Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’angioplastie coronaire est la première forme de revascularisation coronaire. Elle présente cependant 2 limites qui restreignent encore son utilisation : la thrombose et la resténose de stent. La thrombose de stent est un événement précoce associé à une mortalité élevée. Les plaquettes y jouent un rôle déterminant. Le développement de tests fonctionnels plaquettaires permettant d’analyser le niveau de réactivité plaquettaire sous traitement a permis de mettre en évidence les limites de celui-ci sur le plan biologique. Nous avons démontré l’impact clinique de l’utilisation de ces tests dans la prédiction et la réduction du risque de thrombose de stent chez des patients traités par angioplastie coronaire. La resténose est quant à elle une complication tardive de l’angioplastie coronaire avec implantation d’un stent non-actif. Sa physiopathologie repose sur des mécanismes de lésion et de régénération endothéliale. Des marqueurs endothéliaux circulants ont récemment été développés. Nous avons montré qu’ils pouvaient permettre d’évaluer la lésion et la régénération endothéliale induite par une angioplastie coronaire. Les cellules endothéliales circulantes s’élèvent transitoirement après l’angioplastie et ce de façon variable en fonction de la réactivité plaquettaire sous traitement démontrant les interactions étroites entre ces différents acteurs. Dans le même temps, on observe une mobilisation de progéniteurs d’origine médullaire suite à l’angioplastie. Nos travaux suggèrent un rôle clé de la régénération endothéliale dans la cicatrisation vasculaire après angioplastie. En effet, il apparait que la proportion de progéniteurs de profil de différenciation endothélial en réponse à l’angioplastie coronaire détermine la survenue d’une resténose intra-stent. Ces données ouvrent la voie à une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologie menant à la resténose mais aussi à des perspectives thérapeutiques intéressantes. / Percutaneous coronary intervention is the most commonly used revascularization technique. However it has 2 main complications limiting its widespread: stent thrombosis and in stent restenosis. Stent thrombosis is an early event associated with a high mortality rate. Platelets are key in its physiopathology. The availability of platelet function tests allowing to determine platelet reactivity levels under therapy showed a variable ant platelet effect following aspirin and clopidogrel intake. We further demonstrated that tailoring anti platelet therapy according to platelet function tests results decrease the rate of stent thrombosis following PCI without increasing bleedings. In stent-restenosis is a late complication of PCI with bare metal stents. The pathophysiology of in-stent restenosis is dependent on the lesion and regeneration of the endothelium. Circulating endothelial biomarkers have recently been developed. We have demonstrated that this marker allow to evaluate the lesion and regeneration of the endothelium following PCI. We evidenced a transient increase in circulating endothelial cells following PCI which is dependent on the level of platelet reactivity inhibition demonstrating the interaction between platelets and the endothelium. At the same time, PCI induces mobilization of progenitor cells which is detectable early after the intervention. Our work suggests that these progenitor cells have a key role in endothelial regeneration after PCI. We evidenced for the first time that the proportion of endothelial progenitor cells among progenitor cells mobilized after PCI determine the occurrence of in stent restenosis. Altogether these data give critical inside into vascular regeneration after PCI in human and on the mechanisms associated with in stent restenosis thus providing new potential therapeutic target.

Thèse d'exercice : Médecine. Médecine générale : Paris 12 : 2005. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. f. 81-93.

Les acides gras de la série n-3 et notamment l'acide docosahexaénoïque (DHA) jouent un rôle important dans la prévention des maladies cardiovasculaires. Un de ses métabolites, la protectine DX (PDX), qui est un isomère de la protectine D1 (PD1), inhibe l'agrégation des plaquettes sanguines. D'autres composés similaires appelés "poxytrins", qui possèdent aussi un triène conjugué avec une géométrie E,Z,E, ont également été synthétisés à partir d'autres acides gras polyinsaturés (AGPI) via la lipoxygénase de soja. Ces composés présentent des propriétés anti-agrégantes en inhibant la cyclo-oxygénase plaquettaire et le récepteur du thromboxane A2. Dans cette thèse, nous décrivons de nouveaux composés dihydroxylés synthétisés par la 15-lipoxygénase de soja à partir de l'acide alpha-linolénique (18:3n-3), un acide gras polyinsaturé indispensable consommé au niveau du gramme chez l'Homme adulte. Il est converti en acides gras monohydroxylés et dihydroxylés. Ces composés ont été séparés par HPLC en phase inverse et caractérisés par GC-MS après dérivation adéquate. Un acide gras monohydroxylé, majoritaire, l'acide 13(S)-octadécatriénoïque et quatre acides gras dihydroxylés ont été détectés. Ces derniers présentent tous un spectre UV caractéristique avec une absorption maximale à 270 nm et deux épaulements à 260 et 280 nm. Les spectres UV de deux d'entre eux sont superposables à celui de la PDX, ce qui suggère une géométrie E,Z,E des doubles liaisons de leur triène. La caractérisation complète de ces composés a été réalisée par RMN à haut champ et par GC-MS. Ce sont les acides 9(R),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12E,14E-triénoïque, 9(S),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12E,14E-triénoïque, 9(S),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12Z,14E-triénoïque et 9(R),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12Z,14E-triénoïque. Ils sont également synthétisés par la 15 lipoxygénase recombinante humaine de type 2. Ces composés dihydroxylés 9,16-diHOTEs ont été testés sur les plaquettes isolées à partir du sang humain. Nous avons observé que seules les molécules ayant la géométrie E,Z,E du triène conjugué inhibent l'agrégation plaquettaire induite par le collagène et inhibent la cyclooxygénase-1 (COX-1) de mouton. Les propriétés anti-inflammatoires de ces produits ont également été étudiés. Tous les isomères 9,16-diHOTEs, possédant un triène conjugué avec une géométrie E,Z,E, inhibent la COX-2 recombinante humaine et seul l'acide 9(R),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12Z,14E-triénoïques inhibe la 5-lipoxygénase des leucocytes, siège de la synthèse des leucotriènes issus de l'acide arachidonique. En conclusion, les composés dihydroxlés possédant un triène conjugué E,Z,E, issus du 18:3n-3, ainsi que la PDX, inhibent l'activité des COX-1 et 2, et seraient anti-agrégants et anti-inflammatoires. Ces résultats donnent des perspectives pharmacologiques aux recommandations nutritionnelles promouvant la consommation d'acide alpha linolénique.

Introduction : L’effet biologique variable de l’aspirine a été attribué à un état de résistance pharmacologique. L’incidence de cette « résistance » varie selon la population ou la technologie étudiée. Méthodes : Nous avons déterminé la performance de 5 techniques évaluant l’effet de l’aspirine chez des sujets sains, non fumeurs et ne prenant aucune médication pouvant interférer avec la fonction plaquettaire. Des spécimens de sang et d’urine ont été obtenus avant et après 8-10 jours de prise de 80 mg d’aspirine. Résultats: Chez 45 sujets de 19-59 ans, la sensibilité (SE), la spécificité (SP), et la valeur optimale de coupure (CO) pour détecter l’effet de l’aspirine sont : agrégométrie par transmission optique induite avec 1,6 mM d’acide arachidonique (ATO-AA) - SE 100%, SP 95,9%, CO 20%; ATO-ADP 10 μM - SE 84,4%, SP 77,7%, CO 70%; VerifyNow® Aspirin - SE 100%, SP 95,6%, CO 550 ARU; agrégation en tube - SE 82,2%, SP 86,7%, CO 55%; TEG® - SE 82,9%, SP 75,8%, CO 90%; et le dosage de 11-dehydrothromboxane B2 urinaire - SE 62,2%, SP 82,2%, CO 60 pg/ml. Conclusions: La résistance à l’aspirine chez les sujets sains définie par ATO-AA et VerifyNow® Aspirin est rare. Puisque les autres techniques étudiées discriminent de façon sous optimale l’effet de l’aspirine, leur utilité dans la définition de la résistance pharmacologique à l’aspirine semble marginale. Ces résultats suggèrent qu’une proportion de la variabilité de l’incidence rapportée de “résistance à l’aspirine” est artefactuelle et reliée aux limitations technologiques de certaines analyses. / Background: Variable biological effect of aspirin is suggested to be related to pharmacological resistance. The incidence of this so-called “resistant” state varies with the study population and the assay used. Methods: We determined performance features of five assays used to assess aspirin effects in non smoking healthy volunteers not taking any drug known to interfere with platelet function. Blood and urine samples were obtained immediately before and after 8-10 days of aspirin 80 mg intake. Results: Forty-five participants 19-59 years old were enrolled. The sensitivity (SE), specificity (SP), and optimal cut-off (CO) value to detect the effect of aspirin were: light transmission aggregometry (LTA) with 1.6 mM arachidonic acid - SE 100%, SP 95.9%, CO 20%; LTA with ADP 10 μM - SE 84.4%, SP 77.7%, CO 70%; VerifyNow® Aspirin - SE 100%, SP 95.6%, CO 550 ARU; platelet count drop - SE 82.2%, SP 86.7%, CO 55%; TEG® - SE 82.9%, SP 75.8%, CO 90%; and urinary 11-dehydrothromboxane B2 levels - SE 62.2%, SP 82.2%, CO 60 pg/ml. Conclusions: Aspirin resistance in normal individuals as defined by arachidonic acid-induced LTA and the VerifyNow® assay is rare. Because the other assays discriminate suboptimally aspirin effect, they should not be used to define pharmacological “aspirin resistance”. These results suggest that a proportion of the variability in the reported incidence of aspirin resistance is artefactual and related to technical limitations of some assays.

La manipulation de micro et nanoparticules magnétiques et leurs applications dans les domaines de la biologie, la biodétection et du diagnostic a continuellement gagné en intérêt ces dernières années. Ce travail de thèse explore l'utilisation des propriétés magnétiques des particules en suivant deux axes distincts.Dans un premier axe, nous avons utilisé des particules magnétiques dans une analyse par biocode barre pour la capture et la concentration de cibles biologiques. La détection a été effectuée à l'aide d'un nouveau biocapteur à onde évanescente. Le but était de pouvoir procéder à un génotypage plaquettaire sans utiliser la " Polymérase Chain Reaction " (PCR), en collaboration avec l'Etablissement Français du Sang Rhône-Alpes. Nous nous sommes servis du système biallélique HPA-1 comme preuve de concept, en utilisant des cibles de type oligonucléotide synthétique pour valider nos protocoles d'analyse. Nous avons réussi à détecter une concentration de 2 fmol/l de cibles non marquées. Notre test permet de discriminer les deux allèles du gène HPA-1, qui ne diffèrent que d'un nucléotide. Notre approche par biocode barre permet d'abaisser le seuil inférieur de détection de notre biocapteur d'un facteur 125 000. Nous avons pu détecter 6.105 copies de cible synthétique, sans passer par une amplification PCR. La prochaine étape consistera à adapter le test pour analyser des échantillons biologiques réels.Dans un deuxième axe, nous avons exploré l'assemblage de particules magnétiques sous champ magnétique, de manière à fabriquer des filaments permanents ancrés sur une surface et orientables. Les filaments ont pu être greffés sur des supports homogènes de verre, d'or et sur des supports mixte verre/or fonctionnalisés de manière orthogonale. Les filaments ont pu être localisés dans des zones précises du support, soit en employant des pointes concentrant le champ magnétique localement (spots de 500 µm), soit en jouant sur la fonctionnalisation sélective sur support mixte (carrés d'or de 1 mm de côté). Typiquement l'assemblage de particules de 200 nm de diamètre a permis d'obtenir des filaments de 5 µm de longueur pour 200 à 400 nm de largeur. Les conditions de formation des filaments restent toutefois à améliorer.Les filaments magnétiques permanents ont été employés pour deux applications. Tout d'abord nous avons employé les filaments magnétiques orientables pour valider un banc d'imagerie polarimétrique par résonance de plasmon de surface (P-SPRI) développé par le LCFIO (Palaiseau). Les premières mesures tendent à montrer que l'anisotropie des filaments peut être détectée par le banc de P-SPRI, il est toutefois nécessaire de poursuivre les travaux pour mieux valider ces résultats. Deuxièmement nous avons employé des filaments magnétiques biofonctionnalisés avec des oligonucléotides sondes, pour procéder à un génotypage plaquettaire. Dans des conditions de mesure non optimisées, l'hybridation d'oligonucléotides cibles fluorescents sur les filaments ancrés sur support permet de multiplier par trois le signal de fluorescence par rapport à une hybridation sur surface plane, grâce à une augmentation de la surface spécifique du support.

Les plaquettes sanguines sont des cellules qui ont un rôle majeur au cours des processus de l'hémostase primaire et jouent un rôle primordial dans l'immunité innée mais aussi adaptative. Ces cellules anucléées ont une capacité sécrétoire très importante de facteurs solubles notamment de cytokines, de chimiokines (CK/CH) et de facteurs immunomodulateurs. L'émergence du rôle inflammatoire des plaquettes sanguines dans la communauté scientifique a soulevé de nombreuses questions auxquelles nous essayons de répondre dans ce manuscrit. La majorité de ces questions repose sur la capacité de ces cellules anucléées à répondre de manière régulée à des stimuli complexes. Nos investigations pour répondre à ces questions ont été réalisées dans un contexte transfusion sanguine. Au cours de nos travaux, nous avons mis en évidence la corrélation des profils de sécrétion plaquettaire avec les récepteurs membranaires et les voies de signalisations intraplaquettaires engagées. Les plaquettes expriment plusieurs récepteurs immunitaires sur leur surface notamment les " Pattern recognition receptors " (PRR) et des récepteurs aux CK/CH. Nous avons démontré et caractérisé la fonction d'un nouveau récepteur plaquettaire, le Siglec-7. Ce récepteur est localisé dans les granules a ; son expression sur la membrane est corrélée avec l'état d'activation plaquettaire. Le Siglec-7 a une avidité élevée avec les molécules composées d'α2,8-disialyl (NeuAcα2,8NeuAcα2,3Gal) et de α2,6-sialyl (Gal-b1,3[NeuAcα2,6]HexNAc) (comme les gangliosides GD2, GD3 et GT1b). L'engagement de ce récepteur peut induire l'apoptose plaquettaire par la voie intrinsèque et extramitochondriale. Ce processus nécessite l'engagement du récepteur GPIIbIIIa et P2Y1 et la signalisation de la voie de PI3k. Nous avons également étudié et mis en évidence une composante inflammatoire multifactorielle dans les effets indésirables des receveurs (EIR) et trouvé dans les concentrés plaquettaires (CP), plusieurs facteurs solubles ayant une valeur prédictive élevée pour la survenue des EIR, notamment le sCD40L et l'IL-13. Nous avons confirmé que la concentration de ces facteurs augmente au cours de temps de stockage des CP, étant, en partie, responsable du taux élevé de l'EIR des CP âgés. Enfin, en plus de la conservation, les processus de préparation des CP peuvent aussi avoir des impacts sur les propriétés inflammatoires des plaquettes. Ces travaux montrent que la réponse inflammatoire plaquettaire est régulée en fonction du stimulus, permettant d'argumenter sur le rôle présumé de sentinelle des plaquettes sanguines humaines. Ainsi, mes travaux s'inscrivent dans la ré-exploration de la fonction inflammatoire des plaquettes sanguines et l'étude du rôle des plaquettes comme cellules de l'immunité à composante inflammatoire

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L’athérosclérose est une pathologie artérielle chronique évoluant sur plusieurs années ou dizaines d’années. Sa traduction clinique est variable, pouvant rester longtemps asymptomatique, ou induire des symptômes d’effort directement lié à la réduction du calibre de l’artère (angor, claudication des membres inférieurs). Malgré cette évolution en apparence lente et progressive, les manifestations cliniques aiguës de cette pathologie sont souvent de survenue brutale. La formation de thrombus en regard des lésions athéromateuses dites déstabilisées représente la composante physiopathologique la plus fréquemment rencontrée. Cette complication aigüe de la plaque athéromateuse est responsable d’événements cardio-vasculaires majeurs impactant la morbi-mortalité, représentés par les syndromes coronariens aigus, les accidents vasculaires cérébraux ischémiques, et les ischémies aigues de membre inférieur. Après une revue des connaissances actuelles sur la plaque athéromateuse, nous étudierons à l’aide d’un modèle animal d’athérosclérose, son évolution, ses caractéristiques morphologiques, et nous testerons l’impact d’un traitement au long cours par statine en prévention primaire sur les plaques athéromateuses et sur les composants de la paroi vasculaire. Puis, dans une approche clinique, nous nous intéresserons à la durée optimale du traitement par double antiagrégant plaquettaire instauré après un traitement par angioplastie percutanée de plaque athéromateuse. Dans un second temps, nous détaillerons l’évolution des pratiques d’angioplastie coronaire en analysant les facteurs ayant contribué à limiter l’utilisation des stents non actifs (dit nus) au cours des 10 dernières années. Enfin, nous étudierons les principaux facteurs restant associés à la survenue d’un accident vasculaire cérébral post angioplastie percutanée, correspondant à l’une des principales complications majeures de ces procédures. / Atherosclerosis is a chronic arterial disease that progresses over several years or decades. Its clinical translation is variable, and may remain asymptomatic for a long time, or induce symptoms of stress directly related to the reduction in size of the artery (angina, chronic limb ischemia). Despite this seemingly slow and progressive evolution, the acute clinical manifestations of this pathology often occur suddenly. Thrombus formation in regard to the “destabilized” atheromatous lesions is the most frequently physiopathological components. This acute complication of atheromatous plaque is responsible of major cardiovascular events impacting the morbi-mortality, mostly represented by acute coronary syndromes, ischemic strokes, and acute lower limb ischemia. After a review of current knowledge on atheromatous plaque, we will study using an animal model of atherosclerosis, its evolution, its morphological characteristics, and we will test the impact of a long-term statin treatment in primary prevention on atheromatous plaques and on vascular wall components. Then, in a clinical approach, we will look at the optimal duration of double platelet antiaggregant after angioplasty. In a second step, we will detail the evolution of coronary angioplasty practices by analyzing the main factors that have contributed to limiting the use of bare metal stent over the past 10 years. Finally, we will analyze the major factors still associated with the occurrence of a stroke after percutaneous angioplasty.

Cette thèse porte sur l’élaboration d’un outil de capture d’ADN permettant d’identifier une mutation génétique (SNP) grâce à la formation de sandwichs avec des particules de carboxylatex biofonctionnalisées avec des oligonucléotides couplée à une détection de la fluorescence. Le modèle biologique choisi pour ce projet est le génotypage plaquettaire et plus particulièrement la recherche du gène biallélique HPA-1. Le principal objectif de ce travail a été d’optimiser un outil de capture préalablement développé dans l’équipe (Trévisan, 2011) afin de réduire le nombre d’étapes et de simplifier la mise en oeuvre globale du test en modifiant les interactions moléculaires utilisée pour capturer l’ADN cible et en utilisant des particules fluorescentes comme élément de détection. En présence d’ADN cible, des sandwichs sont formés entre les particules fluorescentes et les particules magnétiques biofonctionnalisées. Ces sandwichs sont purifiés par séparation magnétique et la fluorescence est détectée par trois méthodes : la cytométrie en flux, l’imagerie de fluorescence et l’Evareader (détection par ondes évanescentes). Dans un premier temps, les paramètres de fonctionnalisation chimique et biologique des différentes particules (magnétiques et fluorescentes) ont été déterminés et optimisés ainsi que les conditions d’hybridation pour la capture de l’ADN cible. Ensuite, la formation des sandwichs et leur détection ont été suivies par des mesures de fluorescence en utilisant trois méthodes différentes : la cytométrie en flux, l’imagerie de fluorescence et l’Evareader (capteur à ondes évanescentes). Les résultats obtenus avec les différentes méthodes de détection sont concordants et montrent que l’outil de capture d’ADN développé permet de capturer la cible synthétique (oligonucléotide) HPA-1 en réduisant le temps d’analyse de 45 min. Dans nos conditions, le test permet de discriminer l’allèle a de l’allèle b du gène HPA-1 qui ne diffère que d’un nucléotide. Le rapport des signaux de fluorescence issus du sandwich spécifique et du sandwich non spécifique est d’environ 2,5 à 3. Ce rapport devra être amélioré par la suite, en optimisant les conditions de formation des sandwichs. La prochaine étape consistera à optimiser le système de capture d’ADN développé pour gagner en spécificité et déterminer la limite de détection du test. Ce test devra également être validé avec des échantillons biologiques. A plus long terme, la fluorescence pourra être détectée par un photodétecteur miniaturisé actuellement développé à l’Université de Sherbrooke. Des études préliminaires présentées dans ce manuscrit montrent les potentialités de ce nouveau transducteur. / This thesis is about the development of a new assay to capture DNA. This assay is based on the formation of sandwiches between biofunctionnalized with oligonucleotides carboxylatex microparticles combined with fluorescence detection. It should be able to discriminate single nucleotide polymorphism (SNP). This assay is designed to be applied to platelet genotyping for the research of the gene HPA-1. The main goal of this work was to improve an assay previously developed (Trévisan, 2011) by INL and EFS Rhône-Alpes. The objectives are to reduce the number of steps and to simplify the test. To do so, the molecular interactions used in order to capture target DNA are modified and fluorescent microparticles are used for the detection. In the presence of target DNA, sandwiches are formed between both biofunctionnalized fluorescent and magnetic particles. Those sandwiches are purified through magnetic separation. Then, fluorescence is detected by three methods: flow cytometry, fluorescence imaging and Evareader (detection with an evanescent wave). First, chemical and biological parameters for the functionalization of the different particles (magnetic and fluorescent) are determined. The conditions for the capture of target DNA were optimized. Then, the formation and the detection of the sandwiches were estimated by measuring the fluorescence using three different methods: flow cytometry, fluorescence imaging and Evareader. The results obtained with the three methods are consistent. They show that the new system enables to capture synthetic target (oligonucleotide) HPA-1 with a reduction of total time analysis of 45 min. In our conditions, SNP can be discriminated for HPA-1 gene. For this discrimination, the fluorescence signal ratio about 2.5 to 3. This ratio should be improved by optimizing the conditions of sandwiches formation. Next step will consist in the optimization of the system developed to capture DNA in order to gain specificity and to determine the limit of detection. This test should also be validated with biological samples. In the long term, fluorescence could be detected by a miniaturized photodetector developed in the University of Sherbrook. Preliminary studies presented in this manuscript show the potentialities of this new transducer.