As células T CD4+ do baço são importantes na proteção frente à malária através de mecanismos mediados pelas citocinas do perfil Th1. Neste trabalho observamos o aumento das células NK1.1+TCR<font face=\"Symbol\">a<font face=\"Symbol\">b por baço nos camundongos C57BL/6, que apresentam o fenótipo de células ativadas, produzem IFN-<font face=\"Symbol\">g, expressam de níveis altos de Fas e PD-L1 que correlaciona com a baixa capacidade proliferativa na fase aguda da infecção pelo Plasmodium chabaudi AS. As células T CD4+ convencionais são a principal subpopulação de células T ativadas na resposta imune frente à infecção, que se desenvolve em duas fases consecutivas concomitantemente com as parasitemias aguda e crônica. Na fase aguda da infecção, a resposta das células T CD4+ convencionais é intensa e de curta duração, com produção grandes quantidades citocinas com cinética semelhante às células T CD4+ não-convencionais. Dessa maneira, as células T CD4+ convencionais possuem um papel central no início da resposta ao P. chabaudi, respondendo em paralelo com as células T não-convencionais como uma ponte entre a imunidade inata e adquirida. / Spleen CD4+ T cells have an important role for protection against malaria through mechanisms mediated by Th1 cytokines. We observed that the increase in NK1.1+TCR<font face=\"Symbol\">a<font face=\"Symbol\">b cell numbers per spleen in C57BL/6 mice, show an activated cell phenotype, with high expression of Fas and PD-L1 correlating with their low proliferative capacity and produce IFN-<font face=\"Symbol\">g during the acute P. chabaudi infection. We show that conventional CD4+ T cells are the main activated T cells subpopulation in the immune response to infection, which develops in two consecutive phases concomitantly with acute and chronic parasitemias. In the acute phase, the conventional CD4+ T cell response is intense and short-lasting, rapidly providing proinflammatory. Taken together, these results indicated the central role of conventional CD4+ T cells during P. chabaudi malaria, acting in parallel with non-conventional CD4+ T cells as a link between innate and acquired immunity.

As células T CD4+ do baço são importantes na proteção frente à malária através de mecanismos mediados pelas citocinas do perfil Th1. Neste trabalho observamos o aumento das células NK1.1+TCR<font face=\"Symbol\">a<font face=\"Symbol\">b por baço nos camundongos C57BL/6, que apresentam o fenótipo de células ativadas, produzem IFN-<font face=\"Symbol\">g, expressam de níveis altos de Fas e PD-L1 que correlaciona com a baixa capacidade proliferativa na fase aguda da infecção pelo Plasmodium chabaudi AS. As células T CD4+ convencionais são a principal subpopulação de células T ativadas na resposta imune frente à infecção, que se desenvolve em duas fases consecutivas concomitantemente com as parasitemias aguda e crônica. Na fase aguda da infecção, a resposta das células T CD4+ convencionais é intensa e de curta duração, com produção grandes quantidades citocinas com cinética semelhante às células T CD4+ não-convencionais. Dessa maneira, as células T CD4+ convencionais possuem um papel central no início da resposta ao P. chabaudi, respondendo em paralelo com as células T não-convencionais como uma ponte entre a imunidade inata e adquirida. / Spleen CD4+ T cells have an important role for protection against malaria through mechanisms mediated by Th1 cytokines. We observed that the increase in NK1.1+TCR<font face=\"Symbol\">a<font face=\"Symbol\">b cell numbers per spleen in C57BL/6 mice, show an activated cell phenotype, with high expression of Fas and PD-L1 correlating with their low proliferative capacity and produce IFN-<font face=\"Symbol\">g during the acute P. chabaudi infection. We show that conventional CD4+ T cells are the main activated T cells subpopulation in the immune response to infection, which develops in two consecutive phases concomitantly with acute and chronic parasitemias. In the acute phase, the conventional CD4+ T cell response is intense and short-lasting, rapidly providing proinflammatory. Taken together, these results indicated the central role of conventional CD4+ T cells during P. chabaudi malaria, acting in parallel with non-conventional CD4+ T cells as a link between innate and acquired immunity.

O Antígeno-1 de Membrana Apical (AMA-1) de merozoítas de Plasmodium é um dos principais candidatos a compor uma vacina contra a malária. A função biológica de AMA-1 não é totalmente conhecida, entretanto, existem evidências que sugerem a participação dessa proteína na ligação a eritrócitos de diferentes espécies de Plasmodium. O objetivo deste estudo foi investigar a participação de AMA-1 de P. vivax (PvAMA-1) na ligação a eritrócitos humanos utilizando células COS-7 transfectadas com plasmídios recombinantes codificando diferentes regiões do ectodomínio de PvAMA-1. Para isso, os genes que codificam os domínios I-II ou III de PvAMA-1 foram inseridos no vetor pDisplay-EGFP, que permite a expressão das proteínas recombinantes em fusão com a porção N-terminal da Proteína Fluorescente Verde (GFP). Em paralelo, utilizamos construções contendo os genes que codificam a região C-terminal de 19 kDa da Proteína 1 de Superfície do Merozoíta (PvMSP119) e a região II da Duffy Binding Protein (PvDBP-RII). As quatro construções foram utilizadas para transfectar células COS-7 na presença de lipofectamina. A eficiência das transfecções transientes foi confirmada por imunofluorescência utilizando anticorpos específicos. Em seguida, estudamos a participação dos diferentes domínios de PvAMA-1 na ligação aos eritrócitos. Nossos resultados mostraram que os domínios contíguos I-II, ao contrário do domínio III, foram capazes de se ligar a eritrócitos in vitro. Essa ligação foi específica, pois soros de indivíduos infectados por P. vivax e soros policlonais de camundongos contendo anticorpos anti-PvAMA-1 foram capazes de inibir essa ligação em 82,0% e 79,8%, respectivamente. Além disso, anticorpos monoclonais dirigidos contra o domínio II dessa proteína foram capazes de inibir parcialmente essa ligação. Após o tratamento de eritrócitos com tripsina ou quimiotripsina, estas células perderam grande parte de sua capacidade de ligação, sugerindo que o receptor para PvAMA-1 tenha constituição predominantemente protéica. Em conjunto, nossos resultados podem servir de base para futuros estudos visando um melhor entendimento da função de anticorpos gerados durante a infecção natural ou induzidos após vacinação com PvAMA-1. / The Apical Membrane Antigen (AMA-1) of Plasmodium merozoites is one of the main candidates to be part of a vaccine against malaria. The biological function of AMA-1 is unknown. However, there are evidences that suggest the participation of this protein in the interaction with erythrocytes (RBC) of different Plasmodium species. Using transfected COS-7 cells with recombinant plasmids encoding different portions of the PvAMA-1 ectodomain, our aim was to identify possible domains of PvAMA-1 able to interact with human RBC. The genes that encoded domains I and II in combination or domain III of PvAMA-1 were cloned into the pDisplay-EGFP vector. This vector allows expression of the protein fused to the N-terminus of enhanced green fluorescent protein (GFP). In parallel, we also used constructions containing the genes that encoded the 19 kDa C-terminal region of Merozoite Surface Protein 1 (PvMSP119) and region II of the Duffy Binding Protein (PvDBP-RII). Constructions were used to transiently transfect COS-7 cells. The efficiency of expression of all constructs was confirmed by immunofluorescence assay using specific antibodies. After that, we studied the participation of the different domains of PvAMA-1 in the binding to human RBC. We found that COS-7 cells expressing domains I-II, but not domain III, bound to human RBC in vitro. This binding was specific, because sera from malaria-infected patients and mouse polyclonal sera containing antibodies to PvAMA-1 were able to block the adhesion by 82.0% and 79.8%, respectively. Moreover, monoclonal antibodies directed against domain II were partially inhibitory in the cytoadherence assays. The receptor recognized on the surface of COS-7 cells expressing the domains I and II was partially removed after human RBC were treated with trypsin or chymotrypsin, suggesting that its composition is predominantly protein. In conclusion, our results can be used as basis for future studies aimed at better understating the function of the antibodies generated during the natural infection or after vaccination with PVAMA-1.

O Antígeno-1 de Membrana Apical (AMA-1) de merozoítas de Plasmodium é um dos principais candidatos a compor uma vacina contra a malária. A função biológica de AMA-1 não é totalmente conhecida, entretanto, existem evidências que sugerem a participação dessa proteína na ligação a eritrócitos de diferentes espécies de Plasmodium. O objetivo deste estudo foi investigar a participação de AMA-1 de P. vivax (PvAMA-1) na ligação a eritrócitos humanos utilizando células COS-7 transfectadas com plasmídios recombinantes codificando diferentes regiões do ectodomínio de PvAMA-1. Para isso, os genes que codificam os domínios I-II ou III de PvAMA-1 foram inseridos no vetor pDisplay-EGFP, que permite a expressão das proteínas recombinantes em fusão com a porção N-terminal da Proteína Fluorescente Verde (GFP). Em paralelo, utilizamos construções contendo os genes que codificam a região C-terminal de 19 kDa da Proteína 1 de Superfície do Merozoíta (PvMSP119) e a região II da Duffy Binding Protein (PvDBP-RII). As quatro construções foram utilizadas para transfectar células COS-7 na presença de lipofectamina. A eficiência das transfecções transientes foi confirmada por imunofluorescência utilizando anticorpos específicos. Em seguida, estudamos a participação dos diferentes domínios de PvAMA-1 na ligação aos eritrócitos. Nossos resultados mostraram que os domínios contíguos I-II, ao contrário do domínio III, foram capazes de se ligar a eritrócitos in vitro. Essa ligação foi específica, pois soros de indivíduos infectados por P. vivax e soros policlonais de camundongos contendo anticorpos anti-PvAMA-1 foram capazes de inibir essa ligação em 82,0% e 79,8%, respectivamente. Além disso, anticorpos monoclonais dirigidos contra o domínio II dessa proteína foram capazes de inibir parcialmente essa ligação. Após o tratamento de eritrócitos com tripsina ou quimiotripsina, estas células perderam grande parte de sua capacidade de ligação, sugerindo que o receptor para PvAMA-1 tenha constituição predominantemente protéica. Em conjunto, nossos resultados podem servir de base para futuros estudos visando um melhor entendimento da função de anticorpos gerados durante a infecção natural ou induzidos após vacinação com PvAMA-1. / The Apical Membrane Antigen (AMA-1) of Plasmodium merozoites is one of the main candidates to be part of a vaccine against malaria. The biological function of AMA-1 is unknown. However, there are evidences that suggest the participation of this protein in the interaction with erythrocytes (RBC) of different Plasmodium species. Using transfected COS-7 cells with recombinant plasmids encoding different portions of the PvAMA-1 ectodomain, our aim was to identify possible domains of PvAMA-1 able to interact with human RBC. The genes that encoded domains I and II in combination or domain III of PvAMA-1 were cloned into the pDisplay-EGFP vector. This vector allows expression of the protein fused to the N-terminus of enhanced green fluorescent protein (GFP). In parallel, we also used constructions containing the genes that encoded the 19 kDa C-terminal region of Merozoite Surface Protein 1 (PvMSP119) and region II of the Duffy Binding Protein (PvDBP-RII). Constructions were used to transiently transfect COS-7 cells. The efficiency of expression of all constructs was confirmed by immunofluorescence assay using specific antibodies. After that, we studied the participation of the different domains of PvAMA-1 in the binding to human RBC. We found that COS-7 cells expressing domains I-II, but not domain III, bound to human RBC in vitro. This binding was specific, because sera from malaria-infected patients and mouse polyclonal sera containing antibodies to PvAMA-1 were able to block the adhesion by 82.0% and 79.8%, respectively. Moreover, monoclonal antibodies directed against domain II were partially inhibitory in the cytoadherence assays. The receptor recognized on the surface of COS-7 cells expressing the domains I and II was partially removed after human RBC were treated with trypsin or chymotrypsin, suggesting that its composition is predominantly protein. In conclusion, our results can be used as basis for future studies aimed at better understating the function of the antibodies generated during the natural infection or after vaccination with PVAMA-1.

Diversas proteínas de superfície de merozoítas (MSPs) de Plasmodium têm sido consideradas candidatas a compor uma vacina contra a malária. Nos últimos anos estudamos diversos aspectos da resposta imune naturalmente adquirida contra proteínas recombinantes baseadas nas MSPs de P. vivax. Estes estudos demonstraram que estas proteínas recombinantes mantêm suas funções imunológicas, podendo servir como base para a caracterização de suas estruturas tridimensionais. Com o objetivo de obter informações estruturais sobre as MSPs de P. vivax, 10 proteínas recombinantes, correspondentes à região C-terminal da MSP-1 (MSP119), e diferentes regiões da MSP-3&#945; e MSP-3&#946; foram expressas em Escherichia coli. Os dados estruturais da MSP119 foram obtidos por modelagem molecular com base nas coordenadas cristalográficas da MSP19 de P. cynomolgi. Por outro lado, existem poucas informações estruturais sobre as proteínas da família MSP-3 de Plasmodium. A análise da estrutura primária dessas proteínas indica que elas apresentam um domínio central rico em alaninas que estão organizadas como motivos \"heptads\". Esse tipo de estrutura primária favorece a formação de estruturas do tipo &#945;-hélices e \"coiled-coil\" (CC). No presente estudo, a composição da estrutura secundária de cada proteína recombinante foi caracterizada preliminarmente por ensaio de Dicroísmo Circular, realizado na região do UV distante. Com base nos resultados obtidos, selecionamos duas proteínas recombinantes baseadas na região C-terminal da MSP-3&#945; (CC4 e CC5) para análises biofísicas mais detalhadas. Inicialmente, demonstramos por espectrometria de massa que ambas as proteínas têm massa molecular esperada. Entretanto, os dados obtidos por cromatografia em gel filtração sugeriram que essas proteínas formam oligômeros. No caso específico da proteína CC5, estes dados foram confirmados por ultracentrifugação analítica que indicou a formação de tetrâmeros elongados, corroborando com a formação de estrutura do tipo \"coiled-coil\". Como o papel biológico dessas proteínas não é conhecido, os dados estruturais obtidos neste estudo podem servir como base para o entendimento da função dessas proteínas. Na segunda parte deste projeto, selecionamos cinco proteínas recombinantes para estudos comparativos de reconhecimento por anticorpos IgG de indivíduos procedentes de áreas endêmicas de malária vivax. Tais estudos confirmaram dados prévios que as MSPs são imunogênicas em infecções naturais. Em conjunto, nossos resultados sugerem que, assim como a MSP119, proteínas recombinantes baseadas na MSP-3a e MSP-313 podem ser exploradas em futuros estudos de indução de imunidade protetora contra a malária vivax em primatas não humanos. / Several merozoite surface proteins (MSPs) of Plasmodium have been considered candidates to compose a vaccine against malaria. In the last years, we have studied severaI aspects of the natural/y acquired immune response against recombinant proteins based on MSPs of P. vivax. These studies demonstrated that the recombinant proteins maintain their immunological functions and could be used for the characterization of their three-dimensional structure. To gain structural information on the MSPs of P. vivax, 10 recombinant proteins corresponding to the C-terminal region of MSP-1 (MSP119) and to different regions of the MSP-3&#945; and MSP-3&#946; were expressed in Escherichia coli. The structural data of the MSP119 were obtained by molecular modeling based on the crystallographic coordinates of the P. cynomolgi MSP119. On the other hand, there is limited structural information available for MSP-3 family of Plasmodium. The analysis of the primary structure of these proteins indicates that they present a central alanine-rich domain organized as heptads repeats. This type of primary structure favors the formation of &#945;-helices and coiled-coil (CC) structures. In the present study, the composition of the secondary structure of each recombinant protein was characterized preliminarily by circular dichroism monitored in the far-UV region. On the basis of the obtained results, we selected two recombinant proteins based on C-terminal region of the MSP-3&#945; (CC4 and CC5) for detailed biophysical analyses. Initially, we demonstrated that the monomer mass assigned for the two recombinant proteins corresponded exactly to those predicted from the primary sequence. However, during size exclusion chromatography, the proteins eluted at volumes corresponding to molecular weights that were much larger than their monomeric masses, suggesting that both proteins are oligomeric molecules. Interestingly, analytical ultracentrifugation experiments showed that the CC5 oligomers are elongated molecules. As the function of these proteins is not known, the structural data obtained in this study can be used to understand the function of these proteins. In the second part of this study, we selected five recombinant proteins for comparative recognition by IgG antibodies of the individuais from endemic areas of malaria vivax. These studies confirmed previous data that the MSPs are imunogenic in natural infections. Together, our results suggest that, as well as the MSP119, that recombinant proteins based on the MSP-3&#945; and MSP-3&#946; can be explored in future studies for the induction of protective immunity against malaria vivax.

Diversas proteínas de superfície de merozoítas (MSPs) de Plasmodium têm sido consideradas candidatas a compor uma vacina contra a malária. Nos últimos anos estudamos diversos aspectos da resposta imune naturalmente adquirida contra proteínas recombinantes baseadas nas MSPs de P. vivax. Estes estudos demonstraram que estas proteínas recombinantes mantêm suas funções imunológicas, podendo servir como base para a caracterização de suas estruturas tridimensionais. Com o objetivo de obter informações estruturais sobre as MSPs de P. vivax, 10 proteínas recombinantes, correspondentes à região C-terminal da MSP-1 (MSP119), e diferentes regiões da MSP-3&#945; e MSP-3&#946; foram expressas em Escherichia coli. Os dados estruturais da MSP119 foram obtidos por modelagem molecular com base nas coordenadas cristalográficas da MSP19 de P. cynomolgi. Por outro lado, existem poucas informações estruturais sobre as proteínas da família MSP-3 de Plasmodium. A análise da estrutura primária dessas proteínas indica que elas apresentam um domínio central rico em alaninas que estão organizadas como motivos \"heptads\". Esse tipo de estrutura primária favorece a formação de estruturas do tipo &#945;-hélices e \"coiled-coil\" (CC). No presente estudo, a composição da estrutura secundária de cada proteína recombinante foi caracterizada preliminarmente por ensaio de Dicroísmo Circular, realizado na região do UV distante. Com base nos resultados obtidos, selecionamos duas proteínas recombinantes baseadas na região C-terminal da MSP-3&#945; (CC4 e CC5) para análises biofísicas mais detalhadas. Inicialmente, demonstramos por espectrometria de massa que ambas as proteínas têm massa molecular esperada. Entretanto, os dados obtidos por cromatografia em gel filtração sugeriram que essas proteínas formam oligômeros. No caso específico da proteína CC5, estes dados foram confirmados por ultracentrifugação analítica que indicou a formação de tetrâmeros elongados, corroborando com a formação de estrutura do tipo \"coiled-coil\". Como o papel biológico dessas proteínas não é conhecido, os dados estruturais obtidos neste estudo podem servir como base para o entendimento da função dessas proteínas. Na segunda parte deste projeto, selecionamos cinco proteínas recombinantes para estudos comparativos de reconhecimento por anticorpos IgG de indivíduos procedentes de áreas endêmicas de malária vivax. Tais estudos confirmaram dados prévios que as MSPs são imunogênicas em infecções naturais. Em conjunto, nossos resultados sugerem que, assim como a MSP119, proteínas recombinantes baseadas na MSP-3a e MSP-313 podem ser exploradas em futuros estudos de indução de imunidade protetora contra a malária vivax em primatas não humanos. / Several merozoite surface proteins (MSPs) of Plasmodium have been considered candidates to compose a vaccine against malaria. In the last years, we have studied severaI aspects of the natural/y acquired immune response against recombinant proteins based on MSPs of P. vivax. These studies demonstrated that the recombinant proteins maintain their immunological functions and could be used for the characterization of their three-dimensional structure. To gain structural information on the MSPs of P. vivax, 10 recombinant proteins corresponding to the C-terminal region of MSP-1 (MSP119) and to different regions of the MSP-3&#945; and MSP-3&#946; were expressed in Escherichia coli. The structural data of the MSP119 were obtained by molecular modeling based on the crystallographic coordinates of the P. cynomolgi MSP119. On the other hand, there is limited structural information available for MSP-3 family of Plasmodium. The analysis of the primary structure of these proteins indicates that they present a central alanine-rich domain organized as heptads repeats. This type of primary structure favors the formation of &#945;-helices and coiled-coil (CC) structures. In the present study, the composition of the secondary structure of each recombinant protein was characterized preliminarily by circular dichroism monitored in the far-UV region. On the basis of the obtained results, we selected two recombinant proteins based on C-terminal region of the MSP-3&#945; (CC4 and CC5) for detailed biophysical analyses. Initially, we demonstrated that the monomer mass assigned for the two recombinant proteins corresponded exactly to those predicted from the primary sequence. However, during size exclusion chromatography, the proteins eluted at volumes corresponding to molecular weights that were much larger than their monomeric masses, suggesting that both proteins are oligomeric molecules. Interestingly, analytical ultracentrifugation experiments showed that the CC5 oligomers are elongated molecules. As the function of these proteins is not known, the structural data obtained in this study can be used to understand the function of these proteins. In the second part of this study, we selected five recombinant proteins for comparative recognition by IgG antibodies of the individuais from endemic areas of malaria vivax. These studies confirmed previous data that the MSPs are imunogenic in natural infections. Together, our results suggest that, as well as the MSP119, that recombinant proteins based on the MSP-3&#945; and MSP-3&#946; can be explored in future studies for the induction of protective immunity against malaria vivax.