 m on the upper north side of citrus canopies. Cards were replaced monthly or fortnightly. A sweep net was periodically used to sample leafhoppers in the herbaceous weeds inside the groves, by selecting five points at random and performing 30 sweeps in each point (sample unit). Data was uses to calculate indices of constancy, frequency, abundance, dominance, diversity, equitability and similarity. A total of 1860 specimens of 54 species belonging to 7 families of suborder Auchenorrhyncha were collected, most of them in the families Cicadellidae (84,3%) and Membracidae (14,2%). A larger number of species was observed in a grove located nearby a non-degraded native wood. The subfamily Cicadellinae, which includes the sharphooter vectors of X. fastidiosa, showed the largest number of species (15) and specimens (63,92%). There was a variation in Cicadellinae species composition depending upon the sampling method, which indicates that two distinct groups of potential sharpshooter vectors are inhabiting the citrus canopy and the weedy vegetation. Acrogonia flagellata Young, A. citrina Marucci & Cavichioli, Homalodica sp. e Cicadellini sp.1 predominate in the yellow sticky cards hanged on the citrus canopy, whereas Hortensia similis (Walker) e Erythrogonia dubia (Medler) were dominant species on weeds. Among the Cicadellinae species already known as vectors of X. fastidiosa in citrus, only A. citrina, Bucephalogonia xanthophis (Berg) e Ferrariana trivittata (Signoret) were found; the two latter species were accidentally trapped by sweep net in the weedy vegetation. Among the new potential vectors, A. flagellata, Homalodisca sp. e Cicadellini sp.1 are predominant species in citrus groves of the north coast of Bahia and should be tested with respect to their ability to transmit X. fastidiosa to citrus.

Xylella fastidiosa é uma bactéria Gram-negativa, do subgrupo das Gama-Proteobactérias, não-flagelada, que coloniza o xilema de diversas plantas cultivadas e silvestres, podendo ser causadora de doenças. Sua disseminação é feita por insetos conhecidos como cigarrinhas. Genomas de cepas de X. fastidiosa isoladas de distintos hospedeiros já foram sequenciados completa ou parcialmente: 9a5c de citros; Temecula-1 e GB514 de videira; Dixon, M12 e M23 de amendoeira; Ann-1 de espirradeira e EB92-1, isolada de sabugueiro e utilizada como bio-controle para Doença de Pierce de videiras. Estudos de genômica comparativa associados a abordagens de genômica funcional e de genética molecular têm possibilitado o estudo detalhado de mecanismos potencialmente relevantes tanto para a colonização de plantas e insetos por este fitopatógeno como para o desenvolvimento de sintomas associados a doenças específicas em seus respectivos hospedeiros vegetais. Exceto o genoma de 9a5c, todos os demais genomas conhecidos são de cepas isoladas na América do Norte. Neste trabalho descrevemos o pirossequenciamento dos genomas da cepa J1a12, que exibe fenótipo não-virulento em citros, e das cepas Pr8x e Hib4, isoladas, respectivamente, de ameixeira e hibisco. A cepa J1a12 possui além de seu cromossomo principal de 2.788.789 pb dois plasmídeos, pXF51 e pXF27, respectivamente de 51.180 pb e 27.268 pb. pXF51 já foi descrito também na cepa de citros 9a5c e pXF27 tem similaridade com outros plasmídeos de cepas de X. fastidiosa norte-americanas isoladas de amoreira e videira. A cepa Pr8x possui além de seu cromossomo principal de 2.666.242 pb um plasmídeo, pXF39, de 39.580 pb, o qual contém a maioria das CDS presentes no pXF51. A cepa Hib4, isolada de hibisco, tem o maior cromossomo (2.813.297 pb) e também o maior plasmídeo (pXF64 com 64.251 pb) já descritos para X. fastidiosa. pXF64 apresenta extensa similaridade com o plasmídeo pBVIE04 de Burkholderia vietnamensis cepa G4, sendo descrito pela primeira vez em cepas de X. fastidiosa. Análises comparativas destes genomas possibilitaram a identificação de alterações que podem ser correlacionadas com os fenótipos exibidos por estas cepas, além da variedade e diversidade de regiões relacionadas a bacteriófagos e de plasmídeos que co-existem nas diferentes cepas deste fitopatógeno. / Xylella fastidiosa is a Gram-negative bacteria, of the Gamma-proteobacterium subgroup, non-flagellated that colonizes the xylem of several cultivated and wild plants, where may cause disease. The bacterium is spread by insects known as sharpshooters. Genomes of X. fastidiosa strains isolated from different hosts have been completely or partially sequenced: 9a5c from citrus; Temecula-1 and GB514 from grapevine; Dixon, M12 and M23 from almond tree; Ann-1 from oleander and EB92-1, isolated from elderberry and used as bio-control for Pierce\'s disease of grapevines. Comparative genomics studies associated with approaches from functional genomics and molecular genetics have allowed a detailed study of mechanisms potentially relevant to the colonization of plants and insects by this pathogen as well as to the development of symptoms associated with specific diseases in their respective host plants. Except for 9a5c, all other known genomes are from strains isolated in North America. Here we describe the pyrosequencing of the genomes of strain J1a12, which displays non-virulent phenotype in citrus and of Pr8x and Hib4 strains isolated, respectively, from plum and hibiscus. J1a12 has a main chromosome of 2,788,789 bp and two plasmids, pXF51 and pXF27, respectively of 51,180 bp and 27,268 bp. pXF51 has been described also in the citrus strain 9a5c and pXF27 has similarity with other plasmids found in North American strains isolated from mulberry tree and grapevine. The strain Pr8x has a main chromosome of 2,666,242 bp and one plasmid, pXF39, of 39,580 bp which present similarities with pXF51. Hib4, the strain isolated from hibiscus, has the largest chromosome (2,813,297 bp) and the largest plasmid (pXF64 with 64,251 bp) described for X. fastidiosa. pXF64 shows extensive similarity with the plasmid pBVIE04 of Burkholderia vietnamensis G4 strain and is described for the first time in X. fastidiosa. Comparative analyzes of these genomes have identified several differences that may be correlated with the phenotypes displayed by these strains, in addition to the variety and diversity of regions related to bacteriophages and plasmids that co-exist in different strains of this pathogen.

Orientadores: José Camilo Novello, Ione Salgado / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T05:39:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fontanesi_KarinaKleinfelder_M.pdf: 2853236 bytes, checksum: 30ce9c486d1739927e3bd38f96e22015 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O sistema citrícola no Brasil representa um setor de grande importância econômica. O Estado de São Paulo é o principal produtor de citros, fazendo do país o maior exportador de suco de laranja concentrado congelado. Apesar do Brasil ocupar uma posição de destaque no cenário mundial de citricultura, o país não consegue aumentar a sua produtividade devido à ocorrência simultânea de pragas e doenças, sendo que a clorose variegada dos citros (CVC) se mostra como uma das mais limitantes sobre esta produção. Ela é causada pela bactéria Xylella fastidiosa, que é capaz de infectar todas as variedades de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck), embora a tangerina Poncan (Citrus reticulata Blanco) seja considerada tolerante à sua infecção. Apesar de muitos estudos já tenham sidos realizados a fim de se compreender melhor os mecanismos da sua patogenicidade, questões ainda permanecem em aberto acerca dos mecanismos que controlam o seu processo de infecção e o desenvolvimento da doença. Desse modo, foi realizado um estudo comparativo do proteoma das folhas de laranja Pêra e de tangerina Poncan após 30 dias da inoculação com a X. fastidiosa e o dos obtidos de folhas não infectadas, empregando a técnica de eletroforese bidimensional (2DE) e espectrometria de massas (MS). Foram confeccionados mapas 2DE com o intuito de se verificar proteínas diferencialmente expressas que por ventura poderiam estar relacionadas aos mecanismos de defesa e resistência da planta. Entre as proteínas (spots) de laranja Pêra, separadas por eletroforese bidimensional, 60 spots foram considerados como estatisticamente relevantes, apresentando alteração de intensidade. Entre as proteínas de tangerina Poncan analisadas na mesma condição, 38 foram consideradas como estatisticamente relevantes. Confeccionou-se para a planta tangerina Poncan géis de poliacrilamida utilizando IPG com gradiente de pH linear de 4-7, visto que houve um grande número de proteína diferencialmente expressas nesta faixa. Como resultado, foram obtidos 45 spots com diferença de expressão. A identificação dessas proteínas foi feita por meio do seqüenciamento por espectrometria de massas através do sistema LC ESI-MS/MS ou MALDI-Q-TOF. O seqüenciamento por MS possibilitou a aquisição da seqüência de aminoácidos de 49,7% dos spots. Dentre eles, 76% dos spots foram identificados, enquanto que 24% não apresentaram homologia com nenhuma base de dados. Entre as proteínas identificadas quatro foram representadas por mais de um spot, podendo indicar a ocorrência de eventos provenientes do splicing alternativo, modificações pós-traducionais, variações alélicas de uma mesma proteína ou degradação da amostra. As proteínas identificadas foram relacionadas com a produção de energia, com o metabolismo primário, com mecanismo de defesa, proteínas de microrganismos e proteínas desconhecidas. Laranja Pêra apresentou uma diminuição da expressão de proteínas relacionadas à fotossíntese, o que coincide com os primeiros efeitos sentidos pelas plantas colonizadas pela bactéria. Em contrapartida, tangerina Poncan apresentou um aumento de expressão de proteínas relacionadas à resposta de defesa contra esse patógeno. / Abstract: The citrus system in Brazil represents one of the most important economic sectors. The State of São Paulo is the main producer of citrus, settling the country as the biggest exporter of concentrated freezing orange juice. Besides holding the outstanding position in the worldwide citrus culture scene, the country cannot raise its productivity due to simultaneous occurrence of plagues and diseases, being the citrus variegated chlorosis (CVC) one of the most limiting diseases affecting the citrus production. This disease is caused by bacterium Xylella fastidiosa, that which is able to infect all sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck) varieties, however ponkan (Citrus reticulate Blanco) was considered resistant to it. Although, many studies have already been done in order to understand, in a better way, the mechanism of its pathogenicity, there are still queries about the mechanisms which control the process of its infection and the development of the disease. In this manner, we did a comparative proteomics study of leaves from sweet orange and ponkan after 30 days of the inoculation with X. fastidiosa versus leaves not infected with this bacterium (healthy plants), using two-dimensional gel electrophoresis (2DE) and mass spectrometry techniques. Comparative 2DE maps were done with the aim to verify differentially expressed proteins related with defense mechanism and the plant resistance. Among the proteins (spots) extracted from sweet orange, separated by two-dimensional gel electrophoresis, 60 spots were considered with statistical significance, showing intensity alteration. On the other hand, among the proteins (spots) extracted from ponkan and analyzed in the same condition, 38 spots were considered with statistical significance. Gels using linear pH gradient ranging from 4 to 7 were prepared for ponkan gels using, because there were a larger number of differentially expressed proteins in this area. As a result, we obtained 45 spots with difference in its expression. The identification of these proteins was done by sequencing using mass spectrometry like LC ESI-MS/MS or MALDI-Q-TOF. 143 spots were analyzed by mass spectrometry and were obtained amino acid sequence from 71 (49,7%) of the spots. Between them, 54 (76%) were identified, while 17 (24%) presented no homology in the database used. Overall, 4 proteins appeared as multiple spots and accounted for most of the protein found in the group. This observation may reflect post-translation modification, alternative splicing events, isozyme variation, allelic variation of the same protein, but also protein degradation. The identified proteins play a role in energy, primary metabolism, defense mechanism, unknown proteins and microorganism proteins. The sweet orange presented a decrease in expression of photosynthesis related protein, indicating a possible lower photosynthetic activity resulting from early effects of the bacterial colonization in affected plants. On the other hand, ponkan showed an increase in defense-related proteins response against this pathogen. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular