Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-04-28T13:39:52Z No. of bitstreams: 1 2016_AndreiSteccaSteindorff.pdf: 3749164 bytes, checksum: 9a4a5c3bdc4e24bc0a92b9777e8680f2 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-04-28T20:07:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_AndreiSteccaSteindorff.pdf: 3749164 bytes, checksum: 9a4a5c3bdc4e24bc0a92b9777e8680f2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-28T20:07:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_AndreiSteccaSteindorff.pdf: 3749164 bytes, checksum: 9a4a5c3bdc4e24bc0a92b9777e8680f2 (MD5) / O controle biológico é um processo complexo que inclui diferentes mecanismos e uma diversidade de vias metabólicas. Espécies de Trichoderma harzianum são conhecidas por sua atividade de biocontrole contra patógenos de plantas. Para melhor entender os mecanismos utilizados por T. harzianum no controle biológico, no presente trabalho foi sequenciado o genoma do isolado TR274 usando sequenciamento Illumina, assim como seu respectivo transcritoma na interação direta com Scletotinia sclerotiorum ou na presença de sua parede celular. A montagem do genoma feita utilizando o programa AllPaths-LG cobertura máxima de 100x, resultou em 2282 contigs, tamanho do genoma de 40,8 Mb e um conteúdo GC de 47.7%, similar aos outros genomas de Trichoderma. Um total de 13932 genes foram anotados. Análise do Core Eukariotic Genes Dataset (CEGMA) sugere que o genoma está 100% completo e 97,9% das sequencias de RNA-seq alinharam corretamente no genoma. A análise filogenética usando proteínas ortólogas com todas as espécies de Trichoderma sequenciadas no JGI, confirmam a divisão nas seções Tricoderma (T. asperellum e T. atroviride), Longibrachiatum (T. reesei, T. citrinoviride e T. longibrachiatum) e Pachibasium (T. harzianum e T. virens). Das proteínas ortólogas anotadas, 8242 compõem proteínas compartilhadas por todas as espécies, as proteínas espécie específicas variam de 262 (T. reesei) a 1803 (T. longibrachiatum). Os dois genomas de T. harzianum analisados sugerem uma alta similaridade entre eles, mesmo tendo sido isolados de locais e continentes distintos, um de solo de cerrado no Brasil e outro de solo de jardim na Inglaterra. Análises de genes envolvidos com o metabolismo secundário, CAZymes, transportadores, proteases e fatores de transcrição foram feitas. A seção Pachibasium expandiu virtualmente todas as categorias analisadas quando comparada com as outras seções. Análise CAFE mostrou uma correlação positiva entre estas expansões e o tamanho dos genomas. O subgrupo C1 das quitinases foi completamente perdido pela seção Longibrachiatum. Estes resultados sugerem que estas famílias proteicas tem um importante papel nos seus respectivos fenótipos. As abordagens transcritômicas mostraram que a interação entre T. harzianum e S. sclerotiorum é bem complexa e envolve a produção de metabólitos secundários e síntese de transportadores antes e durante o contato, com uma modulação principalmente de enzimas hidrolíticas após o contato. Dos genes encontrados diferencialmente expressos na condição de crescimento em parede celular, 86,8% foram também encontrados diferencialmente expressos na interação direta. Cerca de 25% de todo o genoma de T. harzianum foi modulado durante a interação com S. sclerotiorum. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Biological control is a complex process, which requires many mechanisms and a high diversity of biochemical pathways. Trichoderma harzianum species complex are well known for their biocontrol activity against many plant pathogens. To gain new insights into the biocontrol mechanism employed by T. harzianum, we sequenced genome of the isolate TR274 with its transcriptome during direct interaction with the fungal pathogen Sclerotinia sclerotiorum and its cell wall, using Illumina sequencing. Whole genome assembly was performed using AllPaths-LG, with a maximum coverage of 100x. The assembly resulted in 2282 contigs, with an estimated genome size of 40.8 Mb and GC content of 47.7%, similar to other Trichoderma genomes. Using the JGI Annotation Pipeline we predicted 13,932 genes, with high transcriptome support. Core Eukariotic Genes Dataset (CEGMA) tests suggested 100% genome completeness and 97.9% of RNA-SEQ reads mapped to the genome. The phylogenetic comparison using orthologous proteins with all Trichoderma genomes sequenced at JGI, corroborates the Trichoderma section division described previously (T. asperellum and T. atroviride), Longibrachiatum (T. reesei, T. citrinoviride and T. longibrachiatum) and Pachibasium (T. harzianum and T. virens). A Venn diagram was built with orthologs proteins, with 8242 composing the core protein group and species specific varying from 262 proteins (T. reesei) to 1803 (T. longibrachiatum). The comparison between two Trichoderma harzianum CBS 226.95 and TR274 isolates, suggests a high genome similarity. Analyses of the secondary metabolites, CAZymes, transporters, proteases and transcription factors were performed. The Pachybasium section expanded virtually all categories analyzed compared with the other sections. CAFE analysis showed positive correlation between these families and genome size. The chitinase subgroup C1 was completely absent in Longibrachiatum section members. These results suggest that these proteins families play an important role on their respective phenotypes. Transcriptome analysis suggests that the interaction between T. harzianum and S. sclerotiorum is complex, involving production of secondary metabolites and transporters before and during the contact, with a modulation of CAZymes after contact. A total of 86.8% of differentially expressed genes during growth on Sclerotinia sclerotiorum cell wall were found during direct interaction. Approximately the 25% of whole T. harzianum genome was seen to be modulated during the interaction with S. sclerotiorum.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2007. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2009-11-26T16:39:45Z No. of bitstreams: 1 2007_AnaAngelicaAlvesFelix.PDF: 2494604 bytes, checksum: 8789c6d849ecc146c1154916d3f7eb96 (MD5) / Approved for entry into archive by Carolina Campos(carolinacamposmaia@gmail.com) on 2010-01-19T16:55:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_AnaAngelicaAlvesFelix.PDF: 2494604 bytes, checksum: 8789c6d849ecc146c1154916d3f7eb96 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-19T16:55:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_AnaAngelicaAlvesFelix.PDF: 2494604 bytes, checksum: 8789c6d849ecc146c1154916d3f7eb96 (MD5) Previous issue date: 2007 / Amostras de sementes de plantas nativas de matas, cerrado e de campo empregadas para a confecção de artesanato de várias regiões do Brasil foram avaliadas quanto aos aspectos fitossanitários. Realizou–se o levantamento e identificação de fungos associados às sementes, bem como os sintomas nas mesmas. Técnicas de desinfestações superficiais e de tratamento natural com uma solução de óleos vegetais extraídos de essências florestais foi empregada para o controle dos fungos. As sementes de Euterpe oleraceae, E. precatoria var. precatoria, Dipterix alata, Orbignya phalerata, Phytelephas macrocarpa, Socratea exorrhiza, Hymenaea courbaril L. var. stilbocarpa, Leucaena leucocephala, Schefflera morototoni, Astrocaryum faranae, Sapindus saponaria, Ipomoea pes-caprae, Caesalpinia peltophoroides, Heliconia metallica, Cyperus rotundus e Astrocaryum aculeatum, apresentaram – se naturalmente infectadas com uma gama significante de fungos. Os fungos mais freqüentes associados às sementes foram Alternaria alternata, Aspergillus spp., Cladosporium sp., Chaetomium sp., Botryodiplodia sp., Epicoccum sp., Eurotium sp., Fusarium sp., Monilia sp., Nigrospora sphaerica, Penicillium sp., Pestalotiopsis sp., Phialophora sp., Rhizoctonia sp., Rhizopus sp., Syncephalastrum sp. e Verticillium sp. Os danos causados por estes fungos foram deformações, manchas necróticas, podridões moles e deterioração parcial ou total das sementes. O tratamento com a solução de óleos foi bastante eficiente para todos os fungos, com a erradicação da maioria deles. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Some seed samples of native plants from forestry, cerrado and savannas which are currently employed for the confection of handcrafts from several brazilian regions were valued as far as the phytosanitary aspects are concerned. The fungi overview and identification associated to the seeds as well as their symptoms were accomplished. Techniques of superficial de-infections and natural treatment with appropriate vegetable oil solutions extracted from tree essences were used to the control of fungi studied in the current work. Seeds of Euterpe oleraceae, E. precatoria var. precatoria, Dipterix alata, Orbignya phalerata, Phytelephas macrocarpa, Socratea exorrhiza, Hymenaea courbaril L. var. stilbocarpa, Leucaena leucocephala, Schefflera morototoni, Astrocaryum faranae, Sapindus saponaria, Ipomoea pes-caprae, Caesalpinia peltophoroides, Heliconia metallica, Cyperus rotundus and Astrocaryum aculeatum, have shown themselves naturally infected with a significant range of fungi. The most frequent fungi associated to the seeds were Alternaria alternata, Aspergillus spp., Cladosporium sp., Chaetomium sp., Botryodiplodia sp., Epicoccum sp., Eurotium sp., Fusarium sp., Monilia sp., Nigrospora sphaerica, Penicillium sp., Pestalotiopsis sp., Phialophora sp., Rhizoctonia sp., Rhizopus sp., Syncephalastrum sp. e Verticillium sp. The damages caused by these fungi have been associated to deformations, necrotic spots and soft rotten as well as partial or total decay of seeds. The treatment we propose here was accomplished with the natural oils solution and it has been shown that the proposed technique is very efficient in the control of all the fungi for the complete eradication of them.

Dentre as principais doenças que afetam a bananeira está a Sigatoka-amarela, causada pelo fungo Mycosphaerella musicola Leach. O objetivo do trabalho foi estudar a diversidade genética e estrutura populacional do fungo M. musicola nas principais regiões produtoras de banana, assim como verificar se a estrutura populacional está correlacionada com a origem geográfica. Para isto, foram avaliados 83 isolados coletados nos Estados da Bahia (BA), Rio Grande do Norte (RN) e Minas Gerais (MG) por meio dos marcadores SSR, ISSR e pela combinação dos dois (SSR/ISSR). De acordo com a AMOVA, para as três análises ocorreu maior variação genética entre os haplótipos dentro de municípios, em que apenas com o uso dos ISSR não foi significativo. Alta variabilidade foi detectada entre os isolados, com os primers combinados observou-se 100% haplótipos distintos, com os SSR 98,79 % de haplotipos únicos e com os ISSR foram 83,13 % haplótipos diferentes. Em relação à composição genética com base no agrupamento Bayesiano, notou-se a presença de 21 prováveis grupos ancestrais para as localidades em estudo com os primers combinados, diferente do que ocorreu com o uso dos SSR e dos ISSR, em que foram encontrados 14 prováveis grupos ancestrais. O maior valor de Gst foi de 0,11 entre RN e MG para os SSR, já o Nm que indica o fluxo gênico foi alto entre todos os Estados. Em relação ao IA e rd, a hipótese de recombinação sexual foi aceita para algumas microrregiões no estudo. Contudo, não foi detectada nenhuma estruturação da população de acordo com os locais de coleta, sendo que o conhecimento sobre a distribuição da variabilidade genética de M. musicola irá auxiliar nas estratégias para o controle da doença. / Dentre as principais doenças que afetam a bananeira está a Sigatoka-amarela, causada pelo fungo Mycosphaerella musicola Leach. O objetivo do trabalho foi estudar a diversidade genética e estrutura populacional do fungo M. musicola nas principais regiões produtoras de banana, assim como verificar se a estrutura populacional está correlacionada com a origem geográfica. Para isto, foram avaliados 83 isolados coletados nos Estados da Bahia (BA), Rio Grande do Norte (RN) e Minas Gerais (MG) por meio dos marcadores SSR, ISSR e pela combinação dos dois (SSR/ISSR). De acordo com a AMOVA, para as três análises ocorreu maior variação genética entre os haplótipos dentro de municípios, em que apenas com o uso dos ISSR não foi significativo. Alta variabilidade foi detectada entre os isolados, com os primers combinados observou-se 100% haplótipos distintos, com os SSR 98,79 % de haplotipos únicos e com os ISSR foram 83,13 % haplótipos diferentes. Em relação à composição genética com base no agrupamento Bayesiano, notou-se a presença de 21 prováveis grupos ancestrais para as localidades em estudo com os primers combinados, diferente do que ocorreu com o uso dos SSR e dos ISSR, em que foram encontrados 14 prováveis grupos ancestrais. O maior valor de Gst foi de 0,11 entre RN e MG para os SSR, já o Nm que indica o fluxo gênico foi alto entre todos os Estados. Em relação ao IA e rd, a hipótese de recombinação sexual foi aceita para algumas microrregiões no estudo. Contudo, não foi detectada nenhuma estruturação da população de acordo com os locais de coleta, sendo que o conhecimento sobre a distribuição da variabilidade genética de M. musicola irá auxiliar nas estratégias para o controle da doença. / Among the major diseases affecting banana is yellow Sigatoka, caused by Mycosphaerella musicola Leach. The objective was to study the genetic diversity and population structure of the fungus M. musicola, the main banana-producing regions. Additionally, we investigated the population structure is correlated with geographic origin. For this, we evaluated 83 isolates collected in the states of Bahia (BA), Rio Grande do Norte (RN) and Minas Gerais (MG) through SSR, ISSR and the combination of the two (SSR / ISSR). According to AMOVA analysis for the three most genetic variation occurred among haplotypes within municipalities, in which only the use of ISSR was not significant. High variability was detected among isolates, with primers combined observed distinct haplotypes 100%, with 98.79% of SSR haplotypes with unique and ISSR were 83.13% different haplotypes. Regarding the genetic composition based on Bayesian clustering was noted the presence of 21 probable ancestral groups for study sites with primers combinations, different from what occurred with the use of SSR and ISSR were found in which the presence of 14 probable ancestral groups. The highest Gst was 0.11 between RN and MG for SSR, already Nm indicating gene flow was high among all states. Compared to IA and rd, the hypothesis was accepted for sexual recombination in some micro study. However, it was not detected any structuring of the population according to the sampling sites, and the knowledge about the distribution of genetic variability of M. musicola will assist in strategies to control the disease. / Dissertação submetida ao Colegiado de Curso do Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia e Embrapa Mandioca e Fruticultura, como requisito para obtenção do Grau de Mestre em Recursos Genéticos Vegetais.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-05-07T17:49:19Z No. of bitstreams: 1 2014_MarcellaTelesdosReis.pdf: 3786731 bytes, checksum: 10325c274157e8e088a67c87d434c89c (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-05-15T14:34:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_MarcellaTelesdosReis.pdf: 3786731 bytes, checksum: 10325c274157e8e088a67c87d434c89c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-15T14:34:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_MarcellaTelesdosReis.pdf: 3786731 bytes, checksum: 10325c274157e8e088a67c87d434c89c (MD5) / O Brasil se destaca no cenário mundial como um dos principais produtores de feijão. Entretanto, vários problemas fitossanitários contribuem para redução da renda líquida auferida na exploração da cultura, entre os quais, o mofo branco e a podridão de escleródio, causadas pelos fungos Sclerotinia sclerotiorum (SS) e Sclerotium rolfsii (SR), respectivamente, reconhecidas como principais doenças do feijão. O controle biológico, pelo uso de Trichoderma tem sido proposto como um dos métodos de manejo das doenças. Espécies desse gênero possuem grande importância agronômica e atuam como decompositores primários de matéria orgânica, destacando-se também pela produção de metabólitos e enzimas com propriedades antifúngicas. Em face disso, o trabalho foi conduzido com o objetivo de identificar isolados de Trichoderma com potencial de uso contra SS e SR. Cento e quarenta e nove isolados foram testados in vitro e 50 destes foram pré-selecionados e identificados com base no seqüenciamento das regiões ITS e TEF do rDNA. Dentre esses, foram identificadas sete espécies do gênero Trichoderma: T. harzianum, T. stromaticum, T. koningiopsis, T. asperellum, T. tomentosum, T. spirale e T. erinaceum. Vinte isolados foram testados em casa de vegetação. Resultados desse estudo mostram que, in vitro, 10,6% dos isolados testados contra SS e 14% contra SR apresentaram nota 1 no pareamento de cultura; 15,33% dos isolados para SS e 4,6% para SR mostram níveis elevados de antagonismo quanto a inibição micelial do patógeno por metabólitos não-voláteis. Dos 20 isolados selecionados para os estudos em casa de vegetação, quatro se destacaram: CEN207 (T. koningiopsis), CEN188 (T. spirale), CEN200 (T. koningiopsis) e CEN189 (T. spirale) sobre os demais quanto a promoção de crescimento. A técnica de identificação por MALDI TOF MS foi utilizada com oito dos isolados de Trichoderma previamente identificados com base no sequenciamento de fragmentos do DNA, agrupando-se de acordo com as espécies, conforme o esperado e formando clados no dendograma. Metabólito bruto extraído do isolado CEN277 (T. asperellum) foi analisado em HPLC e mostrou grande potencial quanto à inibição do crescimento micelial de S. sclerotiorum. As técnicas utilizadas com cromatografia líquida e MALDI TOF MS, embora iniciais, proporcionaram resultados interessantes e necessitam de mais dedicação para a obtenção de resultados conclusivos na identificação das moléculas envolvidas. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Brazil stands out in the global scenario as one the leading producers of beans. However, many phytossanitary problems contribute to a reduction of yield, including white mold and sclerotia rot, caused by the fungi Sclerotinia sclerotiorum (SS) and Sclerotium rolfsii (SR) respectively, whith are recognized as major bean diseases. Biological control using Trichoderma has been proposed as a method of managing these diseases. Species of this genus are, of great agronomic interest and act as primary decomposers of organic material and are, also highlighted by the production of enzymes and metabolites with antifungal properties. For this reason, this study was conducted in order to identify Trichoderma isolates able to implement the biocontrol of these diseases. One hundred forty-nine isolates were tested in vitro and 50 of these were pre-selected and identified based on sequencing of the TEF and ITS regions of rDNA. Seven species of Trichoderma have been identified based on molecular characterization: T. harzianum, T. stromaticum, T. koningiopsis, T. asperellum, T. tomentosum, T. spirale and T. erinaceum. Among fifty isolates, 20 were tested under greenhouse conditions. Results of this study show that, in vitro, 10.6% of the isolates tested against SS and 14% against SR reached note 1 in paired culture; 15.33% of the isolates for SS and 4.6% for SR show elevated levels of antagonism regarding pathogen mycelial inhibition by non-volatile metabolits. From 20 isolates selected for studies under greenhouse conditions, four stood out compared to others, as promoting growth: CEN207 (T. koningiopsis), CEN188 (T. spirale), CEN200 (T. koningiopsis) and CEN189 (T. spirale). The technique of identification by MALDI TOF MS was used with eight isolates of Trichoderma previously identified based on DNA sequencing, grouped according to the species, as expected forming a clade on the dendrogram. Crude metabolite extracted from the CEN277 (T. asperellum) was analyzed by HPLC and showed great potential for the inhibition of mycelial growth of S. sclerotiorum. The techniques used in liquid chromatography and MALDI TOF MS, although preliminars, have provided interesting results and motivate further studies to identils the involved molecule.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-20T16:55:33Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 232626 bytes, checksum: 3d71a89873b7240693ecafd0c807a8fd (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-20T16:55:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 232626 bytes, checksum: 3d71a89873b7240693ecafd0c807a8fd (MD5) Previous issue date: 2002-06-21 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Cento e dezessete actinomicetos, sendo 96 obtidos de diferentes amostras de rizosfera e rizoplano de tomateiro e 21 culturas pré-selecionadas por Moura (1996), pela ação contra Ralstonia solanacearum, foram avaliados no controle biológico de Pseudomona syringae pv. tomato e Alternaria solani através microbiolização de sementes de tomateiro (Santa Cruz 'Kada'), seguindo-se o plantio em solo não-tratado e inoculação como os patógenos. A seleção massal, realizada em casa de vegetação, permitiu selecionar, pela contagem do número de lesões, o antagonista mais promissor (RD-01). Paralelamente, foram conduzidos teste de colonização de raízes de tomateiro em tubos contendo ágar- água, não inclinados, e testes de antibiose com os 117 antagonistas contra os patógenos Pseudomonas syringae pv. tomato, Xanthomonas campestris pv. vesicatoria e Alternaria solani, pelo método da sobre-camada. Cerca de 88% dos antagonistas não tiveram nenhum efeito inibitório contra os patógenos testados apesar de 70% destes terem sido capazes de colonizar raízes em condições gnotobióticas. Em testes para o controle de Corynespora cassiicola, Stemphylium solani, Xanthomonas campestris pv. vesicatoria e Ralstonia solanacearum em casa de vegetação, o isolado RD-01 demonstrou incapacidade em reduzir sintomas incitados pelo patógeno de solo, Ralstonia solanacearum, mas apresentou potencial como agente de biocontrole dos patógenos foliares. Através de um ensaio de promoção de crescimento, realizado em casa de vegetação com os cento e dezessete isolados, pode-se concluir a inexistência de uma relação entre o efeito de promoção de crescimento vegetal para os isolados testados com os resultados de biocontrole observados em experimento anterior. Em experimento de campo para o controle de Phytophthora infestans e Alternaria solani, dois actinomicetos pré-selecionados (RD-01 e SON-17) foram aplicados através da microbiolização de sementes de tomateiro e pela colonização do filoplano, respectivamente. Apesar de o controle químico ter sido mais efetivo que os actinomicetos, estes revelaram sua potencialidade como medida passível de utilização em procedimentos de manejo integrado, a qual precisa ser mais explorada. / One hundred and seventeen actinomycetes were used in the microbiolization of tomato seeds, followed by the sowing in non-treated soil. From these, 96 were isolated from samples of tomato rizosfere, and 21 cultures had been pre-selected by Moura (1996) for their action against Ralstonia solanacearum. At the same time, root colonization tests with tomato grown in test tubes containing water-agar and antibioses tests were conducted with the antagonists against the pathogens Pseudomonas syringae pv. tomato, Xanthomonas campestris pv. vesicatoria and Alternaria solani. Nearly 88% of the antagonits had no inhibitory effect against the tested pathogens despite 70% of these had been able to colonize the roots in gnotobiotic conditions. Mass selection, to control P. s. pv. tomato and A. solani, allowed the selection of the most promising antagonist (RD-01), though the reduction of the number of lesions. In a greenhouse test for the control of Corynespora cassiicola, Stemphylium solani, X. c. pv. vesicatoria e R. solanacearum, the isolate RD-01 was unable to reduce symptoms incited by the soilborne pathogen, R. solanacearum, but presented potential as biocontrol agent of the foliar pathogens. A greenhouse essay was conducted to evaluate the plant-growth promotion by the 117 rhizobacteria, and no correlation could be observed between the effect of growth promotion and the biocontrol effect observed in a previous experiment. In a field experiment to control Phytophthora infestans and A. solani, two pre- selected actinomyces (RD-01 e SON-17) were applied through tomato seed microbiolization and phylloplan colonization, respectively. Even though the chemical control was more effective than the actinomycetes, these showed their potential of use in integrated disease management, which needs to be more explored. / Dissertação importada do Alexandria