Los objetivos principales de esta Tesis doctoral fueron: 1) cuantificar los efectos agudos y crónicos de fármacos opiáceos (mi-, delta- y kappa-selectivos) así como los cambios inducidos durante los estados de abstinencia (procesos de tolerancia y dependencia) sobre la vía de señalización del receptor Fas (formas de expresión de Fas, proteína de acople FADD y caspasas efectoras) en cerebro de rata; 2) identificar el tipo de receptor opioide involucrado en la modulación del complejo de señalización Fas/FADD mediante la utilización de ratones deficientes en receptores opioides (mi-, delta- y kappa-KO), e investigar la posible existencia de un tono opioide endógeno regulando las proteínas de esta vía en el cerebro; 3) averiguar si la modulación del complejo Fas y/o FADD por fármacos opiáceos implica (como mecanismo molecular) la participación de MAPK ERK1/2, analizando la reversión de un efecto opioide tras inhibición selectiva de los enzimas MEK1/2, tanto "in vitro" (PD98059) en células SH-SY5Y, como "in vivo" (SL 327) en cerebro de rata; 4) cuantificar en cerebro humano "postmortem" el estatus de la vía Fas/FADD y caspasas efectoras, así como los componentes de la vía de señalización del AMPc (AC/PKA/CREB) y de las MAPK (Ras/Raf/MEK/ERK) en la corteza prefrontal de adictos a opiáceos, como modelo experimental más directo al problema de la adicción en humanos.Las diversas proteínas de estudio se cuantificaron mediante técnicas inmunológicas cuantitativas (separación electroforética seguida de Western blot) empleando anticuerpos específicos. Los principales resultados y conclusiones mayores de este trabajo de Tesis doctoral son:1. La adicción a opiáceos en cerebro de rata se asocia con incrementos en la densidad del receptor apoptótico Fas y con decrementos de la proteína FADD, transductora de la señal de muerte, sin que además se alteren las caspasas efectoras 8 y 3, lo que sugiere que los procesos de adicción a estos fármacos no están asociados con la inducción de apoptosis cerebral mediados por esta vía.2. La modulación de Fas (receptor nativo) por opiáceos depende mayormente del receptor mi-opioide, y la regulación de sus formas agregadas (trímeros relevantes en el inicio de la señalización) así como la de FADD se asocia con el receptor delta-opioide, lo que demuestra una modulación diferencial de los componentes de esta vía por el sistema opioide que podría tener repercusiones terapéuticas.3. La modulación inhibitoria de FADD por agonistas delta-opiáceos es dependiente, a través de un mecanismo indirecto, de la activación de las quinasas MAPK ERK1/2, vía de señalización que a su vez se ha relacionado con la regulación de varios mecanismos anti-apoptóticos. 4. La adicción a opiáceos en cerebro humano se asocia con una disminución en la densidad de FADD en la corteza prefrontal (efectos a corto y largo plazo) sin que se alteren las diversas formas del receptor Fas y ciertas caspasas efectoras, lo que de nuevo demuestra una probable menor actividad de esta proteína acopladora de Fas en este modelo humano de adicción a opiáceos. 5. La adicción a opiáceos en cerebro humano (efectos a largo plazo) también se asocia con una aparente normalización de los componentes de la vía de señalización del AMPc (AC I, PKA, CREB y pCREB) y con una marcada inhibición de la vía de las MAPK (formas fosforiladas de MEK y de ERK1/2), lo que sugiere la inducción de alteraciones de plasticidad neuronal en estos cerebros humanos.En su conjunto, los resultados de esta Tesis demuestran la clara participación del complejo Fas/FADD en la adicción a opiáceos, tanto en los procesos de tolerancia como de dependencia física, lo que añade un nuevo nivel de complejidad a la señalización de los receptores opioides, probablemente mediatizando efectos no-apoptóticos relacionados con fenómenos de plasticidad neuronal. / The aim of this PhD work was to investigate the interactions between opioids receptors and the signaling pathway of the Fas/FADD (Fas Associated-Death Domain) receptor, involved in the regulation of apoptosis and neuronal plasticity. The main results and conclusions are: 1) opiate addiction in rat brain is associated with a strong up-regulation of the pro-apoptotic Fas receptor and a moderate down-regulation of the anti-apoptotic Bcl-2 oncoprotein, without altering the content of caspases-8/3, suggesting that possible apoptotic signals engaged by Fas activation would be offset by decreased signal transduction through FADD and effector caspases-8/3; 2) the mi-opioid receptors appears to be associated with a tonic stimulation of monomeric Fas receptor, whereas the delta-opioid receptors tonically inhibits the basal density of trimeric Fas as well as that of FADD. This suggests posible homeostatic interactions between mi- and delta-opioid receptors in the control of Fas receptor machinery, being a major task of the delta-receptor to restrain the activation of Fas signalling; 3) the direct involvement of the two MAP kinases (sequential activation of MEK and ERK) in the in vivo regulation of FADD by the opiate; 4) opiate addiction in human brain is associated with a down-regulation of the inmunodensity of FADD in the prefrontal cortex (short-term and long-term abuse) without altering Fas receptor and effector caspases-8/3; 5) opiate addiction in human brain (long-term abuse) is associated with a normal regulation of the components of the cyclic AMP pathway components (AC I, PKA, CREB, pCREB) and with an important down-regulation of the MAPK (specially pMEK and pERK) pathway components in the prefrontal cortex, suggesting alterations in the neuronal plasticity in those human brains. In summary, the results of this PhD work demonstrated a clear participation of the complex Fas/FADD in opiate addiction, suggesting a new level of complexity in the signaling mediated through the activation of opioids receptors, probably mediating non-apoptotic effects related with neuronal plasticity.

The CHRNA5/A3/B4 genomic cluster encodes for the alpha5, alpha3 and beta4 subunits of the nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs). Human genetic studies have revealed a significant association of variants in this genomic region with nicotine dependence. However, the mechanisms through which overexpression of these three subunits may influence smoking-related behaviours is not understood. To gain insight in the possible mechanisms, we used a BAC transgenic mouse model overexpressing this cluster containing the three genes together with their transcriptional regulatory elements. We found that overexpression of the cluster: i) increases sensitivity to the pharmacological effects of nicotine; ii) modifies particular cognitive domains associated to drug addiction and hippocampal neuronal complexity and synaptic plasticity; and iii) shifts the rewarding and aversive properties of nicotine and the manifestation of nicotine-withdrawal syndrome. Our study suggests that the genomic cluster CHRNA5/A3/B4 contributes to genetic vulnerability to nicotine addiction and promotes smoking-related behaviours possibly through hippocampal plasticity changes. / El cluster genòmic CHRNA5/A3/B4 codifica per les subunitats alfa5, alfa3 i beta4 dels receptors d’acetilcolina (nAChRs). Estudis de genètica humana han revelat que variants en aquesta regió genòmica estan significativament associats a la dependencia a nicotina. Malauradament, els mecanismes pels quals la sobreexpressió d’aquestes tres subunitats influencia comportaments relacionats amb el consum de tabac no són del tot coneguts. Per tal d’entendre els possibles mecanismes, hem utilitzat un model de ratolí transgènic que sobreexpressa aquest cluster amb els tres gens i les seus elements de regulació transcripcional. Hem trobat que la sobreexpressió del cluster: i) incrementa la sensibilitat als efectes farmacològics de la nicotina; ii) modifica determinats dominis cognitius associats a l’addicció a droges i la complexitat neuronal i plasticitat sinàpica de l’hipocamp; a més a més iii) canvia les propietats de recompensa i aversió de la nicotina i la manifestació del síndrome d’abstinència. El nostre estudi suggereix que el cluster genòmic CHRNA5/A3/B4 contribueix a la vulnerabilitat genètica a l’adicció a la nicotina i promou comportaments relacionats amb el consum de tabac possiblement a través de canvis de plasticitiat a l’hipocamp.