Plyšinių jungčių (PJ) reguliacija yra svarbi esant normalioms ir patologinėms sąlygoms. Šiame darbe pirmą kartą parodome, kad trumpagrandžiai alkoholiai (pentanolis–heptanolis) stimuliuoja PJ laidumą, o ilgagrandžiai (oktanolis–dekanolis) – blokuoja. Heksanolis didina Cx36 PJ funkcinį efektyvumą ir mažina jautrumą įtampai slopindamas blokuojantį endogeninės arachidono rūgšties (AR) poveikį. Endogeninės arachido rūgšties įtaką Cx36 PJ laidumui tyrėme, panaudodami jaučio serumo albuminą (JSA), fosfolipazių slopiklį metilarachidonilfluorofosfonatą ir aktyviklį tapsigarginą. Cx36 reguliacija HeLa kultūroje buvo tokia pati pelės kasos Langerhanso salelių β ląstelėse natyviai gaminančiose Cx36. Taip pat parodėme, kad [Mg2+]i reguliuoja Cx36 ir Cx47 PJ elektrinį laidumą, keisdamas funkcinių kanalų skaičių ir jų atsidarymo tikimybę, tačiau neveikia vienetinio kanalo laidumo. Nustatėme, kad TM2 ir TM4 domenai su juose esančiais cisteinais yra svarbūs trumpagrandžių alkoholių ir izoflurano prisijungimui bei kanalų valdymui jungties įtampa, tuo tarpu TM2 domenas ir CL kilpa gali būti potencialiais struktūriniais elementais, formuojant ilgagrandžių alkoholių prisijungimo kišenę(es). / Regulation of gap junctions (GJs) is important in normal and pathological conditions. In this study we show for the first time that short carbon chain n-alkanols (SCCAs; pentanol–heptanol) stimulate intercellular communication while long carbon chain n-alkanols (LCCAs; octanol–decanol) block it. SCCAs increase junctional conductance of Cx36 GJ channels by interfering with endogenous arachidonic acid (AA) dependent inhibition, increasing the open probability and a fraction of functional channels. We also evaluated the role of endogenous AA using other activators of Cx36 GJs coupling – bovine serum albumin (BSA) and inhibitor of phospholipase A2 isoforms methyl arachidonyl fluorophosphonate (MAFP). The observed regulation of Cx36 by SCCAs and AA in HeLa cells was the same as in β cells from mouse pancreas, natively producing Cx36. Furthermore we demonstrate that junctional conductance of Cx36 and Cx47 is regulated by [Mg2+]i in a concentration-dependent way in HeLa cells. [Mg2+]i affects the channel open probability and the number of functional channels, however, it has no impact on single channel conductance. We found that cysteines in the TM2 and TM4 domains are involved in binding of SCCAs and isoflurane and in regulation of gating properties of Cx36. Also, TM2 domain and CL loop could be potential structural elements forming binding cavity/ies for LCCAs.

Plyšinių jungčių kanalai yra sudaryti iš koneksinų baltymų, kurie yra randami įvairiuose audiniuose ir dėka jų ląstelės gali keistis metabolitais bei elektriniais signalais. Plyšinių jungčių kanalai pasižymi dideliu jautrumu viduląsteliniam pH. Šiame darbe tyrėme įvairių inhibitorių poveikį homotipinių plyšinių jungčių, sudarytų iš Cx26, Cx30.2, Cx36, Cx40, Cx43, Cx45, Cx46, Cx47 ir Cx50 laidumui bei šio poveikio priklausomybę nuo viduląstelinio pH.. Plyšinių jungčių blokatoriais buvo pasirinktos kelias skirtingas farmakologines grupes atstovaujančios medžiagos: ilgagrandžiai alkoholiai (heksanolis, oktanolis, nonanolis), izofluranas, meflokvinas, flufenaminė rūgštis, karbenoksolonas ir arachidono rūgštis. Pademonstravome, kad pHi pakėlimas panaudojant NH4Cl iki ~8 didino plyšinių jungčių laidumą tarp ląstelių, turinčių Cx30.2 ar Cx45, tačiau neturėjo jokios įtakos ląstelėms su Cx26, Cx40, Cx46, Cx47 ir Cx50 ir mažino laidumą tarp ląstelių su Cx36 ar Cx43. pHi padidinimas žymiai susilpnino ilgagrandžių alkoholių, izoflurano ir meflokvino poveikį Cx45 plyšinių jungčių laidumui ir neturėjo įtakos flufenaminės rūgšties, karbenoksolono ir arachidono rūgšties poveikiui. Taip pat parodėme, kad nuo pHi priklauso oktanolio poveikio Cx45 plyšinių jungčių laidumui galingumas, t.y., pusinė blokavimo koncentracija IC50 buvo 0.1, 0.25 ir 2.68 mM atitinkamai prie pHi 6.9, 7.2 ir 8.1. Manoma, kad pH poveikis plyšinių jungčiu laidumui pasireiškia protonams jungiantis su koneksino baltymo... [toliau žr. visą tekstą] / Gap junction channels formed from connexin proteins provide a direct pathway for electrical and metabolic cell-cell communication exhibiting high sensitivity to intracellular pH. We examined pHi-dependent modulation of junctional conductance of GJs formed of Cx26, Cx30.2, Cx36, Cx40, Cx43, Cx45, Cx46, Cx47 and Cx50 by reagents representing several distinct groups of uncouplers, such as long carbon chain alkanols, arachidonic acid, carbenoxolone, isoflurane, flufenamic acid and mefloquine. We demonstrate that alkalization by NH4Cl to pH≈8 increased coupling in cells expressing Cx30.2 and Cx45, yet did not affect coupling of Cx26, Cx40, Cx46, Cx47 and Cx50 and decreased it in Cx43 and Cx36 gap junctions. Unexpectedly, cells expressing Cx45, but not other connexins, exhibited full coupling recovery after alkalization with NH4Cl under the continuous presence of alkanols, isoflurane and mefloquine. There was no coupling recovery by alkalization in the presence of arachidonic acid, carbenoxolone and flufenamic acid. In cells expressing Cx45, IC50 for octanol was 0.1, 0.25 and 2.68 mM at pHis of 6.9, 7.2 and 8.1, respectively. Histidine modification of Cx45 protein by N-bromosuccinimide proportionally reduced the coupling-promoting effect of NH4Cl as well as uncoupling effect of octanol. This suggests that long chain alkanols and some other uncouplers may act through the formation of hydrogen bonds with the as-of-yet unidentified histidine/s of the Cx45 gap junction channel protein... [to full text]

Plyšinės jungtys (PJ) yra tarpląstelinę sąveiką užtikrinantys kanalai, svarbūs ląstelių dauginimuisi, diferenciacijai, migracijai bei koordinacijai. Skirtinguose žmogaus organizmo audiniuose atrastas 21 koneksino (Cx) tipas. Tam tikros ligos yra susijusios su Cx mutacijomis. PJ kanalų savybes įtakoja jungties įtampa, viduląstelinis pH (pHi), viduląstelinė dvivalenčių katijonų koncentracija ([Ca2+]i, [Mg2+]i), fosforinimas, įvairios cheminės medžiagos. Disertacinio darbo metu pirmą kartą parodėme, kad plačiai naudojamų skirtingų grupių PJ slopiklių, tokių kaip alkanolių, forano, meflokvino, veikimas priklauso nuo pHi ir Cx tipo. Iškėlėme ir eksperimentiškai patikrinome hipotezę, kad tam tikri PJ slopikliai veikia, sudarydami vandenilinius ryšius su Cx45 baltymo histidinais. Ištyrėme Cx36, Cx40, Cx43, Cx45 ir Cx47 PJ kanalų laidumo priklausomybę nuo pHi. Nustatėme [Mg2+]i įtaką Cx43 ir Cx45 PJ kanalų laidumui bei Cx36 PJ kanalų laidumo priklausomybei nuo pHi, kas iki šiol nebuvo tirta. Cx45 ir Cx36 mutantinių baltymų tyrimai suteikė naujų žinių apie šių baltymų amino rūgštis, kurios gali būti reikšmingos PJ kanalų laidumo reguliavimui viduląsteliniu pH. / Gap junctions (GJ) are intercellular channels, which provide a direct pathway for electrical and metabolic cell-to-cell communication. GJ play an important role in cell proliferation, differentiation, migration, and coordination. The family of connexin (Cx) genes consists of 21 members in the human genome, and a variety of diseases is associated with Cx mutations. Electrical conductance (gj) of gap junctions is regulated by transjunctional voltage, intracellular pH (pHi), intracellular divalent cation concentration ([Ca2+]i and [Mg2+]i), phosphorylation and different chemical compounds. In this work we demonstrate for the first time that the potency of widely used GJ inhibitors such as alkanols, forane and mefloquine in GJ channel uncoupling is pHi- and Cx type-dependent. This type of modulation may occur through the formation of hydrogen bonds between uncouplers and histidines of Cx45 protein. We determined gj-pHi dependence of Cx36, Cx40, Cx43, Cx45 and Cx47 GJ channels, and evaluated the influence of [Mg2+]i on the conductance of Cx43 and Cx45 GJs and on the sensitivity of Cx36 GJs to pHi. The investigation of the Cx45 and Cx36 mutants provided with new knowledge on the structural elements, which may be responsible for the sensitivity of Cxs to pHi.