Malformações congênitas ocorrem em aproximadamente 2% a 3% dos nascidos vivos, podendo compreender desde malformações discretas até graves defeitos que comprometem a sobrevida. Estima-se que cerca de 6% dos casos de defeitos congênitos ocorram devido à presença de anomalias cromossômicas. Essa prevalência é, provavelmente, subestimada, uma vez que malformações mais graves podem levar a perdas fetais antes que um diagnóstico seja possível e, algumas vezes, as alterações cromossômicas ou desequilíbrios genômicos associados às malformações congênitas não são identificados. Este estudo teve como objetivo geral identificar rearranjos cromossômicos e variação do número de cópias (CNVs) do genoma por meio da investigação de microdeleções e microduplicações em recém-nascidos com malformações congênitas de etiologia desconhecida. Este trabalho fez parte de um projeto de desenvolvimento tecnológico para o estabelecimento do método de análise comparativa de genomas em um hospital universitário público. Foi realizado um estudo retrospectivo em 35 amostras de DNA estocadas em biorrepositório por meio da análise total do genoma pela técnica de Hibridação Genômica Comparativa baseada em microarranjos (array-CGH). Todas as CNVs detectadas foram comparadas com as descritas em bancos públicos de dados genômicos, e sua significância clínica foi estimada. Treze alterações genômicas foram detectadas em 12/35 (34,3 %) das amostras. Em 4/35 (11.4%) dessas, os desequilíbrios genômicos puderam ser definidos como patogênicos e causalmente relacionados às anomalias congênitas; em 5/35 (14.3%) das amostras, CNVs de significado clínico incerto foram identificadas; e, em 4/35 (11.4%), variantes normais foram detectadas. Entre os 4 casos cujos resultados foram considerados causalmente relacionados com os achados clínicos, 2/4 (50%) tinham alterações patogênicas que estão reconhecidamente associados à síndromes de microdeleção definidas. Em 2/4 amostras (50%), os desequilíbrios cromossômicos encontrados, ainda que preditos como patogênicos, não haviam sido previamente associados à entidades clínicas reconhecidas. O uso de array-CGH indicou a presença na amostra estudada de rearranjos cromossômicos não identificados previamente, permitindo a identificação de regiões cromossômicas relacionadas à algumas anomalias congênitas. Além disso, ainda que a interpretação dos resultados deva ser refinada, os dados sugerem que a análise comparativa de genomas por array-CGH seja considerada como investigação de primeira linha no rastreamento seletivo para análise prospectiva/retrospectiva de amostras de DNA em programas de monitoramento de defeitos congênitos. / Congenital malformations occur in approximately 2% to 3% of live births and may comprise from mild to severe malformations defects that compromise survival. It is estimated that about 6% of the cases of birth defects occur due to the presence of chromosomal abnormalities. This prevalence is probably underestimated, since more severe malformations may lead to fetal loss before a diagnosis is possible, and sometimes, the chromosomal aberrations or genomic imbalances associated with congenital malformations are not identified. This study had as main objective to identify chromosomal rearrangements and copy number variations (CNVs) in the genome through the investigation of microdeletions and microduplications in newborns with congenital malformations of unknown etiology. This work was part of a technological development project for the establishment of the method of comparative analysis of genomes in a public university hospital. A retrospective study was performed on 35 DNA samples stored in a biorepository through whole-genome based microarrays Comparative Genomic Hybridization (array-CGH). All CNVs detected were compared with those described in public genome databases, and their clinical significance was estimated. Thirteen genomic alterations were detected in 12/35 (34.3%) of the samples. On 4/35 (11.4%) of these, the genomic imbalances were defined as pathogenic and causally related to congenital anomalies; in 5/35 (14.3%) samples CNVs of uncertain clinical significance were identified and in 4/35 (11.4%), normal variants were detected. Among the 4 cases whose results were considered causally related to clinical findings, 2/4 (50%) had pathogenic changes that are associated with well-known microdeletion syndromes. In 2/4 samples (50%), chromosomal imbalances found, although predicted as pathogenic, have not been previously associated with the recognized clinical entities. The use of array-CGH indicated the presence of chromosomal rearrangements not previously identified, allowing the identification of chromosomal regions related to some congenital anomalies. Moreover, although the interpretation of the results should be refined, the data suggest that comparative genome analysis by array-CGH must be considered as first-line investigation in selective screening for prospective/retrospective analysis of DNA samples in birth defects monitoring programs.

Malformações congênitas ocorrem em aproximadamente 2% a 3% dos nascidos vivos, podendo compreender desde malformações discretas até graves defeitos que comprometem a sobrevida. Estima-se que cerca de 6% dos casos de defeitos congênitos ocorram devido à presença de anomalias cromossômicas. Essa prevalência é, provavelmente, subestimada, uma vez que malformações mais graves podem levar a perdas fetais antes que um diagnóstico seja possível e, algumas vezes, as alterações cromossômicas ou desequilíbrios genômicos associados às malformações congênitas não são identificados. Este estudo teve como objetivo geral identificar rearranjos cromossômicos e variação do número de cópias (CNVs) do genoma por meio da investigação de microdeleções e microduplicações em recém-nascidos com malformações congênitas de etiologia desconhecida. Este trabalho fez parte de um projeto de desenvolvimento tecnológico para o estabelecimento do método de análise comparativa de genomas em um hospital universitário público. Foi realizado um estudo retrospectivo em 35 amostras de DNA estocadas em biorrepositório por meio da análise total do genoma pela técnica de Hibridação Genômica Comparativa baseada em microarranjos (array-CGH). Todas as CNVs detectadas foram comparadas com as descritas em bancos públicos de dados genômicos, e sua significância clínica foi estimada. Treze alterações genômicas foram detectadas em 12/35 (34,3 %) das amostras. Em 4/35 (11.4%) dessas, os desequilíbrios genômicos puderam ser definidos como patogênicos e causalmente relacionados às anomalias congênitas; em 5/35 (14.3%) das amostras, CNVs de significado clínico incerto foram identificadas; e, em 4/35 (11.4%), variantes normais foram detectadas. Entre os 4 casos cujos resultados foram considerados causalmente relacionados com os achados clínicos, 2/4 (50%) tinham alterações patogênicas que estão reconhecidamente associados à síndromes de microdeleção definidas. Em 2/4 amostras (50%), os desequilíbrios cromossômicos encontrados, ainda que preditos como patogênicos, não haviam sido previamente associados à entidades clínicas reconhecidas. O uso de array-CGH indicou a presença na amostra estudada de rearranjos cromossômicos não identificados previamente, permitindo a identificação de regiões cromossômicas relacionadas à algumas anomalias congênitas. Além disso, ainda que a interpretação dos resultados deva ser refinada, os dados sugerem que a análise comparativa de genomas por array-CGH seja considerada como investigação de primeira linha no rastreamento seletivo para análise prospectiva/retrospectiva de amostras de DNA em programas de monitoramento de defeitos congênitos. / Congenital malformations occur in approximately 2% to 3% of live births and may comprise from mild to severe malformations defects that compromise survival. It is estimated that about 6% of the cases of birth defects occur due to the presence of chromosomal abnormalities. This prevalence is probably underestimated, since more severe malformations may lead to fetal loss before a diagnosis is possible, and sometimes, the chromosomal aberrations or genomic imbalances associated with congenital malformations are not identified. This study had as main objective to identify chromosomal rearrangements and copy number variations (CNVs) in the genome through the investigation of microdeletions and microduplications in newborns with congenital malformations of unknown etiology. This work was part of a technological development project for the establishment of the method of comparative analysis of genomes in a public university hospital. A retrospective study was performed on 35 DNA samples stored in a biorepository through whole-genome based microarrays Comparative Genomic Hybridization (array-CGH). All CNVs detected were compared with those described in public genome databases, and their clinical significance was estimated. Thirteen genomic alterations were detected in 12/35 (34.3%) of the samples. On 4/35 (11.4%) of these, the genomic imbalances were defined as pathogenic and causally related to congenital anomalies; in 5/35 (14.3%) samples CNVs of uncertain clinical significance were identified and in 4/35 (11.4%), normal variants were detected. Among the 4 cases whose results were considered causally related to clinical findings, 2/4 (50%) had pathogenic changes that are associated with well-known microdeletion syndromes. In 2/4 samples (50%), chromosomal imbalances found, although predicted as pathogenic, have not been previously associated with the recognized clinical entities. The use of array-CGH indicated the presence of chromosomal rearrangements not previously identified, allowing the identification of chromosomal regions related to some congenital anomalies. Moreover, although the interpretation of the results should be refined, the data suggest that comparative genome analysis by array-CGH must be considered as first-line investigation in selective screening for prospective/retrospective analysis of DNA samples in birth defects monitoring programs.

Malformações congênitas ocorrem em aproximadamente 2% a 3% dos nascidos vivos, podendo compreender desde malformações discretas até graves defeitos que comprometem a sobrevida. Estima-se que cerca de 6% dos casos de defeitos congênitos ocorram devido à presença de anomalias cromossômicas. Essa prevalência é, provavelmente, subestimada, uma vez que malformações mais graves podem levar a perdas fetais antes que um diagnóstico seja possível e, algumas vezes, as alterações cromossômicas ou desequilíbrios genômicos associados às malformações congênitas não são identificados. Este estudo teve como objetivo geral identificar rearranjos cromossômicos e variação do número de cópias (CNVs) do genoma por meio da investigação de microdeleções e microduplicações em recém-nascidos com malformações congênitas de etiologia desconhecida. Este trabalho fez parte de um projeto de desenvolvimento tecnológico para o estabelecimento do método de análise comparativa de genomas em um hospital universitário público. Foi realizado um estudo retrospectivo em 35 amostras de DNA estocadas em biorrepositório por meio da análise total do genoma pela técnica de Hibridação Genômica Comparativa baseada em microarranjos (array-CGH). Todas as CNVs detectadas foram comparadas com as descritas em bancos públicos de dados genômicos, e sua significância clínica foi estimada. Treze alterações genômicas foram detectadas em 12/35 (34,3 %) das amostras. Em 4/35 (11.4%) dessas, os desequilíbrios genômicos puderam ser definidos como patogênicos e causalmente relacionados às anomalias congênitas; em 5/35 (14.3%) das amostras, CNVs de significado clínico incerto foram identificadas; e, em 4/35 (11.4%), variantes normais foram detectadas. Entre os 4 casos cujos resultados foram considerados causalmente relacionados com os achados clínicos, 2/4 (50%) tinham alterações patogênicas que estão reconhecidamente associados à síndromes de microdeleção definidas. Em 2/4 amostras (50%), os desequilíbrios cromossômicos encontrados, ainda que preditos como patogênicos, não haviam sido previamente associados à entidades clínicas reconhecidas. O uso de array-CGH indicou a presença na amostra estudada de rearranjos cromossômicos não identificados previamente, permitindo a identificação de regiões cromossômicas relacionadas à algumas anomalias congênitas. Além disso, ainda que a interpretação dos resultados deva ser refinada, os dados sugerem que a análise comparativa de genomas por array-CGH seja considerada como investigação de primeira linha no rastreamento seletivo para análise prospectiva/retrospectiva de amostras de DNA em programas de monitoramento de defeitos congênitos. / Congenital malformations occur in approximately 2% to 3% of live births and may comprise from mild to severe malformations defects that compromise survival. It is estimated that about 6% of the cases of birth defects occur due to the presence of chromosomal abnormalities. This prevalence is probably underestimated, since more severe malformations may lead to fetal loss before a diagnosis is possible, and sometimes, the chromosomal aberrations or genomic imbalances associated with congenital malformations are not identified. This study had as main objective to identify chromosomal rearrangements and copy number variations (CNVs) in the genome through the investigation of microdeletions and microduplications in newborns with congenital malformations of unknown etiology. This work was part of a technological development project for the establishment of the method of comparative analysis of genomes in a public university hospital. A retrospective study was performed on 35 DNA samples stored in a biorepository through whole-genome based microarrays Comparative Genomic Hybridization (array-CGH). All CNVs detected were compared with those described in public genome databases, and their clinical significance was estimated. Thirteen genomic alterations were detected in 12/35 (34.3%) of the samples. On 4/35 (11.4%) of these, the genomic imbalances were defined as pathogenic and causally related to congenital anomalies; in 5/35 (14.3%) samples CNVs of uncertain clinical significance were identified and in 4/35 (11.4%), normal variants were detected. Among the 4 cases whose results were considered causally related to clinical findings, 2/4 (50%) had pathogenic changes that are associated with well-known microdeletion syndromes. In 2/4 samples (50%), chromosomal imbalances found, although predicted as pathogenic, have not been previously associated with the recognized clinical entities. The use of array-CGH indicated the presence of chromosomal rearrangements not previously identified, allowing the identification of chromosomal regions related to some congenital anomalies. Moreover, although the interpretation of the results should be refined, the data suggest that comparative genome analysis by array-CGH must be considered as first-line investigation in selective screening for prospective/retrospective analysis of DNA samples in birth defects monitoring programs.

Submitted by Ana Damasceno (ana.damasceno@unipampa.edu.br) on 2017-09-12T18:38:13Z No. of bitstreams: 1 Freitas, Karine Elise Janner de, 2017.pdf: 1520872 bytes, checksum: a4fac980d6a3df8e18e9e49f279baa4b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-12T18:38:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Freitas, Karine Elise Janner de, 2017.pdf: 1520872 bytes, checksum: a4fac980d6a3df8e18e9e49f279baa4b (MD5) Previous issue date: 2017-03-31 / A família das Polytrichaceae possui diversos representantes no continente Antártico, e entre elas a espécie Polytrichum strictum Menzies ex Brid. Considerado um organismo bipolar, pois se desenvolve tanto no Ártico como na Antártica, ainda carece de estudos que esclareçam sua classificação taxonômica, já que por diversas vezes foi conduzido como variante de Polytrichum juniperinum Hedw. devido sua morfologia ser similar a espécie e, sua verdadeira origem ainda não estar clara. Em um estudo, sugeriu-se que P. juniperinum poderia ser o ancestral materno de P. strictum, porém a análise apresentou incongruências. Ainda não se tem estudos moleculares dos espécimes oriundos dos polos e, muito menos abordagens a nível genômico do gênero Polytrichum. Com o advento das tecnologias de seqüênciamento de nova geração, os genomas organelares tornan-se uma ferramenta para estudos filogenéticos, já que fornecem dados sobre o conteúdo gênico e arquitetura do genoma, além de inferências filogenéticas complementares sobre a história evolutiva das espécies. Neste trabalho, foi determinada a sequencia parcial dos genomas do cloroplasto (cpDNA) e mitocondrial (mtDNA) de P. strictum e P. juniperinum, com o objetivo de analisar e caracterizar estruturalmente os genomas acessórios dos exemplares do gênero Polytrichum e inferir nas relações filogenéticas entre P. strictum e P. juniperinum. Os genomas acessórios das espécies foram sequenciados em um sequenciador NGS da Ion Torrent. A montagem, anotação, alinhamento, construção da filogenia e análise sintênica foram realizados in silico com softwares específicos. O cpDNA de P. juniperinum apresenta 55.168 pb compreendendo 51 genes, 31 tRNAs, 4 rRNAs e 19 proteínas relacionadas ao fotossistema I e II. O mtDNA de P. juniperinum compreende um total de 88.021 pb com 67 genes incluindo 19 tRNAs, 5 rRNAs, e 12 proteínas relacionadas ao metabolismo oxidativo. O cpDNA de P. strictum apresenta 20.183 pb compreendendo 45 genes, 14 tRNAs, 4 rRNAs, e 18 proteínas do fotossistema I e II. O mtDNA de P. strictum apresenta 58.896 pb contendo um total de 62 genes, 19 tRNAs, 5 rRNAs, e 13 proteínas relacionadas ao metabolismo oxidativo. Nas análises filogenéticas com cpDNA e mtDNA as árvores consenso apresentaram algumas diferenças no padrão de ramificação, porém P. juniperinum e P. strictum foram agrupadas no mesmo clado. Essas informações geradas a partir do cpDNA e mtDNA de P. juniperinum e P. strictum fornecem um aporte para futuros estudos filogenéticos com os espécimes do Ártico. / The Polytrichaceae family has several representants on the Antarctic continent, including Polytrichum strictum Menzies ex Brid. Considered a bipolar organism, because it develops in both the Arctic and Antarctica Continent, it still need studies to clarify its taxonomic classification, since several times it was conducted as a variant of Polytrichum juniperinum Hedw due to its morphology be similar to the species and its true origin still not be clear. In study, it was suggested that P. juniperinum could be the maternal ancestor of P. strictum, but the analysis presented incongruence’s. There are still no molecular studies of the specimens from the poles, let alone genomic approaches of the genus Polytrichum. With advent of new generation sequencing technologies, organellar genomes become as tool for phylogenetic studies, as they provide data on genome content and genome architecture, as well as complementary phylogenetic inferences about the evolutionary history of species. In this work, the sequence of the chloroplast (cpDNA) and mitochondrial (mtDNA) genomes of P. strictum and P. juniperinum was determined with the objective of analyze and structurally characterize the accessory genomes of the genera Polytrichum and infer in the phylogenetic relationships between P. strictum and P. juniperinum.The accessory genomes of the species were sequenced on an Ion Torrent NGS sequencer. Assembly, annotation, alignment, phylogeny construction and syntenic analysis were performed in sílico with specific software. The P. juniperinum cpDNA has 55,168 bp comprising 51 genes, 31 tRNAs, 4 rRNAs and 19 proteins related to photosystem I and II. The P. juniperinum mtDNA comprises a total of 88,021 bp with 67 genes including 19 tRNAs, 5 rRNAs, and 12 proteins related to oxidative metabolism. The P. strictum cpDNA has 20,183 bp comprising 45 genes, 14 tRNAs, 4 rRNAs, and 18 proteins from photosystem I and II. The P. strictum cpDNA has 20,183 bp comprising 45 genes, 14 tRNAs, 4 rRNAs, and 18 proteins from photosystem I and II. The P. strictum mtDNA has 58,896 bp containing a total of 62 genes, 19 tRNAs, 5 rRNAs, and 13 proteins related to oxidative metabolism. In the phylogenetic analyzes with cpDNA and mtDNA the consensus trees presented some differences in the branching pattern, but P. juniperinum and P. strictum were grouped in the same clade. This information generated from cpDNA and mtDNA of P. juniperinum and P. strictum provide a contribution to future phylogenetic studies with the specimens from Arctic.

O advento do sequenciamento de nova geração (NGS - Next Generation Sequencing) nos últimos anos proporcionou um aumento expressivo no número de projetos genômicos. De maneira simplificada, as máquinas sequenciadoras geram como resultado fragmentos de DNA que são utilizados por programas montadores de genoma. Esses programas tentam juntar os fragmentos de DNA de modo a obter a representação completa da sequência genômica (por exemplo um cromossomo) da espécie sendo sequenciada. Em alguns casos o processo de montagem pode ser executado com maior facilidade para organismos com genomas de tamanhos pequenos (por exemplo bactérias com genoma em torno de 5Mpb), através de pipelines que automatizam a maior parte da tarefa. Um cenário mais complicado surge quando a espécie possui genoma com grande comprimento (acima de 1Gpb) e elementos repetidos, como no caso de alguns eucariotos. Nesses casos o resultado da montagem é geralmente composto por milhares de fragmentos (chamados de contigs), uma ordem de magnitude muito superior ao número de cromossomos estimado para um organismo (comumente da ordem de dois dígitos), dando origem a uma montagem altamente fragmentada. Uma atividade comum nesses projetos é a comparação da montagem com a de outro genoma como forma de validação e também para identificação de regiões conservadas entre os organismos. Embora o problema de alinhamento par-a-par de genomas grandes seja bem contornado por abordagens existentes, o alinhamento múltiplo (AM) de genomas grandes em estado fragmentado ainda é uma tarefa de difícil resolução, por demandar alto custo computacional e grande quantidade de tempo. Este trabalho consiste em uma metologia para fazer alinhamento múltiplo de genomas grandes de eucariotos com montagens altamente fragmentadas. Nossa implementação, baseada em alinhamento estrela, se mostrou capaz de fazer AM de grupos de montagens com diversos níveis de fragmentação. O maior deles, um conjunto de 5 genomas de répteis, levou 14 horas de processamento para fornecer um mapa de regiões conservadas entre as espécies. O algoritmo foi implementado em um software que batizamos de FROG (FRagment Overlap multiple Genome alignment), de código aberto e disponível sob licença GPLv3. / The advent of Next Generation Sequencing (NGS) in recent years has led to an expressive increase in the number of genomic projects. In a simplified way, sequencing machines generate DNA fragments that are used by genome assembler software. These programs try to merge the DNA fragments to obtain the complete representation of the genomic sequence (for example a chromosome) of the species being sequenced. In some cases the assembling process can be performed more easily for organisms with small-sized genomes (e.g. bacteria with a genome length of approximately 5Mpb) through pipelines that automate most of the task. A trickier scenario arises when the species has a very large genome (above 1Gbp) and complex elements, as in the case of some eukaryotes. In those cases the result of the assembly is usually composed of thousands of fragments (called contigs), an order of magnitude much higher than the number of chromosomes estimated for an organism (usually in the order two digits), giving rise to a highly fragmented assembly. A common activity in these projects is the comparison of the assembly with that of another genome as a form of validation and also to identify common elements between organisms. Although the problem of pairwise alignment of large genomes is well circumvented by existing approaches, multiple alignment of large genomes with highly fragmented assemblies remains a difficult task due to its time and computational requirements. This work consists of a methodology for doing multiple alignment of large eukaryotic genomes with highly fragmented assemblies, a problem that few solutions are able to cope with. Our star alignment-based implementation, was able to accomplish a MSA of groups of assemblies with different levels of fragmentation. The largest of them, a set of 5 reptilian genomes where the B. jararaca assembly (800,000 contigs, N50 of 3.1Kbp) was used as anchor, took 14 hours of execution time to provide a map of conserved regions among the participating species. The algorithm was implemented in a software named FROG (FRagment Overlap multiple Genome alignment), available under the General Public License v3 (GPLv3) terms.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-04-28T13:39:52Z No. of bitstreams: 1 2016_AndreiSteccaSteindorff.pdf: 3749164 bytes, checksum: 9a4a5c3bdc4e24bc0a92b9777e8680f2 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-04-28T20:07:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_AndreiSteccaSteindorff.pdf: 3749164 bytes, checksum: 9a4a5c3bdc4e24bc0a92b9777e8680f2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-28T20:07:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_AndreiSteccaSteindorff.pdf: 3749164 bytes, checksum: 9a4a5c3bdc4e24bc0a92b9777e8680f2 (MD5) / O controle biológico é um processo complexo que inclui diferentes mecanismos e uma diversidade de vias metabólicas. Espécies de Trichoderma harzianum são conhecidas por sua atividade de biocontrole contra patógenos de plantas. Para melhor entender os mecanismos utilizados por T. harzianum no controle biológico, no presente trabalho foi sequenciado o genoma do isolado TR274 usando sequenciamento Illumina, assim como seu respectivo transcritoma na interação direta com Scletotinia sclerotiorum ou na presença de sua parede celular. A montagem do genoma feita utilizando o programa AllPaths-LG cobertura máxima de 100x, resultou em 2282 contigs, tamanho do genoma de 40,8 Mb e um conteúdo GC de 47.7%, similar aos outros genomas de Trichoderma. Um total de 13932 genes foram anotados. Análise do Core Eukariotic Genes Dataset (CEGMA) sugere que o genoma está 100% completo e 97,9% das sequencias de RNA-seq alinharam corretamente no genoma. A análise filogenética usando proteínas ortólogas com todas as espécies de Trichoderma sequenciadas no JGI, confirmam a divisão nas seções Tricoderma (T. asperellum e T. atroviride), Longibrachiatum (T. reesei, T. citrinoviride e T. longibrachiatum) e Pachibasium (T. harzianum e T. virens). Das proteínas ortólogas anotadas, 8242 compõem proteínas compartilhadas por todas as espécies, as proteínas espécie específicas variam de 262 (T. reesei) a 1803 (T. longibrachiatum). Os dois genomas de T. harzianum analisados sugerem uma alta similaridade entre eles, mesmo tendo sido isolados de locais e continentes distintos, um de solo de cerrado no Brasil e outro de solo de jardim na Inglaterra. Análises de genes envolvidos com o metabolismo secundário, CAZymes, transportadores, proteases e fatores de transcrição foram feitas. A seção Pachibasium expandiu virtualmente todas as categorias analisadas quando comparada com as outras seções. Análise CAFE mostrou uma correlação positiva entre estas expansões e o tamanho dos genomas. O subgrupo C1 das quitinases foi completamente perdido pela seção Longibrachiatum. Estes resultados sugerem que estas famílias proteicas tem um importante papel nos seus respectivos fenótipos. As abordagens transcritômicas mostraram que a interação entre T. harzianum e S. sclerotiorum é bem complexa e envolve a produção de metabólitos secundários e síntese de transportadores antes e durante o contato, com uma modulação principalmente de enzimas hidrolíticas após o contato. Dos genes encontrados diferencialmente expressos na condição de crescimento em parede celular, 86,8% foram também encontrados diferencialmente expressos na interação direta. Cerca de 25% de todo o genoma de T. harzianum foi modulado durante a interação com S. sclerotiorum. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Biological control is a complex process, which requires many mechanisms and a high diversity of biochemical pathways. Trichoderma harzianum species complex are well known for their biocontrol activity against many plant pathogens. To gain new insights into the biocontrol mechanism employed by T. harzianum, we sequenced genome of the isolate TR274 with its transcriptome during direct interaction with the fungal pathogen Sclerotinia sclerotiorum and its cell wall, using Illumina sequencing. Whole genome assembly was performed using AllPaths-LG, with a maximum coverage of 100x. The assembly resulted in 2282 contigs, with an estimated genome size of 40.8 Mb and GC content of 47.7%, similar to other Trichoderma genomes. Using the JGI Annotation Pipeline we predicted 13,932 genes, with high transcriptome support. Core Eukariotic Genes Dataset (CEGMA) tests suggested 100% genome completeness and 97.9% of RNA-SEQ reads mapped to the genome. The phylogenetic comparison using orthologous proteins with all Trichoderma genomes sequenced at JGI, corroborates the Trichoderma section division described previously (T. asperellum and T. atroviride), Longibrachiatum (T. reesei, T. citrinoviride and T. longibrachiatum) and Pachibasium (T. harzianum and T. virens). A Venn diagram was built with orthologs proteins, with 8242 composing the core protein group and species specific varying from 262 proteins (T. reesei) to 1803 (T. longibrachiatum). The comparison between two Trichoderma harzianum CBS 226.95 and TR274 isolates, suggests a high genome similarity. Analyses of the secondary metabolites, CAZymes, transporters, proteases and transcription factors were performed. The Pachybasium section expanded virtually all categories analyzed compared with the other sections. CAFE analysis showed positive correlation between these families and genome size. The chitinase subgroup C1 was completely absent in Longibrachiatum section members. These results suggest that these proteins families play an important role on their respective phenotypes. Transcriptome analysis suggests that the interaction between T. harzianum and S. sclerotiorum is complex, involving production of secondary metabolites and transporters before and during the contact, with a modulation of CAZymes after contact. A total of 86.8% of differentially expressed genes during growth on Sclerotinia sclerotiorum cell wall were found during direct interaction. Approximately the 25% of whole T. harzianum genome was seen to be modulated during the interaction with S. sclerotiorum.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2015. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2015-11-03T14:18:27Z No. of bitstreams: 1 2015_PatriciaAlvesSilva.pdf: 1963450 bytes, checksum: 252f173b1b9d8c60126eea7dac7dc38c (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-12-30T11:53:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_PatriciaAlvesSilva.pdf: 1963450 bytes, checksum: 252f173b1b9d8c60126eea7dac7dc38c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-30T11:53:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_PatriciaAlvesSilva.pdf: 1963450 bytes, checksum: 252f173b1b9d8c60126eea7dac7dc38c (MD5) / O crescente número de casos de infecções fúngicas sistêmicas tem sido motivo de grande preocupação em âmbito mundial. As opções terapêuticas disponíveis atualmente são limitadas, dividida em quatro grupos: os Polienos (anfotericina B), Fluoropirimidinas (flucitosina), Azólicos (cetoconazol, fluconazol, itraconazol, posaconazol e voriconazol) e Equinocandinas (caspofungina, micafungina e anidulafungina. Além disso, vem sendo observado há algum tempo o surgimento de resistência aos agentes antifúngicos como Anfotericina B e derivados azólicos, surgindo à necessidade do desenvolvimento de novos antifúngicos. Atualmente, a pesquisa e o desenvolvimento de drogas consomem muito tempo e apresentam altos riscos. O planejamento baseado na estrutura e no mecanismo de ação tem se mostrado uma estratégia eficiente e menos dispendiosa para desenvolvimento de novos fármacos. Neste contexto, em resultados preliminares obtidos pelo grupo, por meio de análise in silico, foram identificados quatro possíveis genes-alvos, que estão presentes em sete fungos patogênicos humanos relevantes e ausentes no genoma humano. Entre estes genes-alvo está o kre2 ou Mnt1, que codifica uma proteína de aproximadamente 49 kDa, a α - 1,2 manosiltransferase. Esta é uma proteína importante para viabilidade celular e virulência do patógeno no interior do hospedeiro. Além da seleção dos dez genes candidatos, nosso grupo identificou por métodos in silico de modelagem molecular e screening virtual, 17 compostos de baixa massa molecular (small molecules) que potencialmente têm capacidade de inibir a enzima α - 1,2- manosiltransferase (KRE2) de P. lutzii. Das 17 moléculas selecionadas, uma se destacou nos testes de susceptibilidade contra fungos de importância médica e foi denominada de molécula 3. Com testes de inibição in vitro promissores surgiu-se a necessidade de avaliar se de fato esta molécula é capaz de inibir especificamente o alvo molecular KRE2 de P. lutzii. Os resultados alcançados neste trabalho apontam para o sucesso na obtenção desta proteína no sistema de expressão heteróloga em Pichia pastoris. Uma vez que este sistema realiza glicosilação de proteínas, possibilita o dobramento correto da enzima alvo, e fornece as condições necessárias para continuidade dos experimentos. Quantidades razoáveis da proteína foram produzidas heterologamente, o que possibilitou a realização dos ensaios para determinação dos parâmetros cinéticos e testes de inibição enzimática usando a molécula 3 contra o alvo KRE2 de P. lutzii. Utilizando substrato marcado com [14C] nas reações, foi determinado o Km aparente de KRE2 de P. lutzii que atingiu 3,7 pM, demonstrando alta afinidade da enzima pelo substrato em relação aos dados descritos na literatura. De forma semelhante, os testes de inibição enzimática utilizaram o isótopo radioativo e a molécula 3 foi usada contra as enzimas KRE2 de P. lutzii e MNT1 de Cândida albicans. Os resultados obtidos para KRE2 de P. lutzii demonstram que na presença da molécula inibidora, foi observada uma redução da atividade enzimática de até 60%. No entanto, a redução da atividade enzimática de MNT1 de Cândida albicans ficou em 20%. Faz-se necessário destacar que a molécula 3 apresenta problemas de solubilidade e que novos ensaios de susceptibilidade contra espécies de Cândida spp. utilizando Pluronic F-127 associados a molécula 3 foram realizados pelo nosso grupo e os resultados foram promissores. Desta forma, o melhoramento da solubilidade da molécula 3 representa um avanço nos testes de inibição in vitro, o que aumenta a expectativa de um MIC90 melhor para os outros fungos de importância médica. Os resultados apresentados neste trabalho representam um avanço na validação da molécula 3 como inibidor de KRE2 de P. lutzii, o que poderá contribuir com dados relevantes para o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento de micoses de relevância mundial. / The occurrence of growth of systemic infections has been the cause of great concern worldwide. The therapeutic options currently available are limited, and are divided into four groups, Polyenes (amphotericin B), fluoropyrimidines (flucitosine), Azoles (ketoconazole, fluconazole, itraconazole, posaconazole and voriconazole) and Echinocandins (caspofungin, micafungin and anidulafungin. Furthermore, this is observed of resistance to antifungal agents such as amphotericin B and azoles, leading to the need of development of new antifungal agents. Currently, the research and drug development, consume much time and it have high risks. The planning based on structure and mechanism of action has proven to be an efficient and less expensive strategy for development of new drugs. In this context, in preliminar results obtained by the group using in silico analysis identified four possible target genes which are present in seven relevant human pathogenic fungi and absent in the human genome. Among these target genes Kre2 or Mnt1 is responsible to encode a protein of approximately 49 kDa, the α - 1,2 mannosyltransferase. This is an important protein for cell viability and virulence of the pathogen within the host. Besides the selection of ten candidate genes, our group identified using in silico methods of molecular modeling and virtual screening 17 compounds of low molecular weight (small molecules) that potentially have the ability to inhibit the enzyme α - 1,2 mannosyltransferase (KRE2) of P. lutzii. Of the 17 molecules selected, one highlighted out in susceptibility tests against fungi of medical importance and was called molecule 3. With in vitro inhibition tests promising, the need to evaluate if in fact this molecule is able to specifically inhibit the molecular target KRE2 of P. lutzii emerged. The results obtained in this study point to the success in getting this protein in heterologous expression system in Pichia pastoris. Once this system performs glycosylation of proteins, it allows the correct folding of the target enzyme, favoring the necessary conditions to continue the experiments. Reasonable amounts of protein were produced heterologously, allowing the tests to determine the kinetic parameters and enzyme inhibition tests using the molecule 3 against the target KRE2 P. lutzii. Using labeled substrate [14C] in the reactions, apparent Km of KRE2 of P. lutzii was determined, which reached 3.7 pM, demonstrating the high affinity of the enzyme for the substrate in comparison to data in the literature. Similarly, the enzymatic inhibition tests used the radioactive isotope and the molecule 3 was used against enzymes KRE2 of P. lutzii and MNT1 of Candida albicans. The results obtained for KRE2 of P. lutzii demonstrated that in the presence of the inhibitor molecule, was observed a reduction in the enzymatic activity by 60%. However, reduction of the enzymatic activity of MNT1 of Candida albicans was 20%. It is necessary to point out that the molecule 3 shows solubility issues, additional susceptibility testing against species of Candida spp. using Pluronic F-127 linked to molecule3 were carried out by our group with promising results. Thus, the improvement of the solubility of the molecule 3 represented an advance in vitro inhibition tests, which increases the expectation of better MIC90 for other fungi of medical importance. The results presented in this work represents an advancement in the validation of the molecule 3 as an inhibitor of KRE2 of P. lutzii, which may contribute to important data for the development of new drugs for the treatment of fungal infections of global relevance.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-03-13T19:56:49Z No. of bitstreams: 1 2016_RodrigoTheodoroRocha.pdf: 3894776 bytes, checksum: 1c81a5970509cf6762b3a7714e52434c (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-03-28T16:39:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_RodrigoTheodoroRocha.pdf: 3894776 bytes, checksum: 1c81a5970509cf6762b3a7714e52434c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-28T16:39:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_RodrigoTheodoroRocha.pdf: 3894776 bytes, checksum: 1c81a5970509cf6762b3a7714e52434c (MD5) / Metabólitos secundários (MS) são moléculas heterogêneas de baixo peso molecular e, alternativamente aos metabólitos primários, não estão diretamente envolvidas no crescimento do organismo que as produz. Entre os microrganismos produtores de MS destacam-se os fungos filamentosos do gênero Aspergillus, abrangendo diversas espécies com estilos de vida variados e produzindo inúmeros compostos de importância para os homens, animais e plantas. A espécie A. terreus é produtora de diversos MS, entre eles destaca-se a lovastatina, fármaco da classe das estatinas, que são mundialmente utilizadas para a redução dos níveis de colesterol. Visando a bioprospecção de cepas de A. terreus produtoras de lovastatina utilizamos a genômica comparativa para detalhar a estrutura e variabilidade dos genes responsáveis por sua biossíntese. Oito cepas de A. terreus isoladas no Brasil foram submetidas a sequenciamento de segunda geração utilizando a plataforma Illumina. Os dados resultantes foram mapeamentos contra o genoma de referência da espécie (cepa NIH 2624) e observou-se uma conservação de 86% de todo genoma entre as cepas. No entanto, grandes regiões com tamanho maior que 10 kb apresentaram cobertura anômala, e posteriormente verificou-se que se tratava de variantes estruturais (grandes indels) nos genomas das cepas, inclusive no agrupamento gênico de biossíntese (BCG) de lovastatina. As variantes estruturais dentro deste loco foram validadas experimentalmente via ensaios de PCR e a ausência de genes essenciais à biossíntese da lovastatina explica o fenótipo não produtor em algumas cepas. A observação variabilidade genômica entre as cepas motivou o desenvolvimento de uma nova metodologia para detecção de BCGs em geral. Esta baseia-se na estrutura de grafos de Bruijn coloridos e pode ser aplicada diretamente nos dados brutos de sequenciamento, sem necessitar montagens genômicas de alta qualidade. Com esta abordagem foi possível identificar os limites gênicos dos agrupamentos de biossíntese dos metabólitos acetilaranotina, terretonina e outros. As análises de genômica comparativa neste estudo apontam as relevantes diferenças na composição gênica de indivíduos da mesma espécie, as quais podem ser correlacionadas com fenótipos de interesse biotecnológico. Ademais, ressaltam a complexa história evolutiva dos fungos e a plasticidade de seus genomas. Assim como acontece em muitos procariotos, os genomas dos fungos filamentosos devem ser representados por um pan-genoma. / Secondary metabolites (SM) are a heterogeneous class of low molecular weight compounds not directly involved in the growth of the producing organism. Among the SM producing microorganisms stands out the genus Aspergillus, a diverse group of filamentous fungi of medical and biotechnological relevance. The species A. terreus is known to produce several metabolites, noticeably lovastatin, belonging to the statins class with worldwide application as cholesterol lowering drugs. Aiming at the bioprospection of lovastatin producing strains we employed a comparative genomics study to pinpoint the structure and variability of the genes involved in its biosynthesis. Eight A. terreus strains, isolated in different locations, were sequenced by second generation genome sequencing platform Illumina. The resulting reads were mapped against the reference genome of A. terreus (strain NIH 2624) unveiling a 86% genome-wide conservation between the strains. However, large blocks spanning over 10 kb showed anomalous mapping coverage depth, and further analyses showed that these were structural variants (large indels) occurring in the genome of the strains. Strikingly, some strains exhibited structural variations in the lovastatin biosynthetic gene cluster (BCG), further validated by PCR assays, which offers a plausible explanation for the non-producing phenotype observed in some strains. The observation of strain-specific genome variation prompted the development of a new BCG detection methodology based on colored de Bruijn graphs and directly applied to raw sequencing data without the necessity of a high quality reference genome. This approach uncovered the presence and the gene boundaries of several BCGs in our study, such as the biosynthetic clusters for the metabolites acetilranotin, terretonin and others. The comparative genomic analyses in this study highlight the gene composition differences among individuals of the same species and the correlation with biotechnological relevant phenotypes. Moreover, underlies the complex fungal evolutive pathways and the plasticity of microbial genomes.

O advento do sequenciamento de nova geração (NGS - Next Generation Sequencing) nos últimos anos proporcionou um aumento expressivo no número de projetos genômicos. De maneira simplificada, as máquinas sequenciadoras geram como resultado fragmentos de DNA que são utilizados por programas montadores de genoma. Esses programas tentam juntar os fragmentos de DNA de modo a obter a representação completa da sequência genômica (por exemplo um cromossomo) da espécie sendo sequenciada. Em alguns casos o processo de montagem pode ser executado com maior facilidade para organismos com genomas de tamanhos pequenos (por exemplo bactérias com genoma em torno de 5Mpb), através de pipelines que automatizam a maior parte da tarefa. Um cenário mais complicado surge quando a espécie possui genoma com grande comprimento (acima de 1Gpb) e elementos repetidos, como no caso de alguns eucariotos. Nesses casos o resultado da montagem é geralmente composto por milhares de fragmentos (chamados de contigs), uma ordem de magnitude muito superior ao número de cromossomos estimado para um organismo (comumente da ordem de dois dígitos), dando origem a uma montagem altamente fragmentada. Uma atividade comum nesses projetos é a comparação da montagem com a de outro genoma como forma de validação e também para identificação de regiões conservadas entre os organismos. Embora o problema de alinhamento par-a-par de genomas grandes seja bem contornado por abordagens existentes, o alinhamento múltiplo (AM) de genomas grandes em estado fragmentado ainda é uma tarefa de difícil resolução, por demandar alto custo computacional e grande quantidade de tempo. Este trabalho consiste em uma metologia para fazer alinhamento múltiplo de genomas grandes de eucariotos com montagens altamente fragmentadas. Nossa implementação, baseada em alinhamento estrela, se mostrou capaz de fazer AM de grupos de montagens com diversos níveis de fragmentação. O maior deles, um conjunto de 5 genomas de répteis, levou 14 horas de processamento para fornecer um mapa de regiões conservadas entre as espécies. O algoritmo foi implementado em um software que batizamos de FROG (FRagment Overlap multiple Genome alignment), de código aberto e disponível sob licença GPLv3. / The advent of Next Generation Sequencing (NGS) in recent years has led to an expressive increase in the number of genomic projects. In a simplified way, sequencing machines generate DNA fragments that are used by genome assembler software. These programs try to merge the DNA fragments to obtain the complete representation of the genomic sequence (for example a chromosome) of the species being sequenced. In some cases the assembling process can be performed more easily for organisms with small-sized genomes (e.g. bacteria with a genome length of approximately 5Mpb) through pipelines that automate most of the task. A trickier scenario arises when the species has a very large genome (above 1Gbp) and complex elements, as in the case of some eukaryotes. In those cases the result of the assembly is usually composed of thousands of fragments (called contigs), an order of magnitude much higher than the number of chromosomes estimated for an organism (usually in the order two digits), giving rise to a highly fragmented assembly. A common activity in these projects is the comparison of the assembly with that of another genome as a form of validation and also to identify common elements between organisms. Although the problem of pairwise alignment of large genomes is well circumvented by existing approaches, multiple alignment of large genomes with highly fragmented assemblies remains a difficult task due to its time and computational requirements. This work consists of a methodology for doing multiple alignment of large eukaryotic genomes with highly fragmented assemblies, a problem that few solutions are able to cope with. Our star alignment-based implementation, was able to accomplish a MSA of groups of assemblies with different levels of fragmentation. The largest of them, a set of 5 reptilian genomes where the B. jararaca assembly (800,000 contigs, N50 of 3.1Kbp) was used as anchor, took 14 hours of execution time to provide a map of conserved regions among the participating species. The algorithm was implemented in a software named FROG (FRagment Overlap multiple Genome alignment), available under the General Public License v3 (GPLv3) terms.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:02:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo897_1.pdf: 8640800 bytes, checksum: a7ee3c6274f9d3c9d3a9f5fa7142d92d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / A evolução dos mecanismos de virulência bacteriana está diretamente relacionada com a aquisição dos elementos transponíveis. A compreensão desses fenômenos teve grande avanço com a produção de sequências completas de genomas. Atualmente, sete sequências completas de cepas de Yersinia pestis são conhecidas. Nossas análises dessas sequências revelaram novos aspectos sobre a evolução da ilha de alta patogenicidade (HPI), onde estão as sequências que codificam o sideróforo yersiniabactina (Ybt). As evidências de ciclos adaptativos, mesmo na ausência de genomas intermediários, proporcionaram informações de que a HPI das yersínias foi herdada monofileticamente, podendo a Vibrionaceae ser sua família ancestral. A metodologia foi baseada nas análises das sequências vizinhas às HPIs, assinaturas seletivas dos genes do operon ybt e seus homólogos e frequências do uso de códons dos genomas hospedeiros, que revelaram novos aspectos da evolução desta ilha genômica. Os padrões e as diferenças de conteúdos de GC e das substituições sinônimas e não sinônimas indicam que os genes ybt e seus genomas hospedeiros passaram por diferentes pressões seletivas. Assim, grupos ancestrais diferentes encontraram formas distintas de preservar suas HPIs. Observamos que as sequências vizinhas das HPIs são reguladas por quorum sensing, indicando uma rede geral de regulação que envolve os genes ybt. A análise da organização cromossômica das sete cepas representativas de diferentes regiões do mundo revelou também uma dinâmica de rearranjos que poderia justificar o reconhecimento de novas variantes de Y. pestis até recentemente considerada uma espécie muito homogênea