The structure of the voltage-gated proton (H+) channel Hv1 is homologous to the voltage sensor domain (VSD) of tetrameric voltage-gated Na+, K+ and Ca2+ channels (VGCs), but lacks a pore domain and instead forms a homodimer. Similar to other VSD proteins, Hv1 is gated by changes in membrane potential (V), but unlike VGCs, voltage-dependent gating in Hv1 is modulated by changes in the transmembrane pH gradient (DpH = pHo - pHi). In Hv1, pHo or pHi changes shift the open probability (POPEN)-V relation by ~40 mV per pH unit. To better understand the structural basis of pHo-dependent gating in Hv1, we constructed new resting- and activated-state Hv1 VSD homology models using physical constraints determined from experimental data measured under voltage clamp and conducted all-atom molecular dynamics (MD) simulations. Analyses of salt bridges and calculated pKas at conserved side chains suggests the existence of intracellular and extracellular electrostatic networks (ICEN and ECEN, respectively) that stabilize resting- or activated-state conformations of the Hv1 VSD. Structural analyses led to a novel hypothesis: two ECEN residues (E119 and D185) with coupled pKas coordinately interact with two S4 ‘gating charge’ Arg residues to modulate activated-state pHo sensitivity. Experimental data confirm that pH-dependent gating is compromised at acidic pHo in Hv1 E119A-D185A mutants, indicating that specific ECEN residue interactions are critical components of the ∆pH-dependent gating mechanism. E119 and D185 are known to participate in extracellular Zn2+ coordination, suggesting that H+ and Zn2+ utilize similar mechanisms to allosterically modulate the activated/resting state equilibrium in Hv1.

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Passive permeability of drug molecules through biological membranes is a fundamentally important process that involves the partitioning of molecules into the lipid bilayer membrane and passive permeation across the membrane. The majority of the drug molecules are either weak bases or acids. For these drugs, along with lipophilicity and other physicochemical properties, the acid/base nature and ionization constant (pKa) are very important for predicting their passive permeation across biological barriers. Depending on the pKa of ionizable groups, drug molecules may coexist in various biological fluids both their charged and uncharged forms to varying extents. According to the widely known pH-partition hypothesis, only the uncharged form of ionizable molecules contributes to the passive permeability. Therefore, permeability and absorption rate should be proportional to the molar fraction of the uncharged form in the bulk medium. However, there is ample evidence of deviations from this linear relationship manifesting in nonlinear passive permeability vs fraction unionized plots. It is possible that the assumption of a constant pKa for ionizable drugs contributes to many of these cases of apparent deviations which cannot be explained by other factors such as paracellular or active transport. Studies have provided evidence for pKa shifts of ionizable drugs when partitioned into different bilayer lipid membrane systems.It is thought that electrostatic interaction between the membrane partitioned charged solutes and phospholipid charged headgroups contributes to the pKa shift (apparent pKa) which can change the uncharged fraction in the membrane interface causing a proportional change in the passive permeation rate from the expected rate predicted with an aqueous pKa. This would appear as a violation of the pH-partition hypothesis when other contributing factors can be ruled out. Therefore, a surrogate membrane phospholipid system (DAPC/n-hexane) was employed to investigate potential pKa shifts following interaction between phospholipid charged headgroups and ionizable drugs. Several probe drugs of acidic, basic and neutral nature were investigated with this biphasic surrogate system with controls at different aqueous pH levels to determine their apparent pKa values. The partitioning of compounds into membranes can be thought of as an integral part of membrane permeability. Extensive partitioning of drug molecules into the intracellular membranes which constitute the majority of all the cell membranes potentially results in the observed lag phase in monolayer permeability assays. Hepatocyte drug binding correlates strongly with microsomal drug binding suggests that binding to cells is presumably a result of non-specific drug partitioning into membranes. For this reason, cellular drug distribution equilibrium in the cells might not be achieved instantaneously, as is often assumed in permeability models and perfusion-limited PBPK models. Therefore, characterization of this early distribution phase by observing the time course of the free drug concentration in drug-spiked cell suspensions (MDCK & rat hepatocyte) was pursued with a novel in vitro microdialysis approach followed by in silico investigations with mathematical modeling. Depending on the drug, the apparent pKa values in the surrogate membrane system at different pH levels indicate significant shift from the inherent pKa values of the ionizable probe drugs. The in vitro microdialysis technique allowed the determination of the time course of free drug concentration in MDCK and rat hepatocyte cell suspensions spiked with probe drugs with high temporal resolution. Two mechanistic models developed with intracellular membrane compartment along with lysosomal or mitochondrial ion-trapping compartment resulted in excellent model fitting for the observed time-course data in MDCK cell and rat hepatocyte suspensions for tolbutamide and metoprolol, respectively. / Pharmaceutical Sciences

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Le récepteur à l'inositol 1,4,5-trisphosphate (IP[indice inférieur 3]R) est un canal calcique jouant un rôle prépondérant dans le contrôle du calcium à l'intérieur des cellules non-excitables. Il existe trois sous-types d'IP[indice inférieur 3]R qui sont encodés par des gènes différents. L'objectif de mon travail était d'évaluer la régulation des IP[indice inférieur 3]Rs par différents mécanismes extrinsèque et intrinsèque. Avec une approche in vitro , nous avons montré que l'IP[indice inférieur 3]R-3 est un substrat de la protéine kinase dépendante de l'AMPc (PKA). Avec une approche de"backphosphorylation", nous avons également montré que la PKA phosphoryle de manière endogène l'IP[indice inférieur 3]R-3 dans les cellules RINm5F intactes. Avec des études de liaison, nous avons montré que la PKA augmente l'affinité de l'IP[indice inférieur 3]R-3. La mesure des relâches de Ca[indice supérieur 2+] induites par l'IP[indice inférieur 3] sur des cellules perméabilisées a aussi révélé que la PKA augmente l'affinité apparente de l'IP[indice inférieur 3]R-3. Enfin, dans des cellules RINm5F intactes, la PKA a potentié la relâche de Ca[indice supérieur 2+] induite par le carbachol et le facteur de croissance épidermique, deux agonistes qui activent la phospholipases C par des mécanismes différents. Ces résultats ont révélé une étape de convergence où la voie de signalisation de l'AMPc et la voie de signalisation du Ca[indice supérieur 2+] interagissent pour moduler différentes fonctions au sein d'une seule et même cellule face à des stimuli externes. Les différents domaines des IP[indice inférieur 3]Rs ont des rôles particuliers dans le contrôle fin de l'homéostasie calcique intracellulaire. Nous avons montré qu'un mutant tronqué de l'IP[indice inférieur 3]R-2 (CTR2), qui ne comporte que les 2 derniers domaines transmembranaires et la queue C-terminale, se comporte comme un canal calcique constitutivement actif. Les cellules exprimant le CTR2 ont moins de Ca[indice supérieur 2+] dans leurs réserves intracellulaire [sic], relâchent moins de Ca[indice supérieur 2+] en réponse aux agonistes et montrent une entrée capacitative de Ca[indice supérieur 2+] en conditions basales. Ces résultats suggèrent qu'en absence d'une régulation intrinsèque par sa portion N-terminale, l'IP[indice inférieur 3]R-2 se comporte comme un canal calcique ouvert. L'ensemble de mon travail met en évidence un mécanisme extrinsèque (PKA) et un mécanisme intrinsèque (N-terminal) de régulation de l'activité des IP[indice inférieur 3]Rs.

La première augmentation de la longévité en laboratoire fût observée à la suite d’une intervention nutritionnelle consistant en une réduction de l’apport alimentaire chez le rat. Plus tard, ce phénomène a été reproduit dans de très nombreuses espèces et référé en tant que restriction calorique. Le développement des techniques de biologie moléculaire moderne a permis de montrer dans des organismes modèles simples que cette flexibilité du processus de vieillissement était régulée par des facteurs génétiques. De fait, plusieurs mécanismes cellulaires ont alors pu être identifiés comme responsables de ce contrôle du vieillissement. Ces voies de régulation ont révélées être conservées entre les espèces, depuis les levures jusqu’aux organismes multicellulaires tels que le nématode, la mouche ou la souris, suggérant l’existence d’un programme universel de vieillissement dans le vivant. La levure s’est avéré à plusieurs reprises être un modèle puissant et fiable pour la découverte de gènes impliqués dans ce phénomène. Mon étude a consisté au développement d’un nouveau modèle unicellulaire d’étude du vieillissement à travers l’espèce Schizosaccharomyces pombe appelée aussi levure à fission. La première étape de mon travail a montré que les voies de détection des nutriments gouvernées par la sérine/thréonine protéine kinase A (Pka1) et la sérine/thréonine kinase Sck2 contrôlent le vieillissement chronologique de ces cellules comme il était connu dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Ceci permit de valider l’utilisation de la levure à fission pour l’étude du vieillissement. Ensuite, nous avons analysé plus en détail l’effet pro-vieillissement du glucose en étudiant le rôle de sa détection par le récepteur membranaire Git3 couplé à la protéine G (Gpa2) en amont de la kinase Pka1. La perte du signal du glucose par la délétion de Git3 imite partiellement l’effet d’augmentation de longévité obtenu par baisse de la concentration en glucose dans le milieu. De plus, l’effet néfaste du signal du glucose est maintenu en absence de tout métabolisme du glucose suite à la mutation des hexokinases, premières enzymes de la glycolyse. L’ensemble de ces résultats suggèrent que la signalisation du glucose est prédominante sur son métabolisme pour son effet pro-vieillissement. D’autre part, à la fois la suppression de cette signalisation et la baisse de niveau de glucose disponible allongent la durée de vie en corrélation avec une augmentation de la résistance au stress, une hausse d’activité mitochondriale et une baisse de production de radicaux libres. Finalement, le criblage d’une banque de surexpression d’ADNc a permis d’identifier plusieurs gènes candidats responsables de ces effets en aval de la voie de signalisation Git3/PKA. La recherche sur les mécanismes moléculaires du vieillissement propose une nouvelle approche, un nouvel angle de vue, pour la compréhension des fonctions cellulaires et promet d’apporter de précieuses clefs pour mieux comprendre certaines maladies. En effet, le vieillissement est la première cause d’apparition de nombreuses affections comme les cancers, les maladies cardiovasculaires et métaboliques ou les maladies neurodégénératives tels que les syndromes d’Alzheimer et de Parkinson. / The first increase in life span due to man’s intervention was obtained with rats subjected to a diet reduced in calorie intake. Later, this phenomenon was repeated with many other species and referred as diet restriction or calorie restriction. The development of modern Molecular Biology approaches and the use of simple model organisms demonstrated that the rate of aging was regulated by genetic traits. Indeed, several cellular mechanisms were identified as responsible for the control of aging. These regulatory pathways appear to be conserved throughout species, from yeast to multicellular organisms like nematode, fly and mice, thus suggesting the existence of a universal program of aging. Yeast proved several times to be a powerful and reliable model for discovering genes involved in the regulation of aging. My study consisted in developing Schizosaccharomyces pombe (also called fission yeast) as a new unicellular model to study aging. The first step of my work was to show that pathways of nutrient detection through kinases involving Pka1 and Sck2 control chronological aging in S. pombe, as it was previously demonstrated in Saccharomyces cerevisiae. This first work validated the use of fission yeast for the study of aging. Subsequently, we analysed in more detail the pro-aging effect of glucose focusing on the role of its signalling through the G-protein Gpa2-coupled membrane receptor Git3, which acts upstream of Pka1. The loss of the glucose signal due to deletion of Git3 mimics partially the effect of increasing longevity by reducing glucose in the medium. Moreover, detrimental effects of glucose signal are maintained in absence of sugar metabolism following loss of hexokinases, the first enzymes of glycolysis. Together, these results suggest that the pro-aging effects of glucose signalling are predominant over those due to metabolism of this sugar. Moreover, both obliteration of this signalling pathway and decrease of glucose availability extend life span, and correlate with an increase in stress resistance, in mitochondrial activity and a lower production of free radicals. Finally, screening a cDNA-overexpression library allowed us to identify several genes candidates responsible for the effects on longevity downstream of Git3/Pka1. Research in the molecular mechanisms of aging propose holds the promise to bring precious clues as to this mysterious processes affecting all living creatures, and paves the way to unravel the underlying causes of many human diseases. Indeed, aging is the first cause of numerous late-onset pathologies including cancers, cardiovascular diseases or neurodegenerative diseases like Alzheimer and Parkinson syndromes.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Tous les modèles théoriques, mathématiques et empiriques utilisés pour l’évaluation de la mobilité électrophorétique de peptides regroupent trois paramètres de base : la masse du peptide, son nombre de résidus (sa longueur) et sa charge. Or, ces modèles ont une faiblesse commune qui est le paramètre de charge (q). Lors de l’estimation de cette variable, l’usage d’approximation pour les constantes de dissociation acide (pKa) des groupes ionisables des peptides entraîne une erreur sur ce calcul. Une solution utilisée par plusieurs auteurs est de développer les modèles pour la mobilité à bas pH seulement en assumant la protonation complète de tous les groupes acides et basiques. Afin de comprendre l’effet du résidu acide aminé (a.a.) voisin sur l’ionisation des groupes carboxyles et amines terminaux (Cʹ et Nʹ) d’un peptide, les valeurs de pKa de plusieurs séries de peptides ont été déterminés par CE suite à l’optimisation d’une méthode. Les peptides étudiés étaient de type Z-X et X-Z où X est un ou plusieurs résidus voisins variable tandis que Z est un résidu invariable tel la phénylalanine, la glycine et l’alanine. L’objectif primaire de ce projet consistait à déterminer les valeurs réelles du pKa des groupes Cʹ et Nʹ de 69 peptides afin d’élucider l’effet de leur environnement immédiat, i.e., le résidu voisin. Ce travail systématique de compilation des pKa est une approche rarement utilisée. En ayant accès à ces valeurs, la source d’incertitude sur les constantes d’ionisation des peptides auquel font face beaucoup d’auteurs est éliminée. Ceci permet une analyse plus approfondie de leur comportement électrophorétique. Pour la série de dipeptides étudiés, nous avons observé que plus l’hydrophobicité du résidu X augmentait, plus les pKa Cʹ et Nʹ baissait selon le résidu Z. Les résidus X hydrophiles possèdent des chaines latérales chargées ou très polaires qui influencent de façon plus importante le processus d’ionisation que les résidus X hydrophobes. Les données analysées ont aussi permis de déterminer que plus la distance du résidu X au Cʹ ou Nʹ est grande, plus son influence sur le pKa diminue. Également, le prolongement d’un peptide de 1 à 6 résidus, tel les oligoglycines, fait augmenter le pKa-Cʹ et diminuer le pKa-Nʹ via un processus expliqué par la réduction des interactions électrostatiques entre les fonctions Cʹ et Nʹ. Ces résultats illustrent que les pKa Cʹ et Nʹ de peptides ne sont pas exacts lorsqu’ils sont basés uniquement sur l’identité de l’acide aminé terminal, comme c’est le cas pour l’approche classique de modélisation. Les valeurs de pKa de dipepides obtenus par titrages potentiométriques ont été comparés aux pKa déterminés par CE. Des écarts importants ont été obtenus ce qui a mis en lumière la nécessité de contrôler les protocoles expérimentaux de manière rigoureuse pour mieux comparer les résultats provenant de deux techniques. Par la suite, à l’aide des mobilités de peptides obtenus expérimentalement à haut et bas pH, nous avons comparé les résultats de modélisations calculés pour les pKa expérimentaux à ceux de la littéraire afin d’évaluer les avantages du modèle d’Offord. Enfin, des simulations de séparations par CE de 9 peptides obtenues avec les programme informatique PeakMaster ont été comparées avec les résultats expérimentaux. Ceci a démontré l’utilité et la supériorité des pKa expérimentaux comparativement aux pKa les plus communément utilisés avec les approches traditionnelles. / All theoretical, mathematical and empirical models used to evaluate the electrophoretic mobilities of peptides use three basic parameters: the peptide mass, its number of residues (its length) and its charge. However, all models have a common flaw: the charge parameter (q). When estimating this variable, the use of approximations for the ionization constants (pKa) leads to imprecise values for the calculation. One solution is to limit the development of mobility models to only low pH and assume full protonation of all acidic and basic groups. In order to understand the effect of the neighboring amino acid (a.a.) residue on the terminal carboxylate and amine functions of a peptide (Cʹ et Nʹ), the pKa values of multiple series of peptides were determined by capillary electrophoresis (CE) using an optimized method. The peptides studied were of the form Z-X and X-Z, where X was one or multiple variable residues and Z was an invariable residue such as phenylalanine, glycine or alanine. The core of this project consisted of determining the actual Cʹ and Nʹ pKa values for 69 peptides to elucidate the effect of their immediate microenvironment. i.e., the effect of their nearest neighbor. This systematic compilation of pKa’s is an approach that is rarely used. With these values on hand, the uncertainty of the ionisation constant that most authors face is almost eliminated and the analysis of the electrophoretic behavior of peptides can be enhanced. For the peptides studied, we observed that increasing the hydrophobicity of residue X lead to a decrease in Cʹ and Nʹ pKa values, but to different degrees depending on the terminal residue (Z) studied. Hydrophilic X residues possess charged or highly polar side-chains, which influenced Cʹ and Nʹ ionisations to a greater degree than hydrophobic X residues. Additionally, the elongation of a peptide from one to six residues, such as the oligoglycine series studied, lead to an increase in pKa-Cʹ and a decrease in pKa-Nʹ, which might be explained by a diminishing electrostatic interaction between the Cʹ and Nʹ functional groups. These results illustrate that the Cʹ and Nʹ pKa values for peptides are not accurate when based solely on the identity of the Cʹ and Nʹ a.a. residues, which is the classical way peptide charge is estimated for modeling not only mobilities but also chemical and biological reactivity. Potentiometric titration of dipeptides produced pKa values that were compared to pKa’s determined by CE. Significant discrepancies were obtained which brought to light the necessity of rigorously controlling experimental protocols when comparing results obtained with two techniques. Mobility data for high and low pHs were calculated using experimental and literature tabulated pKa values to estimate charge and to therefore understand the benefit gained when applying the Offord mobility model. Finally, simulations of separating 9 peptides by CE were carried out with the computer program PeakMaster and compared with experimental results. This showed the utility and superiority of our cumulated pKa values versus the most widely cited approximate pKa values from the literature.

Dans le système nerveux central, le principal effecteur de la voie de transduction de l'AMPc<br />est la protéine kinase activée par l'AMPc (PKA). L'activation de la PKA est impliquée dans de<br />nombreux processus comme la modulation de l'excitabilité neuronale par phosphorylation de<br />canaux ioniques, de l'homéostasie cellulaire par phosphorylation de cibles cytosoliques et de la<br />régulation génique par phosphorylation de facteurs de transcription. La régulation de l'activité de la<br />PKA ainsi que son activation spatiale et temporelle sont des paramètres indispensables à la<br />compréhension des mécanismes cellulaires à l'origine des effets de cette voie de seconds messagers.<br />Faute d'approches méthodologiques adaptées, très peu d'études se sont intéressées à la dynamique<br />spatiale et temporelle, à la spécificité et à la régulation de l'activité de la PKA dans les neurones.<br />Grâce aux sondes fluorescentes codées génétiquement, il est possible maintenant d'avoir<br />accès à ces paramètres. A l'aide d'un vecteur viral, nous avons fait exprimer une sonde sensible à<br />l'activité PKA (sonde AKAR pour A-kinase activity reporter) dans des préparations de neurones en<br />tranches. Cette sonde utilise le principe du transfert d'énergie par résonance (FRET) et permet de<br />mesurer par imagerie ratiométrique l'activité kinase de la PKA. Nous avons montré que la sonde<br />AKAR2, exprimée dans les neurones, modifie son spectre d'émission en réponse à une stimulation<br />de la voie AMPc. L'utilisation d'une sonde mutante, dont le site de phosphorylation a été modifié,<br />démontre que les changements observés dans le spectre d'émission de la sonde AKAR2 sont bien<br />attribuables à une phosphorylation.<br />Dans une première partie, nous avons étudié la phosphorylation de protéines cibles de la<br />PKA dans différents compartiments subcellulaires en réponse à différentes stimulations<br />extracellulaires. La phosphorylation de la sonde AKAR2, nous a permis de suivre en temps réel<br />l'activité de la PKA dans le cytosol. Afin de mesurer l'activité de la PKA dans le noyau, nous avons<br />adressé la sonde AKAR2 en utilisant un signal de localisation nucléaire (NLS). Enfin, la mesure de<br />l'activité de la PKA à la membrane a été réalisée grâce à l'étude de la phosphorylation des canaux<br />responsables du courant de l'AHP lente (IsAHP). Nous avons montré que la phosphorylation des<br />canaux ioniques est plus rapide que la phosphorylation des cibles cytosoliques, elles-mêmes plus<br />rapide que la phosphorylation des protéines nucléaires. De plus, nous avons montré que l'activité de<br />la PKA stimulée par l'activation de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) est différente de<br />l'activation directe des adénylyl cyclases (AC). En effet, l'activation de la PKA résultant de la<br />stimulation des RCPG produit des amplitudes de phosphorylation plus faible de la sonde AKAR2<br />dans le cytosol et le noyau.<br />Dans une deuxième partie, nous avons étudié le rôle des phosphodiestérases de type 4<br />(PDE4) dans la régulation des réponses β-adrénergiques. L'inhibition des PDE4 produit une<br />activation de la PKA dans les neurones traduisant ainsi une activité tonique des AC. Nous montrons<br />également que l'inhibition des PDE4 permet de potentialiser l'activité de la PKA en réponse à de<br />faibles concentrations d'agonistes β adrénergiques. Cette famille de PDEs, en dégradant l'AMPc,<br />participe donc à la régulation et la propagation des signaux PKA dans les neurones.<br />Enfin, au cours de ma thèse, je me suis également intéressé au γ-hydroxybutyrate (GHB)<br />composé qui est utilisé pour soigner certains troubles du sommeil et provoque chez le rat<br />l'apparition de signes comportementaux et de tracés encéphalographiques similaires à ceux observés<br />chez l'humain lors de crises d'épilepsie de type absence. L'ensemble de ces effets du GHB passe<br />probablement par une action sur la boucle thalamocorticale mais les mécanismes cellulaires à leurs<br />origines sont inconnus. Nous avons montré grâce à l'utilisation d'enregistrements<br />électrophysiologiques, que les courants post-synaptiques inhibiteurs sont beaucoup moins sensibles<br />au GHB que les courants post-synaptiques excitateurs et les courants potassiques à rectification<br />entrante (GIRK). Cette différence de sensibilité serait à l'origine d'un déséquilibre de la balance<br />excitation/inhibition reçue par les neurones thalamocorticaux ce qui participerait à la genèse d'une<br />activité oscillante du potentiel membranaire de ces neurones.